陳琪楓,方曉明,姜朝暉,姚寧,方旭東

(解放軍第一一七醫(yī)院普外科,杭州 310013)

·基礎(chǔ)研究·

CD47和鈣網(wǎng)織蛋白在紫杉醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡中的表達(dá)

陳琪楓,方曉明,姜朝暉,姚寧,方旭東

(解放軍第一一七醫(yī)院普外科,杭州 310013)

[摘要]目的探討CD47、鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)在乳腺癌細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)的變化和意義。方法用不同濃度的紫杉醇(0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L)作用于MDA-MB-231細(xì)胞。在不同的處理時間點(24、48、72、96 h)，噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測細(xì)胞抑制率變化，流式細(xì)胞術(shù)測定CD47、CRT的表達(dá)。結(jié)果MDA-MB-231細(xì)胞的生長抑制率和紫杉醇濃度呈一定的劑量、時間相關(guān)性。各處理組在培養(yǎng)24 h時CD47的表達(dá)均顯著高于對照組，其中10.0 μmol/L組表達(dá)高于1.0 μmol/L組(F=34.71,P<0.05)；各處理組在培養(yǎng)48 h時CD47的表達(dá)均顯著高于對照組，其中10.0 μmol/L組表達(dá)高于1.0 μmol/L組和0.1 μmol/L組(F=24.272,P<0.05)；1.0 μmol/L組在培養(yǎng)72 h時CD47的表達(dá)高于對照組和10.0 μmol/L組(F=3.713,P1=0.023,P2=0.02, P<0.05)；0.1 μmol/L組在培養(yǎng)96 h時CD47的表達(dá)高于對照組、1.0 μmol/L組和10.0 μmol/L組(F=5449,P1=0.022, P2=0.009, P3=0.008)。各處理組在培養(yǎng)24 h時CRT的表達(dá)均顯著高于對照組，其中0.1 μmol/L組和1.0 μmol/L組的表達(dá)又高于10.0 μmol/L組(F=48.007,P<0.05)；各處理組在培養(yǎng)48 h時CRT的表達(dá)均顯著高于對照組，其中0.1 μmol/L組和1.0 μmol/L組的表達(dá)又高于10.0 μmol/L組(F=98.683,P<0.05)。結(jié)論CD47和CRT隨著乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡其表達(dá)相應(yīng)增加，和細(xì)胞抑制率存在一定的相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]乳腺腫瘤；CD47；鈣結(jié)合蛋白質(zhì)類；紫杉酚；細(xì)胞凋亡

The Expression of CD47 and calreticulin in the breast cancer cells apoptosis induced by paclitaxelChenQifeng,FangXiaoming,JiangChaohui,YaoNing,FangXudong(DepartmentofGeneralSurgery,117thHospitalofPLA,Hangzhou310013,China)Correspondingauthor:FangXiaoming,Email:fxm117@163.com

[Abstract]ObjectiveTo investigate the CD47 and calreticulin(CRT) expression in the apoptosis of breast cancer cells.MethodsBreast cancer cell line MDA-MB-231 was treated with paclitaxel at the dose of 0.1,1.0,10.0 and 100.0 μmol/L.The inhibitory effect was detected by MTT method at the four time points( 24,48,72 and 96 hours),and the CD47 and CRT expression were measured by flow cytometry.ResultsThe inhibitory rates of MDA-MB-231 cells was correlative with Taxol dose.Compared with those in the control group,the CD47 expression in the treatment groups was significantly increased at 24 hour,and in the 10.0 μmol/L treatment group,itwas higher than that in the 1.0 μmol/L treatment group(F=34.71,P<0.05).Compared with those in the control group,the CD47 expression in all treatment groups was significantly elevated at 48 hour,and 10.0 μmol/L treatment group was more higher than 1.0 μmol/L and 0.1 μmol/L treatment groups(F=24.272,P<0.05).The CD47 expression in the 1.0 μmol/L treatment group was more higher than that in the control group and the10.0 μmol/L treatment group at 72 hours(F=3.713,P1=0.023,P2=0.02,P<0.05).The CD47 expression in the 0.1 μmol/L treatment group was more higher than that in the control group,1.0 μmol/L and 10.0 μmol/L treatment groups at 96 hours(F=5449,P1=0.022,P2=0.009,P2=0.008,P<0.05).Compared with those in the control group,the CRT expression in all treatment groups was significantly elevated at 24 hour,and in the 0.1 μmol/L and 1.0 μmol/L treatment groups,it were higher than that in the10.0 μmol/L treatment group(F=48.007,P<0.05).Compared with those in the control group,the CRT expression in all treatment groups was significantly elevated at 48 hour,and in the 0.1 μmol/L and 1.0 μmol/L treatment groups,itwere higher than that in the10.0 μmol/L treatment group(F=98.683,P<0.05).ConclusionsThe expression of CD47 and CRT are increased in the apoptosis of breast cancer cells,which are correlated with inhibitory rates of MDA-MB-231 cells.

