鄧鵬程，王岐本，鄺滿元，徐 松

(湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室，湘南郴州 423000)

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環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法在常見性病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用*

鄧鵬程，王岐本，鄺滿元，徐 松

(湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室，湘南郴州 423000)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法； 常見性??； 病原體檢測(cè)

20世紀(jì)70年代后期,性病在我國一些地區(qū)死灰復(fù)燃,發(fā)病地區(qū)不斷擴(kuò)大,發(fā)病人數(shù)直線上升,危害日益嚴(yán)重,從沿海到內(nèi)地,從城市到農(nóng)村,從社會(huì)到家庭,性病疫情逐步擴(kuò)散蔓延。據(jù)2002年全國對(duì)7種常見性?。悍橇芫阅虻姥?、尖銳濕疣、生殖器皰疹、梅毒、淋病、軟下苷、性病淋巴肉芽腫累計(jì)報(bào)道為 744 848例，發(fā)病率為58.15/10萬。另外由于各種原因的漏診和漏報(bào)，中國疾病預(yù)防控制中心性病麻風(fēng)病防治中心的調(diào)查結(jié)果顯示，性病實(shí)際發(fā)病數(shù)是報(bào)告數(shù)的10～20倍。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，我國每年實(shí)際新發(fā)性病例數(shù)為1 600～2 000萬[1]。近十幾年來，中國性病發(fā)病率每年以20%至30%速度增加，性病已成為五大傳染病之一,給社會(huì)和人民都帶來了嚴(yán)重的危害。為防治和控制性傳播疾病,對(duì)性病病原體的準(zhǔn)確快速檢測(cè)意義重大。傳統(tǒng)的性病檢測(cè)法大多繁瑣費(fèi)時(shí)，不利于性病的早期診斷以及及時(shí)控制，因此開發(fā)一系列能應(yīng)用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的性病病原體檢測(cè)方法成為當(dāng)務(wù)之急。近年來發(fā)展的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)因?yàn)榫哂刑禺?、敏感及操作簡便等特征已用于各種病原體的檢測(cè)。本研究探討LAMP在常見性病病原體檢測(cè)中的可行性及應(yīng)用前景進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 傳統(tǒng)的性病病原體檢測(cè)法

1.1 涂片鏡檢法 涂片鏡檢法一般是直接將各種分泌物及體液標(biāo)本涂片后，通過革蘭染色或巴氏染色后進(jìn)行顯微鏡下觀察判定。該方法簡單、易操作，成本低，對(duì)實(shí)驗(yàn)要求不高，多用于男性急性淋病的診斷。女性宮頸和陰道中雜菌很多，有的雜菌很像淋球菌，給診斷造成困難，出現(xiàn)較高的假陽性率。針對(duì)沙眼衣原體的檢查，常用姬姆薩染色法和碘染色法，但敏感性不高。更重要的是此方法對(duì)醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)要求較高,鏡檢結(jié)果以主觀判斷為主,容易造成誤診和漏診,檢測(cè)結(jié)果陽性率不高,特別是在基層醫(yī)院很難較好地應(yīng)用[2]。

1.2 免疫學(xué)檢測(cè)法 20世紀(jì)80年代以來，免疫學(xué)檢測(cè)法廣泛運(yùn)用于性病檢測(cè)中，其基本原理是將某種發(fā)光劑或其衍生物加入到一個(gè)免疫反應(yīng)體系中，在酶的催化作用下發(fā)光，可以根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度來計(jì)算待測(cè)抗原或抗體的量。加入發(fā)光增強(qiáng)劑后，持續(xù)時(shí)間延長，可以重復(fù)測(cè)量，方法靈敏、準(zhǔn)確。如何紅霞等[3]以人工合成的人類免疫缺陷病毒(HIV)-1 gp41.1(sp1)等5條多肽,采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)原理建立檢測(cè)抗HIV-1P2總抗體的雙抗原夾心ELISA。該實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所提供質(zhì)控參比血清,發(fā)現(xiàn)其特異性和靈敏度均為100%。其優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高,操作簡便快捷,適合于獻(xiàn)血者大范圍篩選，缺點(diǎn)是免疫學(xué)檢測(cè)方法在新感染或未產(chǎn)生高抗體滴度的人群中敏感性較低，IgG基因突變可影響檢出率，IgG抗體產(chǎn)生的延遲性會(huì)影響早期診斷和及時(shí)治療。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 20世紀(jì)90年代以后，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)方法的發(fā)展，性病病原體的各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法也應(yīng)運(yùn)而生，主要方法有：PCR、連接酶鏈反應(yīng)技術(shù)基因芯片、Gene Chip技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)等。其中PCR應(yīng)用較為廣泛，PCR是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程，是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。隨著微生物基因組學(xué)的發(fā)展,PCR在感染性疾病檢測(cè)和診斷中的應(yīng)用日趨廣泛,特別是在致病微生物，如病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體、螺旋體等引起的性病感染DNA 檢測(cè)應(yīng)用較廣。PCR檢測(cè)技術(shù)較之傳統(tǒng)方法有許多優(yōu)點(diǎn),但其費(fèi)用昂貴、易受污染，其假陽性尤其是一個(gè)主要需要考慮的問題。由于需要昂貴的PCR等儀器和高技術(shù)要求，該技術(shù)在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)尚未開展病原體的核酸檢測(cè)。

