王阿慧，凌艷英，莊秋容，鄧家德

(廣東省廣州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 510180)

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·臨床研究·

兩種方法檢測(cè)血紅蛋白H百分比一致性比較*

王阿慧，凌艷英，莊秋容，鄧家德

(廣東省廣州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 510180)

目的 比較高效液相色譜方法(HPLC)和醋酸纖維素薄膜堿性電泳(CAFE)方法對(duì)血紅蛋白(Hb)H定量的一致性。方法 采用HPLC和CAFE對(duì)廣州市第一人民醫(yī)院已行基因確診的50例缺失型Hb H病患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，詳細(xì)記錄和分析其相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)。結(jié)果 缺失型HbH病患者經(jīng)HPLC檢測(cè)可出現(xiàn)特異HbH異常峰，出峰時(shí)間為(0.42±0.05)s,CAFE可得到特異的HbH帶。兩種方法得到的HbH百分比經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 HPLC是一種高效快速檢測(cè)HbH的方法，是能滿足臨床快速檢測(cè)缺失型HbH病的有效手段。

缺失型血紅蛋白H??； 高效液相色譜方法； 醋酸纖維素薄膜堿性電泳

海洋性珠蛋白生成障礙性貧血是我國(guó)華南地區(qū)常見的以慢性進(jìn)行性溶血為特點(diǎn)的一組遺傳病。根據(jù)臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度，α珠蛋白生成障礙性貧血可分為靜止型、輕型、中間型和重型。血紅蛋白(Hb)H病屬于α珠蛋白生成障礙性貧血的中間型,由于4個(gè)α基因中有3個(gè)缺失或缺陷，α鏈嚴(yán)重合成不足，相對(duì)過剩的β鏈自行聚合為4聚體即HbH。HbH性質(zhì)不穩(wěn)定，易形成包涵體沉積在紅細(xì)胞內(nèi)，使紅細(xì)胞在通過脾臟時(shí)易于被破壞，出現(xiàn)貧血等癥狀[1]。由于珠蛋白生成障礙性貧血除干細(xì)胞移植外，尚無(wú)有效治療手段，因此采用相應(yīng)技術(shù)方法，篩查出高風(fēng)險(xiǎn)夫婦，并采取孕期產(chǎn)前診斷以阻止重癥患兒出生，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的首選預(yù)防措施[2]。缺失型HbH病在外周血中可檢測(cè)出HbH。傳統(tǒng)的檢測(cè)HbH的常用方法有醋酸纖維素膜堿性電泳(CAFE)、Hb電泳、包涵體試驗(yàn)等。本試驗(yàn)中采用堿性CAFE及高效液相色譜方法(HPLC)檢測(cè)HbH百分比，以比較二者之間的一致性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部病例為2012～2013年在廣州市第一人民醫(yī)院診治的患者，經(jīng)基因檢測(cè)為α珠蛋白生成障礙性貧血缺失型HbH病50例。抽取患者4 mL肝素鋰抗凝血備用。

1.2 儀器與試劑 美國(guó)Bio-Rad公司Variant Ⅱ Hb HPLC分析系統(tǒng)及配套β-thalassemia試劑；北京市六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-2C型電泳儀及電泳槽。其他試劑為一般分析純。

