姜艷平，吳 煜，張 希，姜新鵬，唐麗杰，喬薪瑗，崔 文，李一經(jīng)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

犬干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)，是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1-2]。犬干擾素其本身并不是一種抗病毒物質(zhì)，它是通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白而發(fā)揮其抗病毒作用，或者干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而阻止或限制病毒感染，是目前常用的抗病毒感染和抗腫瘤的生物制品。無(wú)論是天然的還是重組的犬干擾素均具有較強(qiáng)的抗病毒能力，臨床上已經(jīng)將重組的干擾素應(yīng)用于防治狂犬病，犬細(xì)小病毒病，犬瘟熱等病毒病中[3-4]。

干擾素具有不同的分類(lèi)方法，目前常用的分類(lèi)方法是按照主要功能分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω，Ⅱ型干擾素僅包括IFN-γ；其中γ干擾素基因全長(zhǎng)為501 個(gè)核苷酸，編碼166 個(gè)氨基酸，由23 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和143 個(gè)氨基酸的成熟蛋白組成[5-7]，IFN-γ是主要的免疫調(diào)節(jié)干擾素，IFN-γ可以增加細(xì)胞表面MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、B細(xì)胞和NK 細(xì)胞之間的關(guān)系，增強(qiáng)免疫應(yīng)答能力[8]。

本試驗(yàn)利用生物學(xué)軟件對(duì)犬γ干擾素（CaIFNγ）基因進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了可分泌表達(dá)CaIFN-γ蛋白的重組乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)，并通過(guò)MTT 法和實(shí)時(shí)定量PCR 方法對(duì)重組乳酸乳球菌表達(dá)的CaIFN-γ蛋白的抗病毒活性進(jìn)行檢測(cè)，這對(duì)CaIFN-γ在抗病毒活性以及免疫增強(qiáng)方面的作用進(jìn)行深入研究奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 重組質(zhì)粒pJLA605-CaIFN-γ由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；乳酸乳球菌分泌表達(dá)型載體質(zhì)粒pAMJ399、乳酸乳球菌PSM565（Lactococcus lactis PSM565），購(gòu)自BIONEER 公司。

1.2 病毒、細(xì)胞及血清 犬腎細(xì)胞（MDCK）由本實(shí)驗(yàn)室保存，水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；兔抗CaIFN-γ血清由本實(shí)驗(yàn)室自制保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與基因合成 根據(jù)已發(fā)表的CaIFNγ基因序列[9]，并依據(jù)乳酸乳球菌密碼子的偏嗜性和表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)，在不改變蛋白編碼的基礎(chǔ)上，將原有的CaIFN-γ序列由DNA2.0 公司重新優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成。利用Primer5.0 生物學(xué)軟件，針對(duì)合成的CaIFN-γ基因序列設(shè)計(jì)引物P1、P2 用于重組載體的構(gòu)建和鑒定。根據(jù)GenBank 上發(fā)表VSVN 基因的保守序列片段設(shè)計(jì)引物P3 和P4，用于SYBR Green real-time RT-PCR 試驗(yàn)擴(kuò)增VSV病毒的N 片段；根據(jù)犬β actin 內(nèi)參序列設(shè)計(jì)引物P5 和P6 用于犬腎細(xì)胞（MDCK）內(nèi)參控制序列的擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.4 重組pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 的構(gòu)建及表達(dá) 將優(yōu)化后獲得的CaIFN-γ基因與表達(dá)載體pAMJ399 進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌PSM565中，篩選含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAMJ399-CaIFN-γ的轉(zhuǎn)化菌PSM565 進(jìn)行培養(yǎng)。將重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/ PSM565 在32 ℃靜置培養(yǎng)，通過(guò)自身產(chǎn)酸啟動(dòng)誘導(dǎo)，24 h 后離心，分別收集上清和沉淀，上清用TCA方法濃縮，沉淀用溶菌酶處理，以不含目的基因的pAMJ399/ PSM565 空載體組的上清和沉淀作為對(duì)照。然后以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量為參考，通過(guò)SDS-PAGE、Western-Blot 試驗(yàn)方法對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析、鑒定。

1.5 重組乳酸乳球菌培養(yǎng)條件優(yōu)化 為了獲得重組蛋白表達(dá)的適宜pH 值和生長(zhǎng)條件，將重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSMA565 按1∶100比例接種于含有不同量β-甘油磷酸二鈉的GM17液體培養(yǎng)基中，即GM17 培養(yǎng)基中分別含有1%、1.5%、2%……3.5%β甘油磷酸二鈉。32 ℃厭氧條件下靜置誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，每2 h 取菌液測(cè)OD600和pH 值，分析β-甘油磷酸二鈉對(duì)重組乳酸乳球菌生長(zhǎng)條件的影響。

1.6 犬γ干擾素抗病毒活性檢測(cè)

1.6.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 用0.25%胰酶將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層MDCK 細(xì)胞進(jìn)行消化，用完全培養(yǎng)基稀釋成濃度約2×105/mL 個(gè)細(xì)胞的懸液，分裝到24 孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加1 mL，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后棄液，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基2 倍倍比稀釋重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFNγ/PSM565 和pAMJ399/PSM565 上清液，分別加入到24 孔板中，每孔100 μL，細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照孔加入同等體積的無(wú)血清培養(yǎng)液。37 ℃孵育72 h，每天觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)。

1.6.2 MTT 法檢測(cè)重組干擾素抗病毒活性 96 孔板長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞上接種無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基2 倍稀釋的重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 和pAMJ399/PSM565 的上清液，每孔100 μL，細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照孔加入無(wú)血清培養(yǎng)液。37 ℃孵育24 h，棄液，每孔加入100 μL 的VSV（約100 TCID50），細(xì)胞對(duì)照孔加入100 μL 無(wú)血清培養(yǎng)液。待病毒對(duì)照孔90%左右病變時(shí)，觀察細(xì)胞各孔的病變結(jié)果。棄上清，每孔加入5 mg/mL 的MTT 染色液10 μL，37 ℃作用1 h，再加入DMSO100 μL，室溫放置15 min，混勻，酶標(biāo)儀OD470讀值。

1.6.3 Real-Time PCR 測(cè)定病毒載量 將正常的細(xì)胞組，5 倍重組菌組pAMJ399-CaIF-γ/PSM565 和空載體組pAMJ399/PSM565 上清作用的細(xì)胞接種VSV后，孵育24～30 h，待正常細(xì)胞組病變完全后，將這3 組細(xì)胞的上清液收集。應(yīng)用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞液中總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用Real-Time PCR 方法檢測(cè)各組細(xì)胞中VSV的載量，觀察重組干擾素抗病毒效力。Real-Time PCR 方法中的Ct值由PCR 儀自動(dòng)給出，ΔCt表示每個(gè)檢測(cè)樣本中的病毒載量，ΔCt=Ct目的基因—Ct參照基因。ΔCt值與病毒復(fù)制量呈反比，ΔCt值越低VSV感染量越高。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 將篩選獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAMJ399-CaIFN-γ電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌PSM565 中，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；結(jié)果顯示，單酶切目的片段與載體總大小約為7 400 bp，雙酶切和PCR 檢測(cè)插入片段長(zhǎng)約440 bp（見(jiàn)圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。表明成功構(gòu)建了pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 表達(dá)系統(tǒng)。

圖1 重組質(zhì)粒pAMJ399-Ca IFN-γ酶切和PCR 鑒定結(jié)果

圖2 重組乳酸乳球菌蛋白表達(dá)SDS-PAG E 結(jié)果

2.2 CaIFN-γ在重組乳酸乳球菌中的表達(dá)及鑒定重組菌上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖2），重組乳酸乳球菌的菌體沉淀中有一條約20 ku 大小的蛋白條帶，與預(yù)期目的蛋白大小相符；重組菌上清和沉淀經(jīng)Western-Blot 分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3），上清和菌體沉淀中均有約20 ku 的特異條帶出現(xiàn)，與預(yù)期大小相符，說(shuō)明重組菌能夠誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，并在菌體和上清中均有表達(dá)，但在上清中蛋白含量較低，需進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 重組蛋白Western-Blot鑒定結(jié)果

2.3 重組犬γ干擾素抗病毒活性的檢測(cè)

2.3.1 重組犬γ干擾素細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將濃縮5倍、10 倍的含有重組CaIFN-γ蛋白的菌體上清液加入到培養(yǎng)單層的MDCK 細(xì)胞中，觀察重組CaIFN-γ對(duì)細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞呈多角形緊密排列貼壁生長(zhǎng)，大小均一；10倍濃縮的空載體組和重組菌組上清作用的細(xì)胞大小不一，細(xì)胞之間比較疏松，有的沒(méi)有典型的多邊形形態(tài)，部分細(xì)胞之間有細(xì)胞脫落的空隙存在；而5 倍濃縮的上清作用的細(xì)胞形態(tài)好于10 倍濃縮，基本與正常細(xì)胞的鏡下結(jié)果相似，因此采用5 倍及以下濃縮的上清進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3.2 干擾素抗病毒活性 原倍和5 倍濃縮的重組菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 上清液作用于鋪滿單層的MDCK 細(xì)胞后，接種VSV，觀察細(xì)胞病變情況。結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞相比，重組菌組和空載體組的原倍上清作用后的細(xì)胞接種病毒后與病變組細(xì)胞差別不大，保護(hù)作用不明顯，細(xì)胞圓縮，脫落；5 倍濃縮的上清作用的細(xì)胞接種病毒后，細(xì)胞的形態(tài)與正常細(xì)胞組形態(tài)相似，保持四邊形或者多邊形結(jié)構(gòu)緊密排列，表明對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

2.3.3 MTT 法檢測(cè)重組干擾素抗病毒活性結(jié)果利用MTT 法檢測(cè)活細(xì)胞的數(shù)量，從而分析病毒的繁殖情況。由統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知（圖4 所示），5倍濃縮上清的IFN 組相比病毒組差異極顯著（P＜0.01），能夠抑制病毒的生長(zhǎng)繁殖。

