索 潔，李建峰，趙 瑾，陶 林，楊曉萍△

（新疆石河子大學醫(yī)學院：1．第一附屬醫(yī)院腎病科；2．病理科，新疆石河子832000）

系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulo nephritis，MsPGN）是中國原發(fā)性腎小球疾病中最常見的病理類型［1－2］，各種損傷因子引起的系膜細胞（mesangial cell，MC）增生是多種類型腎小球腎炎的共同病理表現(xiàn)，細胞外基質（extracellar matrix，ECM）的集聚是導致腎小球硬化和促使各種腎小球腎炎向終末期腎?。‥SRD）轉化的中心環(huán)節(jié)。有研究表明，1，25（OH）2D3可顯著抑制體外培養(yǎng)的 MC增殖、誘導其分化、促進其凋亡［3］，其作用機制和原理目前尚無定論。本實通過建立大鼠抗胸腺細胞抗體（anti－Thymocyte cell－1，Thy1）腎炎［3］，給予不同劑量1，25（OH）2D3干預，用免疫組化法檢測腎小球內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase－3）的表達，TUNEL法檢測腎小球內(nèi)細胞凋亡，以探討1，25（OH）2D3對MsPGN MC凋亡的影響及其可能機制，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料 選擇清潔級SD大鼠120只，體質量（185．4±12．7）g，購自新疆地方流行性疾病控制中心。

1．2 方法

1．2．1 建立腎炎模型 將120只大鼠分為空白對照組（A組，n＝30）和實驗組（n＝90）。A組：每只大鼠尾靜脈一次性注射生理鹽水25μL／100g；實驗組每只大鼠尾靜脈一次性注射單克隆抗Thy1 25μL／100g后，隨機分為腎炎模型組（B組）、低劑量1，25（OH）2D3組（C組）和高劑量1，25（OH）2D3組（D組），每組30只。

1．2．2 1，25（OH）2D3干預 C、D組從注射Thy1后第1天開始分別給予1，25（OH）2D3（羅鈣全）0．25、0．50μg／d，溶于1 mL花生油中灌胃，共21d。A、B組大鼠同時給予1mL花生油灌胃，各組大鼠分別于注射后第1、3、7、14、21d各處死6只大鼠，留取腎臟標本待測。

1．2．3 檢測1，25（OH）2D3對 MsPGN組織損害的影響 腎組織經(jīng)HE和PAS染色后在光鏡下觀察MC和ECM增生情況，并根據(jù)病理損害程度進行分級。參照人MsPGN分級標準進行分級。

1．2．4 免疫組化技術檢測腎小球中Caspase－3的表達Caspase－3陽性表達為細胞質內(nèi)出血棕黃色顆粒。高倍鏡下（×400）隨機選取選5個腎小球，觀察染色細胞的面積和強度，計算其平均值。

1．2．5 TUNEL法測腎組織細胞凋亡 TUNEL法檢測細胞凋亡的陽性細胞為細胞核呈現(xiàn)棕黃色。高倍鏡下（×400）隨機選取10個腎小球計數(shù)，凋亡細胞占腎小球內(nèi)有核細胞的比例為陽性率，分別計數(shù)各組腎小球內(nèi)的陽性細胞。

1．3 統(tǒng)計學處理 所以數(shù)據(jù)采用SPSS19．0統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間和組內(nèi)比較采用方差分析，其中兩兩比較用SNK－q檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 1，25（OH）2D3對Thy1腎炎腎小球損害程度及病理損害的影響 A組大鼠腎組織均為正常腎組織，光鏡下未見MC和ECM增生；B組在各時間點均可見MC增生，其增生程度隨著時間的延續(xù)呈加重趨勢，并可見毛細血管袢受壓嚴重，出現(xiàn)結節(jié)和團塊狀實性區(qū)，部分腎小球出現(xiàn)分葉、硬化和纖維化，至14d時MC增生減輕；與B組比較，C、D組大鼠腎組織在各時間點MC增生程度均顯著減輕（P＜0．05），鏡下可見毛細血管袢輕度受壓，系膜寬度未超過毛細血管直徑，呈節(jié)段性分布；C、D組大鼠腎組織在各時間點 MC增生程度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），見表1、圖1（只比較 A、B、D組病理PAS染色結果，圖2、3相同）。

