孫天宇，譚群友△，史春夢，王如文，鄧 波，周景海，陶紹霖，康珀銘

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所胸外科，重慶400042；2.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院復(fù)合傷研究所，重慶400038）

淋巴轉(zhuǎn)移已成為了肺腺癌患者的主要死因[1]，目前對其具體機制知之甚少，亦缺乏早期有效的診斷和治療方法。人轉(zhuǎn)錄輔助因子4（human transcriptional positive cofactor 4，PC4）是一類在人體廣泛分布的核蛋白，其參與了轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、染色質(zhì)形成和細(xì)胞周期進(jìn)展的多個正常細(xì)胞生理進(jìn)程，并可通過氧化DNA損傷作用防止突變從而參與調(diào)控正常的細(xì)胞生長[2]。課題前期的體外研究發(fā)現(xiàn)，PC4的表達(dá)水平與人類肺癌的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)[3]，PC4在非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中的表達(dá)水平顯著高于其鄰近的非腫瘤組織[4]。本研究采用免疫組化及實時定量PCR技術(shù)檢測臨床患者肺腺癌組織的PC4蛋白及mRNA表達(dá)水平，分析其與淋巴轉(zhuǎn)移及其他臨床特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 組織標(biāo)本取自2013～2014年于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院胸外科行根治性手術(shù)治療的96例肺腺癌患者。新切除的癌組織被收集并立即凍存于-80°C液氮中直至行PCR檢測。擬行免疫組化檢測的組織均送至病理科經(jīng)固定、包埋后制成石蠟切片?；颊咝g(shù)前均未接受過放療或化療，腫瘤不是原發(fā)性肺腺癌或患肺腺癌之前曾患過其他惡性腫瘤的患者被排除。本研究通過了第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院倫理委員會的審批，患者入組前取得了其知情同意。96例患者均按照世界衛(wèi)生組織肺癌分類的標(biāo)準(zhǔn)[5]，經(jīng)病理學(xué)確診，并根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期[6]。

1.2 方法

1.2.1 試劑 RNeasy FFPE Kit購自德國Qiagen公司，SuperScriptⅢPlatinum One-Step Quantitative RT-PCR System with ROX購自美國Invitrogen公司。兔抗PC4多克隆抗體購自英國Abcam公司，免疫組化試劑盒購自中國中杉金橋公司。

1.2.2 免疫組化檢測PC4蛋白表達(dá)水平 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟復(fù)水及抗原修復(fù)后，行SP法免疫組化染色。一抗為兔抗人PC4抗體（稀釋度1∶100），二抗為羊抗兔IgG抗體（稀釋度1∶500）。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染。封片后于顯微鏡下計數(shù)。滴加磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。陽性細(xì)胞均為細(xì)胞核染成棕黃色或棕褐色，陰性細(xì)胞不染色。兩位實驗人員盲法閱片，在200倍鏡下隨機選取至少5個視野，計算PC4陽性細(xì)胞數(shù)比例及染色強度，并參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行評分。染色強度評分為0～3分，同時計算不同染色強度細(xì)胞分別所占的比例，最后計算Q值。Q＝∑染色強度×比例，0～3分。PC4蛋白表達(dá)水平被分為2組，Q＜1.5為低表達(dá)組，Q≥1.5為高表達(dá)組[8]。

1.2.3 qRT-PCR檢測PC4mRNA表達(dá) 采用TRIzol法提取肺腺癌總RNA，測定其水平。采用TATA盒結(jié)合蛋白（TBP）基因為內(nèi)參，按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，其引物順序PC4：上游為5′-AGC GAA GCG ATG CCT AAA-3′，下游為5′-ACT TTT TGT CAA CCT CAC TGT CA-3′。TBP：上游為5′-GGA TCC CAG CAG TGC AAA C-3′，下游為5′-AAG CCG AAC TTG TAC TCA TAT TTG T-3′。反應(yīng)條件：50℃15min，95℃15min，然后94℃15s，55℃45s，共45個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算PC4mRNA的相對表達(dá)量。計算所有樣本的PC4mRNA表達(dá)的平均值，并將各樣本的PC4的表達(dá)水平與平均值進(jìn)行比較，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組[9]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用Spearman回歸曲線性相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC4蛋白和mRNA的相關(guān)性 PC4蛋白在肺腺癌中的表達(dá)，見圖1；PC4蛋白和mRNA在肺腺癌組織中表達(dá)水平分布，見圖2A。PC4mRNA可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了PC4蛋白的表達(dá)，在肺腺癌患者，PC4蛋白和mRNA表達(dá)之間存在明顯的正相關(guān)（r＝0.63，P＜0.01），見圖2B。