1.3 Hb HPLC分析 取肝素鋰抗凝全血4 mL,無(wú)需制備溶血液直接進(jìn)行高效液相色譜分析。按儀器說明書操作，Hb各成分定量約7 min后由HPLC分析儀自動(dòng)分析計(jì)算。

1.4 CAFE HbH定量肝素鋰抗凝血，用四氯化碳抽提制備Hb液，取20 μL加樣于已浸透Tris緩沖液的醋酸纖維素薄膜上，置于pH8.6的硼酸緩沖液中電泳約30 min，分別剪取HbA2、HbA、HbH，加蒸餾水浸泡，待Hb完全洗脫后，用723分光光度計(jì)以415 nm波長(zhǎng)比色，計(jì)算HbH百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩種方法得到的HbH百分比比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分離HbH條帶 將抗凝血球用生理鹽水洗滌，四氯化碳萃取Hb液,以20 μL量點(diǎn)樣于醋酸纖維素薄膜上，經(jīng)pH8.6的堿性緩沖液電泳可獲得HbH條帶。圖1示自負(fù)極向正極泳動(dòng)條帶依次為HbA2(HbH患者標(biāo)本中HbA2降低顯著，電泳時(shí)HbA2帶隱約可見)、HbA、HbH。將條帶依次剪下，洗脫于相應(yīng)體積蒸餾水中并用723分光光度計(jì)以415 nm波長(zhǎng)處比色，經(jīng)計(jì)算即可獲得HbH占Hb的百分含量，計(jì)算公式為：HbH(%)=2×AHbH/(5×AHbA+2×AHbH+AHbA2)%。

圖1 Hb經(jīng)CAFE分離出HbH條帶(pH 8.6)

2.2 HPLC檢測(cè)HbH 取肝素鋰抗凝全血4 mL，無(wú)需前處理直接上樣于Variant Ⅱ HPLC分析儀，約7 min后得到分析圖譜，相應(yīng)出峰時(shí)間范圍可見一明顯的異常洗脫峰，見圖2、3。在設(shè)置中將START TIME由0.55 s改為0.00 s,顯示按出峰時(shí)間(0.42±0.05)s對(duì)應(yīng)異常峰的峰面積即是HbH百分比。

圖2 HPLC檢測(cè)HbH可見HbH異常峰

圖3 HbH患者HPLC圖分析結(jié)果

2.3 兩種方法檢出HbH百分比的一致性比較 CAFE測(cè)得HbH百分比為(7．96±3．01)%，HPLC為(8．06±3．04)%。兩種方法測(cè)得的HbH百分比采用配對(duì)t檢驗(yàn),其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

臨床上篩查常用檢測(cè)Hb的方法有Hb電泳、紅細(xì)胞指數(shù)、紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)等。這些方法雖操作要求低，成本低廉，但又因其敏感性和特異性較低，人為影響因素較大，存在較多漏診和誤診現(xiàn)象。目前臨床上對(duì)珠蛋白生成障礙性貧血的診斷和鑒別主要依靠Hb分析，該方法所用標(biāo)本無(wú)需前處理，容易操作，并進(jìn)行質(zhì)控，準(zhǔn)確性和重復(fù)性也比較好[3]。

近年來發(fā)展起來的基于陽(yáng)離子交換的HPLC是以物理化學(xué)原理為主的分離分析方法，特別適合于生物大分子，如各種蛋白組分的分離，已實(shí)現(xiàn)高通量全自動(dòng)化分析，操作簡(jiǎn)單，人為因素影響少。在分離的同時(shí)，根據(jù)出峰位置可以定性；根據(jù)峰面積可以定量，選擇性、靈敏度、準(zhǔn)確性高，適合目前珠蛋白生成障礙性貧血大規(guī)模篩查與常規(guī)診斷[4]。HPLC已成為目前對(duì)于珠蛋白生成障礙性貧血非基因檢測(cè)手段中最經(jīng)典的方法，廣泛應(yīng)用于臨床。尤其在對(duì)于β-珠蛋白生成障礙性貧血的檢測(cè)，HPLC是介于篩查和確診之間的一種理想方法，已被國(guó)際珠蛋白生成障礙性貧血協(xié)會(huì)推薦為β-珠蛋白生成障礙性貧血的常規(guī)篩查方法[5]。