圖4 MTT 法檢測(cè)濃縮后干擾素上清的抗病毒活性

2.3.4 熒光定量PCR 檢測(cè)MDCK 細(xì)胞攻毒后的病毒載量 應(yīng)用SYBR Green 實(shí)時(shí)定量PCR 方法測(cè)定重組干擾素作用的MDCK細(xì)胞接種病毒后的病毒感染量。由結(jié)果可知（圖5），重組菌組pAMJ399-CaIFNγ/PSM565 與空載體組pAMJ399/PSM565 和病毒組的ΔCt值差異極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明重組菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565 分泌上清5 倍濃縮作用的MDCK細(xì)胞攻毒后的病毒載量明顯低于病毒對(duì)照組，γ干擾素起到了明顯的抗病毒作用。

圖5 SY BR G reen real-timeR T-PCR 檢測(cè)MDCK 細(xì)胞未孵育干擾素和孵育干擾素后VSV感染程度的比較

3 討論

20 世紀(jì)80 年代初，人的干擾素基因克隆成功后，各國(guó)學(xué)者相繼開(kāi)展了犬干擾素的研究。其產(chǎn)品可應(yīng)用于臨床的治療或作為免疫佐劑配合疫苗的使用來(lái)提高抗體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答水平[10]。但動(dòng)物γ干擾素的研究起步比較晚，各項(xiàng)技術(shù)還不成熟，存在著很多問(wèn)題，首先，重組表達(dá)的CaIFN-γ多以包涵體形式存在，利用率較低，其次，CaIFN-γ在不同的表達(dá)系統(tǒng)和測(cè)定系統(tǒng)上活性不同，因此有待深入研究，逐步優(yōu)化干擾素的使用方法和條件。

目前常用獲得重組蛋白的表達(dá)方法主要有真核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白活性好，但產(chǎn)量低，在實(shí)際應(yīng)用中比較困難；大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白經(jīng)常是以包涵體形式存在，不利于重組干擾素的臨床應(yīng)用；乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中的乳酸乳球菌，作為表達(dá)和傳遞外源基因的載體系統(tǒng)具有益生性、安全性，以及可通過(guò)先天性免疫激活腸道黏膜免疫系統(tǒng)，不會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體等重要特點(diǎn)，尤其是分泌型載體表達(dá)的外源蛋白無(wú)需純化，直接可以應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，近年來(lái)受到越來(lái)越多的重視。

本研究構(gòu)建重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFNγ/ PSM565，獲得了分泌表達(dá)的犬γ干擾素蛋白，將培養(yǎng)pAMJ399-CaIFNγ/ PSM565 的培養(yǎng)上清液進(jìn)行5 倍濃縮后與MDCK 細(xì)胞進(jìn)行作用24 h后，接種VSV病毒，通過(guò)觀察病變、MTT 法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)及熒光定量PCR 檢測(cè)方法，均證實(shí)該蛋白能夠抑制VSV的復(fù)制，具有明顯的抗病毒活性。為進(jìn)一步研究犬γ干擾素在臨床上的抗病毒應(yīng)用和作為細(xì)胞因子佐劑的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1]Bach E A，Aguet M，Schreiber R D.The IFN gamma receptor：a paradigm for cytokine receptor signaling[J].Immunol，1997，15，563-591.

[2]Chin Y E，Kitagawa M，Su WC，et al.Cell growth arrest and induction of cyclin dependent kinase inhibitor p21WAF1/CIP1 mediated by STAT1[J].Science，1996，272（5262）：719-722.

[3]Ferris R L，Whiteside T L，F(xiàn)errone S.Immune escape associated with functional defects in antigen-processing machinery in head and neck cancer[J].Clin Cancer Res，2006，12（13）：3890-3895.

[4]夏倫斌，王新華，連宏軍，等.γ干擾素及其在動(dòng)物疾病控制中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（5）：74-78.

[5]楊琪，夏春，趙德明，等.犬干擾素-γ cDNA的克隆及其在鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0) 中表達(dá)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2002，18（3）：365-368.

[6]吳艷花，汪明，吳志光.德國(guó)牧羊犬γ干擾素基因克隆表達(dá)與抗病毒活性測(cè)定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008，44（6）：3-5.

[7]Zucker K，Lu P，Asthana D，et al.Production and characterizationof recombinant canine interferon-gamma from Escherichia coli[J].Journal of Interferon Research，1993，13（2）：91-97.

[8]DeVos WM，Vaughan E E.Genetics of lactose utilization in lactic acid bacteria[J].FEMSMicrobiol Rev，1994，15（2-3）：217-237.

[9]張海峰，李景榮，唐麗杰，等.重組犬IFN-γ在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13（5）：639-643.

[10]王忠海.干擾素在狂犬病疫苗中的佐劑效果研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2009，18（24）：17-19.