總之，目前臨床針對(duì)性病病原體傳統(tǒng)檢測(cè)方法既有優(yōu)勢(shì)，也有許多不足，而在此基礎(chǔ)上開發(fā)針對(duì)性病病原體的快速且準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)防治和控制我國日益嚴(yán)重的性傳播疾病意義重大。

2 LAMP在性病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

2000年日本學(xué)者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開了一種新的基因診斷技術(shù)，即LAMP中文名為“環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)”，受到了世界衛(wèi)生組織、各國學(xué)者和相關(guān)政府部門的關(guān)注，短短幾年，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于嚴(yán)重急性呼吸道綜合征、禽流感、艾滋病等疾病的檢測(cè)中。LAMP具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：(1)等溫高效。相比于常規(guī)PCR利用高溫使雙螺旋解鏈變性成單鏈進(jìn)行熱循環(huán)，NASBA和3SR則使用一系列轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄過程來循環(huán)以避免高溫變性作用，SDA則使用限制性內(nèi)切酶和修飾過的模板來循環(huán)擴(kuò)增。雖然它們的敏感性都很高，可以檢測(cè)并擴(kuò)增小于10個(gè)拷貝的核酸樣本，但是它們還有各自需要克服的缺點(diǎn)。技術(shù)要求、材料儀器要求、技術(shù)本身特異性缺陷等方面嚴(yán)重束縛了這些技術(shù)的推廣應(yīng)用。LAMP則在這些方面有所突破。(2)有較高的特異性和抗干擾能力。當(dāng)2對(duì)引物與目的基因片段的6個(gè)區(qū)域匹配上就能進(jìn)行擴(kuò)增。非目的基因片段對(duì)LAMP反應(yīng)的干擾比小，這方面比PCR強(qiáng)。LAMP的反應(yīng)體系比較穩(wěn)定可靠，在室溫下放置2周后仍然穩(wěn)定并且對(duì)于樣品中原有或污染的干擾基因片段仍然不敏感，而其他反應(yīng)體系則無法做到這一點(diǎn)。(3)敏感性較高。可以以單拷貝的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增。(4)反應(yīng)過程簡單快速且高效。能夠在1 h內(nèi)將單拷貝的基因模板擴(kuò)增到109個(gè)拷貝，這一過程是在60～70 ℃的恒溫下進(jìn)行的。只需一臺(tái)恒溫箱即可,不需受昂貴儀器的束縛。另外LAMP結(jié)果的檢測(cè)也無需儀器，這些在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)的操作成本。只要引物設(shè)計(jì)正確，并且完善各種反應(yīng)條件之后，LAMP對(duì)于樣品處理、操作技術(shù)和儀器設(shè)備的要求都比較低，在野外工作時(shí)也能達(dá)到。

隨著LAMP的發(fā)展，它已成功應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、支原體、真菌、寄生蟲、乙型肝炎病毒檢測(cè)等[4]。最近，國內(nèi)、外專家也將其應(yīng)用于各種性病病原體的檢測(cè)當(dāng)中。

2.1 LAMP在艾滋病病毒檢測(cè)中的建立 2009年Hosaka等[5]利用RT-LAMP對(duì)HIV-1M組進(jìn)行檢測(cè)，在60 ℃的等溫條件下，擴(kuò)增反應(yīng)在35 min內(nèi)即可完成，其檢測(cè)限可以達(dá)到120 copy/mL。該試驗(yàn)對(duì)從艾滋病高發(fā)區(qū)——西非的喀麥隆所收集的57例感染HIV-1的患者和40例未感染HIV-1的居民體內(nèi)血漿樣本進(jìn)行RT-LAMP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，57例感染HIV-1的患者血漿樣本中有56例帶有HIV-1M組的血樣本，例如圖標(biāo)類型A、B、G、F2,以及循環(huán)重組形式(CRFs)_01、_02、_09、_11、_13都被檢測(cè)為陽性。針對(duì)一個(gè)帶有HIV-10組及40例未感染HIV-1的血漿樣本分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果皆顯示為陰性。這些發(fā)現(xiàn)證明了RT-LAMP對(duì)血漿樣本中含有的HIV-1M RNA的檢測(cè)快速且靈敏，而且具有特異性。這些數(shù)據(jù)也說明了LAMP在艾滋病病毒的診斷中是可行的，特別適宜于資源條件不足的環(huán)境。