圖1 PC4蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)（SP×200）

2.2 PC4蛋白表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系PC4蛋白與淋巴轉(zhuǎn)移（χ2＝8.29，P＜0.01）和TNM分期（χ2＝4.71，P＝0.03）顯著相關(guān)，而與患者的年齡、性別、癥狀、吸煙史、肺部疾病史、T分期無關(guān)，見表1。

2.3 PC4mRNA表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 PC4mRNA分別與淋巴轉(zhuǎn)移（χ2＝8.40，P＜0.01）和TNM分期（χ2＝5.10，P＝0.02）相關(guān)，而與患者的年齡、性別、癥狀、吸煙史、肺部疾病史、T分期無關(guān)，見表2。

圖2 PC4蛋白與mRNA在肺腺癌患者中的表達(dá)（n＝96）

表1 PC4蛋白表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%），n＝96]

表2 PC4mRNA表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%），n＝96]

續(xù)表2 PC4mRNA表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%），n＝96]

3 討論

肺腺癌正在逐漸成為肺癌的主要病理類型，淋巴轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要原因之一[10]。大量臨床研究表明，腫瘤的某些生物學(xué)行為，如侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性等，多存在分子水平的異常表達(dá)[11-13]；某些分子的異常表達(dá)甚至能夠影響腫瘤患者的預(yù)后[14]。據(jù)此，作者推測部分肺腺癌患者也存在分子水平上的改變，導(dǎo)致其生物水發(fā)生改變，更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

PC4是一種相對分子質(zhì)量為15×103的核蛋白。它廣泛存在于體內(nèi)并參與多種重要的生理進(jìn)程，如轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞性狀轉(zhuǎn)化和染色質(zhì)形成等。最近發(fā)現(xiàn)PC4的表達(dá)與人類前列腺癌、乳腺癌及肺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，因此PC4被認(rèn)為是一個能用于人類晚期癌癥診斷、評估治療效果和預(yù)測轉(zhuǎn)移的新的靶分子[3]。此外，體外實驗證實下調(diào)PC4表達(dá)能顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增生，并且能抑制A549細(xì)胞在裸鼠中的致瘤性[4]。本課題組前期對PC4進(jìn)行了相關(guān)的研究，證實在肺癌腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展中，PC4能作為一種新的標(biāo)記物[3]，PC4參與了骨髓來源的多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的增生和衰老[15]。以上的研究結(jié)果均表明PC4或許能作為一類有價值的生物標(biāo)記物預(yù)測腫瘤患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的進(jìn)展。

本研究采用免疫組化和實時定量PCR檢測了肺腺癌標(biāo)本中PC4蛋白和mRNA的表達(dá)，并通過分析PC4表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，PC4表達(dá)水平與淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，高表達(dá)PC4的肺腺癌患者更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移。提示PC4在肺腺癌患者中的表達(dá)水平可能與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為相關(guān)，高表達(dá)患者腫瘤細(xì)胞更加傾向于遷移至淋巴結(jié)，從而引起淋巴轉(zhuǎn)移。高表達(dá)的PC4蛋白可能通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活肺腺癌淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或上調(diào)其表達(dá)水平，從而促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移。而且PC4蛋白與PC4mRNA的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)，提示此進(jìn)程或許首先由PC4基因的激活啟動。在外界環(huán)境中的某些因素或患者自身的遺傳特征的影響下，肺腺癌患者PC4基因的表達(dá)水平被上調(diào)，PC4mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致PC4蛋白的表達(dá)增加，促進(jìn)肺腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移。

本研究證實PC4在肺腺癌組織中高表達(dá)，PC4過表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。因此，PC4可能對判斷肺腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移和病理分期有一定參考價值。有關(guān)PC4表達(dá)與肺腺癌患者的生存和預(yù)后的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

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