表1 各組不同時間腎組織病變程度積分值比較（x±s，n＝6）

圖1 不同時間段、不同組間PAS染色結果（×400）

表2 不同時段各組間腎小球內(nèi)Caspase－3的表達量（x±s，n＝6）

圖2 不同時段、不同組間Caspase－3的表達結果

圖3 不同組間、不同時段腎小球內(nèi)凋亡細胞結果

表3 TUNEL測定不同時間段各組間腎小球內(nèi)凋亡細胞百分數(shù)（x±s，n＝6）

2．2 Caspase－3在各組腎小球中的表達量比較 Caspase－3為細胞質著色，呈淡黃色或黃色。A組腎小球中無Caspase－3的表達；B組第1天腎小球細胞質內(nèi)可見Caspase－3的表達，第3天有所下降，在第7天時明顯增多，第14天表達再度減少，第21天持續(xù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與B組比較，C、D組在各時段均有Caspase－3的表達，趨勢與B組相同，且表達量高于B組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；D組表達較C組更強，C、D組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。各組腎小球內(nèi)Caspase－3的表達量，見表2、圖2。

2．3 1，25（OH）2D3對腎組織細胞凋亡的影響 A組腎小球內(nèi)有少量凋亡細胞；B組在不同時間段內(nèi)均可見陽性凋亡細胞，隨著時間延長逐漸增多；與B比較，C、D組在第1天即可見較多的凋亡細胞，3d達高峰，7、14d開始下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；C組細胞凋亡數(shù)量3d時較D組高，余各時段均較D組低，但C、D組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），見表3、圖3。

3 討 論

作為腎小球內(nèi)的固有細胞之一，MC異常增殖及其繼發(fā)的炎癥介質釋放、ECM的病理性聚集，是導致腎小球硬化，使各種腎小球腎炎向ESRD發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。因此，采用各種干預措施維持MC增生、肥大與凋亡之間的平衡及改善系膜基質代謝是延緩或逆轉腎小球硬化的關鍵。所以，尋找抑制MC增生、誘導MC凋亡的藥物對于臨床上治療各種腎小球腎炎具有重要意義。國內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實1，25（OH）2D3除了經(jīng)典的鈣磷代謝調(diào)節(jié)功能外，還具有多種生物功能，如抑制多種腫瘤細胞，免疫細胞的增殖等［4－8］，1，25（OH）2D3對 MC有無作用及是何種作用，本課題組前期的研究已經(jīng)證實，1，25（OH）2D3能夠有效抑制體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞增殖［9］。

在本實驗中，使用TUNEL法測定腎小球內(nèi)系膜細胞凋亡后發(fā)現(xiàn)，腎炎組腎小球內(nèi)細胞凋亡隨時間推移逐漸增多，而使用1，25（OH）2D3干預的實驗組在藥物干預后第1天開始凋亡細胞就明顯增多，并在第3天到達高峰，此后逐漸降低，提示1，25（OH）2D3可早期誘導GCM凋亡，對腎臟具有保護作用。此外，研究結果還提示，1，25（OH）2D3的作用強度與劑量相關，高劑量較低劑量作用更為明顯。另外，與B組相比，C、D組大鼠在各時間點的組織形態(tài)學改變也明顯減輕；第7天腎臟病理顯示MC以及ECM明顯減少，炎癥因子積聚減輕，球囊粘連偶爾可見等，說明1，25（OH）2D3對于Thy1腎炎的調(diào)控不僅是在抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡方面，而且也體現(xiàn)在組織形態(tài)學改變方面。

在細胞凋亡的啟動、發(fā)展過程中，有許多基因及其產(chǎn)物的參與，其調(diào)控過程十分復雜，目前已知的凋亡信號傳導通路有死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質網(wǎng)途徑，均能激活Caspase－3［10－15］，并可通過水解各種細胞成分而使細胞凋亡。在本研究中，對照組中腎小球中無Caspase－3的表達，B組在Thy1抗體注射后1d即出現(xiàn)Caspase－3的表達，出現(xiàn)第1個表達高峰，這與注射Thy1抗體后1d內(nèi)出現(xiàn)系膜細胞核固縮、細胞溶解有關；第3天時有所下降；隨著腎炎病程的發(fā)展，增生的系膜細胞及浸潤的炎細胞通過細胞凋亡途徑而清除，Caspase－3在第7天時再次升高，出現(xiàn)第2個表達高峰；在第14天和第21天的檢測中持續(xù)下降。C、D組總體趨勢與B組相同，但表達量更高，其中以D組的表達最強，C組次之，但各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。本實驗通過使用不同劑量1，25（OH）2D3干預后發(fā)現(xiàn)，Caspase－3的表達與藥物劑量呈正相關，提示在本實驗中1，25（OH）2D3參與了對Caspase－3的調(diào)節(jié)，具有誘導細胞凋亡的作用，促進Thy1腎炎的轉歸。

綜上所述，本研究證實了1，25（OH）2D3具有誘導細胞凋亡的作用，且受藥物劑量影響，高劑量的1，25（OH）2D3在誘導系膜細胞凋亡中的作用最強。1，25（OH）2D3參與了腎小球中Caspase－3的調(diào)控，并在Thy1腎炎早期誘導腎小球內(nèi)系膜細胞凋亡，促進了炎癥的修復，從而早期延緩腎小球疾病的進展，保護腎臟。

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