2.2 LAMP在淋球菌檢測(cè)中的建立 崔亞利等[6]利用 Primer Explorer V3軟件分別針對(duì)淋球菌porA及16S rRNA基因設(shè)計(jì)2條內(nèi)引物 FIP、BIP，2條外引物F3、B3，2條環(huán)引物L(fēng)F、LB，共6條引物，以淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。同時(shí)，以外引物F3、B3 為PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并比較兩種擴(kuò)增方法的靈敏度和特異性，探討LAMP用于淋球菌感染早期診斷的可行性。他們經(jīng)過試驗(yàn)得出結(jié)果：LAMP 與PCR靈敏度相同，可檢測(cè)到10個(gè)拷貝的目的基因；其針對(duì)淋球菌porA和16S rRNA基因的引物對(duì)腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌和大腸埃希菌的 DNA均不能擴(kuò)增，其試驗(yàn)成功建立了檢測(cè)淋球菌 porA和16SrRNA基因的LAMP。他們認(rèn)為與PCR相比，LAMP不需要使用PCR儀等昂貴、精密的儀器設(shè)備，避免了DNA的熱變性，長時(shí)間的溫度循環(huán)，一級(jí)產(chǎn)物后續(xù)檢測(cè)等步驟，更為快速，且操作簡便，檢測(cè)成本更低，為淋球菌的快速檢測(cè)提供了新的手段，有望成為淋球菌常規(guī)檢測(cè)的簡便方法。

2.3 LAMP在沙門菌檢測(cè)中的建立 沙門菌病也屬于一種常見的性病，葉宇鑫等[7]以沙門桿菌為研究對(duì)象,探討了將原位熒光LAMP應(yīng)用于檢測(cè)沙門菌所需要的具體實(shí)驗(yàn)方法與數(shù)據(jù),成功將原位熒光LAMP應(yīng)用于檢測(cè)人工污染食品中的沙門菌。該試驗(yàn)選取invA基因作為靶序列設(shè)計(jì)了2對(duì)引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示，與PCR相比,LAMP擴(kuò)增無需破碎細(xì)胞提取DNA,操作簡便，反應(yīng)過程耗時(shí)少;反應(yīng)條件恒溫便可,基因檢測(cè)水平證明LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物高度特異性;根據(jù)反應(yīng)結(jié)果顏色變化肉眼便可作出判斷。

3 LAMP在性病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用展望

與傳統(tǒng)性病病原體檢測(cè)法相比，LAMP具有明顯優(yōu)勢(shì)。首先，LAMP經(jīng)濟(jì)實(shí)用，不需要昂貴的PCR儀，對(duì)于中、小醫(yī)院只需要一臺(tái)恒溫水浴箱即可。其次，LAMP最大的優(yōu)勢(shì)就在于操作的簡便性及對(duì)儀器設(shè)備和人員要求不高，人員只需簡單培訓(xùn)即可，最適合基層醫(yī)院和場外應(yīng)用。LAMP操作步驟簡單，只需按反應(yīng)體系要求加入反應(yīng)液、酶、引物及模板于PCR管中，于恒溫箱反應(yīng)45 min左右，經(jīng)肉眼觀察反應(yīng)管顏色是否變?yōu)榘咨珳啙峋湍芘袛嘟Y(jié)果。另外，LAMP高效快速,LAMP不需要擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈DNA熱變性，避免了溫度循環(huán)從而節(jié)省大量時(shí)間，核酸在1 h內(nèi)便可完成擴(kuò)增，從而快速檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，在性病檢測(cè)中應(yīng)用能達(dá)到快速診斷的目的。與免疫學(xué)檢測(cè)方法相比，LAMP能更為精準(zhǔn)，因?yàn)槠淠軘U(kuò)增出病原體基因的特異性梯狀條帶。與涂片鏡檢法相比，LAMP省時(shí)省力、不易漏診、檢測(cè)結(jié)果更具客觀性。如果研發(fā)相關(guān)性病基因檢測(cè)試劑盒，LAMP有望成為性病常規(guī)檢測(cè)的簡便方法，為基層醫(yī)院進(jìn)行性病檢測(cè)創(chuàng)造有利條件，同時(shí)為患者提供快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，在防治與控制性疾病的傳播中發(fā)揮重要作用。

[1]張紅兵，李琦，馬駿，等．我國性病流行現(xiàn)狀及應(yīng)對(duì)措施[J]．中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2004，27(6)：377-380．

[2]何江，仇東輝，余伍忠，等．性傳播疾病實(shí)驗(yàn)檢測(cè)綜述[J]．中國優(yōu)生與遺傳雜志，2004，12(5)：139-140．

[3]何紅霞，貌盼勇，侯俊，等．雙抗原夾心法檢測(cè)抗HIV-1/2總抗體方法的建立和評(píng)價(jià)[J]．中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2002，16(3)：288-291．

[4]張如勝，魏泉德．LAMP技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J]．華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，33(5)：45-49．

[5]Hosaka N,Ndembi N,Ishizaki A,et al.Rapid detection of human immunodeficiency virus type 1 group M by a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay[J].J Virol Methods,2009,157(2):195-199.

[6]崔亞利，何於娟，劉鑫，等．快速檢測(cè)淋球菌porA和16S rRNA基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的建立[J]．中國生物制品學(xué)雜志，2010，23(10)：1125-1128．

[7]葉宇鑫，李琳，山崎伸二，等．原位熒光LAMP技術(shù)檢測(cè)食源性沙門氏菌[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(3)：137-142．

湖南省高等學(xué)校2010年科學(xué)研究項(xiàng)目(10C1240)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.061

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