王　鶴　陳擁軍　張中華

湖南省張家界市人民醫(yī)院腫瘤科，湖南　張家界　427000

白術(shù)多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響

王鶴陳擁軍張中華*

湖南省張家界市人民醫(yī)院腫瘤科，湖南張家界427000

【摘要】目的：探討白術(shù)多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的誘導(dǎo)作用。方法：采用不同濃度(30、60、120mg/ml)、不同時(shí)間(24、48h)白術(shù)多糖注射液處理SGC-7901細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Westernblot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，RTRCR檢測(cè)p53mRMA。結(jié)果：白術(shù)多糖注射液對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外凋亡具有促進(jìn)作用，并呈現(xiàn)劑量及時(shí)間成正相關(guān)；白術(shù)多糖注射液處理后，SGC-7901細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)及Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，并呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴性；SGC-7901細(xì)胞P53mRNA表達(dá)隨白術(shù)多糖濃度的增高而增強(qiáng)。結(jié)論：白術(shù)多糖促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax、p53mRNA和下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】白術(shù)多糖 SGC-7901；細(xì)胞凋亡；機(jī)制研究

白術(shù)為我國(guó)常用中藥之一，為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz)的干燥根莖，其性溫，味甘苦，具有健脾益氣、燥濕利水的功效，臨床用于治療脾胃氣弱、瀉泄、汗出、胎動(dòng)不安等。藥理研究表明，多糖是中草藥發(fā)揮獨(dú)特療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，并發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[1]。研究采用體外培養(yǎng)方法，觀察了不同濃度白術(shù)多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡和對(duì)Bax、Bcl-2、P53mRNA 表達(dá)的影響，為白術(shù)多糖抗胃癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料胃癌細(xì)胞株SGC-7901(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤研究所)；白術(shù)多糖(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)；小牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Bcl-2、Bax單抗(Santa Cruz公司)；凋亡試劑碘化丙啶(PI)和Annexin-V-FITC凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；Trizol試劑(invitrogen)；DSS(Sigma公司)；Taq酶(鼎國(guó)公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇胃癌細(xì)胞株SGC-7901，按貼壁方法培養(yǎng)，用含有雙抗(每100ml分別含青霉素1萬單位和鏈霉素10mg)及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，然后用滅菌的5.6% NaHCO3調(diào)pH值至7.2，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48h用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞凋亡率檢測(cè)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/ml，將細(xì)胞加至96孔板，500μl/孔,另設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)12h后，加入終濃度為30、60、120mg/ml的白術(shù)多糖并在不同時(shí)間點(diǎn)(24、48h)對(duì)SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共4組。細(xì)胞置37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后1200r/min，離心4min，棄上清液，用流式細(xì)胞儀按照試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)30、60、120mg/ml白術(shù)多糖注射液處理細(xì)胞48h后，提取胞質(zhì)蛋白，按照Western blot操作步驟進(jìn)行Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)p53mRNA用Trizol提取總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)及多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。基因擴(kuò)增條件為：94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min；進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，最后54℃10min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察并拍照，用Flour Chem V2.0凝膠成像分析軟件分析不同組別DNA擴(kuò)增帶的灰度值，以灰度值(p53)/灰度值(β-actin)作為基因 p53mRNA的半定量指標(biāo)。引物由上海生工公司合成，具體如下。

表1　合成的引物序列

2結(jié)果

2.1白術(shù)多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外凋亡率的影響實(shí)驗(yàn)中觀察到各組胃癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，胞體橢圓變形多發(fā)，同時(shí)可見細(xì)胞壞死碎片。從表2可知，在不同預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)，不同濃度白術(shù)多糖對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞體外凋亡具有促進(jìn)作用，且與作用時(shí)間和處理劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性。白術(shù)多糖濃度越高則對(duì)SGC-7901凋亡促進(jìn)作用越明顯(P<0.01)；在同一濃度條件下，白術(shù)多糖處理時(shí)間越長(zhǎng)則對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用越明顯(P<0.01)。

表2　不同濃度白術(shù)多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外凋亡率的影響 ±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與24h組比較，▲P<0.01。

2.2白術(shù)多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響不同濃度白術(shù)多糖處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48h后，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，而Bax蛋白表達(dá)顯著升高，前者與白術(shù)多糖濃度呈負(fù)相關(guān)，后者與白術(shù)多糖濃度呈正相關(guān)，說明二者可能與白術(shù)多糖促進(jìn) SGC-7901細(xì)胞的凋亡機(jī)制相關(guān)，具體見表3。

表3　不同濃度白術(shù)多糖對(duì)凋亡細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3白術(shù)多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞p53mRNA表達(dá)的影響由表4可知，隨著白術(shù)多糖濃度的增高，SGC-7901細(xì)胞p53mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，說明白術(shù)多糖對(duì)促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡與p53基因有關(guān)系。

表4　不同濃度白術(shù)多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞p53mRNA表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著重要的作用，對(duì)生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育起著重要的作用。細(xì)細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。一個(gè)嚴(yán)密完整的程序化死亡過程，需在基因表達(dá)的激活、特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)等調(diào)控下進(jìn)行的自性、有序性死亡，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制[2]。

白術(shù)多糖是一種多效的天然活性物質(zhì)，具有明顯的免疫增強(qiáng)作用[3]，白術(shù)多糖能顯著增加小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量[4]，能提高大鼠外周血白細(xì)胞的含量及血清免疫球蛋白和補(bǔ)體水平，增加NBT陽性率和血清溶菌酶的含量，促進(jìn)外周血、脾臟T/ B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率[5]。Zhang等[1]研究發(fā)現(xiàn)，注射白術(shù)多糖后能明顯減小S180荷瘤小鼠和Lewis肺癌小鼠的瘤重和瘤體比，明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，說明其能降低瘤細(xì)胞的增殖率。實(shí)驗(yàn)中，白術(shù)多糖干預(yù)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡率能明顯提高，還可促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)和Bcl-2蛋白表達(dá)的下調(diào)以及上調(diào)p53mRNA的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)[6]，Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡基因，而Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，二者是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要組成部分。p53基因定位于人類染色體17p13.1，由11個(gè)外顯子組成，編碼393個(gè)氨基酸組成的53 000的核內(nèi)磷酸化蛋白，全長(zhǎng)約20kb。其參與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、凋亡等，其激活可加快腫瘤細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，白術(shù)多糖可能通過上調(diào)Bax、p53mRNA和下調(diào)Bcl-2表達(dá)促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡，但其是否可以誘導(dǎo)其他基因，以及具體介導(dǎo)通路仍需深入研究和探討。

參考文獻(xiàn)

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(收稿日期：2015.09.07)

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2015)24-0010-02

通信作者：張中華，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤。