秦曉冰 ，王怡男，張傳美，黃 娟，張洪亮，王 聰，胡琳琳，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109；2.山東省安丘市畜牧局，山東 安丘 262100）

犬瘟熱（Canine Distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus，CDV）感染引起的犬科、鼬科和其他食肉目動(dòng)物的急性或亞急性、高度接觸致死性傳染病，對當(dāng)前養(yǎng)犬業(yè)、特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)危害巨大。血凝素（H）蛋白是CDV囊膜表面糖蛋白纖突，與病毒吸附、融合并侵入宿主細(xì)胞直接相關(guān)[1]。H 蛋白是CDV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原。H 蛋白的中和抗原表位編碼的多肽可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，中和CDV的傳染性。但在犬瘟熱病毒感染宿主過程中，不同毒株H 蛋白主要抗原表位區(qū)球狀頭部域（Head Domain）的中和抗原表位變化是否會(huì)對毒株間抗原演變或體液免疫機(jī)制產(chǎn)生影響尚不清楚。為此，本研究構(gòu)建了疫苗株和野毒株Head Domain 基因的原核表達(dá)載體，并在表達(dá)宿主菌中成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究H 蛋白中和抗原表位及其體液免疫機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 疫苗株CDV3、Asia-Ⅰ型野毒株組織毒LYM、Vero 細(xì)胞和pET-30a 質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5a、BL21（DE3），均購自寶生物工程（大連）有限公司；6 周齡昆明系小鼠，購自青島派特福德小鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社。

1.2 主要試劑 TRIZol LS?Reagent RNA提取試劑盒，購自Invitrogen 公司；ExTaq/PrimeSTAR HSDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶，均購自寶生物工程(大連)有限公司；兔抗His 標(biāo)簽單克隆抗體，購自北京普利來基因技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)CDV-H基因擴(kuò)增方法，合成1 對引物（F1、R1），并設(shè)計(jì)2 對原核表達(dá)引物（CDV3-F2、R2/LYM-F3、R3），5′端引入酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，預(yù)期片段大小分別為1 921 bp 和1 143 bp（見表1）。

表1 引物序列

1.5 H 基因RT-PCR-RFLP 分析 分別以CDV3和LYMRNA為模板，RT-PCR 擴(kuò)增得到H 全 基因，經(jīng)回收純化，由本實(shí)驗(yàn)室建立NdeⅠ-RFLP 方法進(jìn)行鑒定。

1.6 H基因克隆和鑒定 將PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T 連接轉(zhuǎn)化至E.coliDH5a。提質(zhì)粒，經(jīng)PCR 和BamHⅠ/HindⅢ酶切鑒定，陽性質(zhì)粒分別命名為pMD18-T-H1 和pMD18-T-H2，送公司測序。

1.7 Head Domain 基因擴(kuò)增及原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以pMD18-T-H1 和pMD18-T-H2 為模板，PCR得到Head Domain 基因。目的片段和pET-30a 質(zhì)粒均BamHⅠ/HindⅢ酶切后，連接轉(zhuǎn)化至E.coliDH5a。搖菌提重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定正確后，命名為pET-30a-VCHD和pET-30a-LYHD，送公司測序。

1.8 誘導(dǎo)表達(dá)及其條件優(yōu)化 將pET-30a-VCHD、pET-30a-LYHD和pET-30a，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)條件優(yōu)化做SDS-PAGE。

1.9 表達(dá)產(chǎn)物Western blot 分析 SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)印到PVDF 膜，以兔抗His 標(biāo)簽單克隆抗體（1∶1 000）為一抗，以羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000）為二抗，進(jìn)行Western blot。

1.10 表達(dá)產(chǎn)物純化 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)His.tag 蛋白純化試劑盒純化，做SDS-PAGE 分析。

1.11 間接ELISA分析 CDV3/LYM試驗(yàn)組和生理鹽水對照組分別取12 只6 周齡昆明系小鼠，皮下注射純化蛋白（50 μg/只），加強(qiáng)免疫兩次，每次間隔2 周，自初免后每周對小鼠眼眶采血。將純化蛋白（5 μg/mL）包被，待檢血清1∶80 稀釋，測量OD值。

1.12 細(xì)胞中和試驗(yàn) 采集血清滅活后，倍比稀釋至1∶256，分別與100 TCID50的CDV3 細(xì)胞毒混合，于37 ℃孵育1 h 后加入Vero 細(xì)胞，逐日觀察結(jié)果。

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2 結(jié)果

2.1 H 基因擴(kuò)增及RFLP RT-PCR 產(chǎn)物電泳可見1 921 bp 左右特異性條帶。RFLP 發(fā)現(xiàn)，LYM電泳可見約1 282 bp、345 bp 和294 bp 3 條特異性條帶，而CDV3 只有1 條特異性條帶（圖1）。

圖1 H 基因擴(kuò)增及R FLP

2.2 克隆質(zhì)粒鑒定 重組克隆質(zhì)粒pMD18-TH1、pMD18-T-H2 經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ酶切，得到片段大小分別為2 690 bp 和1 921 bp，與預(yù)期大小相同（圖2）。測序結(jié)果表明，H 基因序列正確。