Variant Ⅱ β-thalassemia Short program HPLC分析系統(tǒng)專用于檢測(cè)β-珠蛋白生成障礙性貧血且可同時(shí)檢測(cè)各種異常Hb。盡管對(duì)于α-珠蛋白生成障礙性貧血的檢測(cè)存在一定的漏檢，但是對(duì)于缺失型HbH病患者，異常HbH的檢出還是有優(yōu)勢(shì)的[6]。本文比較應(yīng)用CAFE和HPLC Hb分析儀在定量HbH方面是否存在一致性，以本院已行基因確診的50例缺失型HbH病患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)HPLC檢測(cè)出現(xiàn)異常峰標(biāo)本，CAFE均能發(fā)現(xiàn)HbH帶。有研究顯示，CAFE對(duì)于HbH的分離能力要優(yōu)于瓊脂糖凝膠電泳，可清楚地分離出HbH帶及HbBart′s帶[7-8]。但是作為手工法，CAFE存在很多不足，分辨率較差僅能分辨出HbH、HbBartS、HbA、HbA2條帶，操作較繁瑣費(fèi)時(shí)且影響因素多，重復(fù)性差。醋酸纖維素薄膜脆而易碎，區(qū)帶顏色易掉，不易保存。而HPLC可快速高效地分離出Hb各組分，重復(fù)性高[9]。本次研究使用的全自動(dòng)Hb分析儀采用HPLC對(duì)人Hb、HbA2及HbF進(jìn)行自動(dòng)化定量測(cè)定，可將珠蛋白生成障礙性貧血初步分類為α珠蛋白生成障礙性貧血和β珠蛋白生成障礙性貧血，同時(shí)還可檢出HbH、HbS、HbE、HbQ、HbJ等異常Hb，具有高效快速，自動(dòng)化程序高，準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，是介于篩查和確診的試驗(yàn)。

但在實(shí)踐工作中，必須根據(jù)特定儀器及配套試劑的適應(yīng)范圍，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合受檢者家族史，血液學(xué)表型紅細(xì)胞指數(shù)等其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，進(jìn)行綜合分析，以避免誤診和漏檢。

[1]鄧家棟，揚(yáng)崇禮，揚(yáng)天楹，等．臨床血液學(xué)[M]．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1985：623-624．

[2]Chen FE,Ooi C,Ha SY,et al.Genetic and clinical features of hemoglobin H disease in Chinese patients[J].N Engl J Med,2000,343(8):544-550.

[3]馬升俊，肖永君，韋子斌，等．全自動(dòng)血紅蛋白分析儀在地中海貧血篩查診斷中的應(yīng)用[J]．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(9)：92-93．

[4]Colah RB,Surve R,Sawant P,et al.HPLC studies in hemoglobinopathies[J].Indian J Pediatrics,2007,74(7):657-662.

[5]鄭琳，黃海龍，范向群，等．高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)β-地中海貧血的臨床價(jià)值探討[J]．中國(guó)婦幼保健，2011，26(11)：1665-1666．

[6]彭建宏，劉運(yùn)科，肖春燕．離子交換高效液相色譜法血紅蛋白分析篩查地中海貧血的研究[J]．國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2012，18(4)：539-543．

[7]Liao C,Zhou JY,Xie XM,et al.Screening for Hb constant spring in the Guangdong province,South China,using the sebia capillary electrophoresis system[J].Hemoglobin,2011,35(1):87-90.

[8]陳永秀，周云珍，陳錦宏，等．兩種電泳方法血紅蛋白分析一致性的比較[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，28(3)：229-232．

[9]謝建紅，張永良，肖奇志，等．應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)β-地中海貧血及異常血紅蛋白[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2011，32(11)：1473-1476．

醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)工作的基本內(nèi)容

按工作性質(zhì)及其先后順序，可將醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)工作分為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、收集資料、整理資料、分析資料。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是開展某項(xiàng)醫(yī)學(xué)研究工作的關(guān)鍵，包括醫(yī)學(xué)專業(yè)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)，醫(yī)學(xué)專業(yè)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括研究對(duì)象納入和排除標(biāo)準(zhǔn)、樣本含量、獲取樣本的方法、分組原則、觀察(檢測(cè))指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)方法等。收集資料的方法包括各種試驗(yàn)、檢測(cè)或調(diào)查，要求資料完整、準(zhǔn)確、及時(shí)、有足夠數(shù)量、具有代表性和可比性等。整理資料包括原始資料的檢查與核對(duì)、對(duì)資料進(jìn)行分組與匯總等。分析資料即對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和統(tǒng)計(jì)推斷。

廣東省廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(20131A011013)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.040

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1672-9455(2015)03-0385-02

2014-08-07

2014-10-28)