2.3 Head Domain 基因擴(kuò)增 以pMD18-T-H1、pMD18-T-H2 為模板，PCR 擴(kuò)增Head Domain 基因，電泳可見1 143 bp 特異性條帶（圖3）。

2.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定 質(zhì)粒pET-30a-VCHD、pET-30a-LYHD經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ酶切，得到片段分別為5 422 bp 和1 143 bp，與預(yù)期大小相符（圖4）。表明目的基因均已插入相應(yīng)克隆位點(diǎn)；測序結(jié)果表明，插入片段具有正確閱讀框。

圖2 pMD18-T-H 雙酶切

圖3 H ead Domain基因PCR

圖4 pET-30a-VCH D、pET-30a-LY H D酶切鑒定

2.5 Head Domain-His 誘導(dǎo)表達(dá) 結(jié)果顯示，重組菌在28 ℃、IPTG 為0.8 mmol/L、誘導(dǎo)6 h 時(shí)表達(dá)目的蛋白量最大。細(xì)菌裂解后在50.8 ku 處出現(xiàn)目的蛋白條帶，而未誘導(dǎo)重組菌和誘導(dǎo)空載體無此條帶（圖5）。

2.6 Western Blot 分析 結(jié)果顯示，CDV3-Head Domain 和LYM-Head Domain 重組蛋白相對分子質(zhì)量約50.8 ku，與預(yù)期大小相符（圖6）。表明兩個(gè)蛋白均與兔抗His 標(biāo)簽單克隆抗體結(jié)合良好。

2.7 蛋白純化蛋 白純化后獲得較純的重組蛋白（圖7）。

2.8 間接ELISA結(jié)果 結(jié)果顯示，免疫次數(shù)越多，重組蛋白刺激小鼠產(chǎn)生抗體效價(jià)越高，且試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05）；而對照組抗體效價(jià)很低，試驗(yàn)組與對照組差異極顯著（P＜0.01）（圖8）。說明重組蛋白均能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，具有一定免疫原性。

圖5 大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白

圖6 H ead Domain Western blot分析

圖7 重組蛋白純化

圖8 間接ELISA結(jié)果（OD450值）

2.9 中和試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，對照組免疫后小鼠體內(nèi)均未檢測到CDV中和抗體。而試驗(yàn)組在初免后中和抗體效價(jià)最高僅達(dá)到1∶4（圖9 未顯示），但二免后，兩者抗體滴度均顯著升高，在第21 天達(dá)到1∶16；隨后三免，抗體滴度均再次升高，在第35 天達(dá)到1∶32，且試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05）（圖9）。表明兩種重組蛋白都有抗病毒活性，且兩者中和效價(jià)沒有明顯差異。

圖9 中和試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

犬瘟熱病毒H蛋白是Ⅱ型糖蛋白，包括N-末端胞質(zhì)尾區(qū)、跨膜區(qū)和C-末端胞外結(jié)構(gòu)域[2]。胞外結(jié)構(gòu)域由α螺旋形成的莖部及其支持的受體結(jié)合位點(diǎn)、蛋白抗原區(qū)域的球狀頭部組成[3]。Onderstepoort 株球狀頭部域氨基酸序列為228～604 aa[4]。

H 蛋白是犬瘟熱病毒最易變異的蛋白，常用來評估CDV毒株間遺傳演變。CDV野毒株H 基因有一個(gè)或兩個(gè)NdeⅠ酶切位點(diǎn)，而疫苗株H 基因中沒有，可用來區(qū)分疫苗株和野毒株。有研究表明，CDV疫苗株與野毒株的部分氨基酸序列存在較低同源性（89.7%～91.8%），推測CD的免疫失敗可能與兩者遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)有關(guān)[5]。但也有研究表明，犬瘟熱野毒株和疫苗株H、N 基因DNA疫苗對受到野毒株攻擊水貂可產(chǎn)生相同保護(hù)力，推測兩者抗原差異不會(huì)引起免疫失敗[6]。疫苗株和野毒株Head Domain 變化是否對毒株間抗原演變或體液免疫產(chǎn)生影響尚不清楚。為此，本研究用原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得重組蛋白為Head Domain 研究提供基礎(chǔ)。

本研究對重組蛋白免疫原性進(jìn)行了鑒定。Western Blot 結(jié)果顯示，Head Domain-His 蛋白與兔抗His 標(biāo)簽單抗特異性結(jié)合良好。ELISA結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)增加，重組蛋白刺激小鼠產(chǎn)生抗體效價(jià)越高，表明重組蛋白具有一定免疫原性，且需多次免疫才能達(dá)到較高抗體水平。中和試驗(yàn)結(jié)果表明，CDV3 和LYM的重組蛋白中和抗體效價(jià)沒有明顯差異，提示野毒株與疫苗株Head Domain 蛋白抗原差異可能不會(huì)影響免疫原性改變，但這一推測仍需本體動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行深入驗(yàn)證。

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[2]李天松.不同宿主來源犬瘟熱病毒遺傳分析與生物學(xué)特性研究[D].吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

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