[Key words]Breast neoplasms;CD47;Calcium-Binding Proteins;Paclitaxel;Apoptosis

目前乳腺癌已成為了中國女性最常見的癌癥，每年中國乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別約占全世界的 12.2% 和9.6%[1]。雖然乳腺癌的綜合治療特別是生物治療方興未艾，而如何誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡一直是我們研究的重點和熱點。美國斯坦福大學(xué)研究發(fā)現(xiàn)許多癌細(xì)胞都表達(dá)鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)，CRT可招募巨噬細(xì)胞吞噬和破壞這些癌細(xì)胞，而大多數(shù)癌細(xì)胞不會受到巨噬細(xì)胞攻擊，原因是因為這些癌細(xì)胞同時還表達(dá)另外一種分子CD47，能抵消了CRT信號[2]。此次我們通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡來觀察CD47和CRT表達(dá)的變化，為下一步研究通過CD47-CRT途徑來影響乳腺癌細(xì)胞凋亡的可能。

1材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物所。常規(guī)培養(yǎng)于5%CO2、37℃、95%濕度恒溫孵箱。培養(yǎng)基DMEM含10%胎牛血清、0.01 mg/mL胰島素，添加抗生素(100 u/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素)。實驗所用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期，實驗過程中設(shè)復(fù)孔常規(guī)用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞死亡率。各組細(xì)胞死亡率均≤5%。處理組：不同濃度的紫杉醇孵育，對照組：不加藥物。

1.2MTT法測定細(xì)胞生長抑制率在48孔板中接種MCF-7細(xì)胞(2×104/孔)，置37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱孵化過夜。細(xì)胞分為紫杉醇處理組(0.1、1、10、100μmol/L)和對照組，在培養(yǎng)的第24、48、72、96 h，加入 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)20 μg(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h，再加入二甲基亞砜(DMSO) 100μL。溶解后用每聯(lián)檢測儀(波長A490 nm)測吸光度(OD)值，繪制生長曲線圖，計算生長抑制率。生長抑制率(%)=對照組OD值-處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.3流式細(xì)胞儀CD47、CRT分子測定同1.2步驟處理，將紫杉醇處理組(0.1、1、10 μmol/L)和對照組細(xì)胞送檢。細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶-0.03%乙二胺四乙酸(EDTA)消化制成單細(xì)胞懸液，充分吹打后1 000 r/min離心5 min；加入1 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗滌2次，加入FITC-CD47、PE-CRT單克隆抗體各5 μL，振蕩器均勻，室溫避光靜置30 min，加入1 mL PBS液洗滌，再加入300 μL PBS液后即用流式細(xì)胞儀(BD,美國)測定細(xì)胞分子平均熒光強(qiáng)度。FITC-CD47和PE-CRT抗人單克隆抗體購自美國LifeSpan BioSciences公司。每次實驗檢測時均設(shè)立同型抗體陰性對照管。每個時間點設(shè)3個復(fù)孔,同一條件下實驗重復(fù)3次測定。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行重復(fù)測量方差分析和多元方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測細(xì)胞抑制率結(jié)果隨著紫杉醇濃度和時間的增加，MDA-MB-231細(xì)胞的生長抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)一定的劑量、時間依賴性(表1)。其24 h、48 h、72 h和96 h的半數(shù)藥物抑制濃度(IC50)分別為9.033 μmol/L、2.855 μmol/L、0.831 μmol/L和1.761 μmol/L。

2.2MDA-MB-231細(xì)胞CD47、CRT表達(dá)的變化各處理組在培養(yǎng)24 h時CD47的表達(dá)均顯著高于對照組，其中10 μmol/L組表達(dá)高于1.0 μmol/L組(F=34.71,P<0.05)；各處理組在培養(yǎng)48 h時CD47的表達(dá)均顯著高于對照組，其中10 μmol/L組表達(dá)高于1.0 μmol/L組和0.1 μmol/L組(F=24.272,P<0.05)；1.0 μmol/L組在培養(yǎng)72 h時CD47的表達(dá)高于對照組和10 μmol/L組(F=3.713,P1=0.023,P2=0.02)；0.1 μmol/L組在培養(yǎng)96 h時CD47的表達(dá)高于對照組、1.0 μmol/L組和10 μmol/L組(F=5449,P1=0.022,P2=0.009,P3=0.008)，見表2。

各處理組在培養(yǎng)24 h時CRT的表達(dá)均顯著高于對照組，其中0.1 μmol/L組和1.0 μmol/L組的表達(dá)又高于10 μmol/L組(F=48.007,P<0.05)；各處理組在培養(yǎng)48 h時CRT的表達(dá)均顯著高于對照組，其中0.1 μmol/L組和1.0 μmol/L組的表達(dá)又高于10 μmol/L組(F=98.683,P<0.05)；各處理組在培養(yǎng)72 h和96 h時CRT的表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

3討論

CD47又稱整合素相關(guān)蛋白(IAP)，是一種廣泛表達(dá)于機(jī)體細(xì)胞的免疫球蛋白超家族成員[3]。CD47通過其內(nèi)源性配體TSP-1和SIRP-α，參與腫瘤細(xì)胞的凋亡、增值、粘附、遷移以及腫瘤相關(guān)血管的生成，在維持實體腫瘤微環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用，可避免腫瘤細(xì)胞被吞噬[4]。目前發(fā)現(xiàn)CD47在多種腫瘤中高表達(dá)，認(rèn)為可作為一種診斷的分子標(biāo)記物和預(yù)后指標(biāo)[5-6]。尤其令人感興趣的是，封閉CD47的抗體可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，在多種腫瘤的治療研究中有效[7]。而近來干擾CD47和SIRP-α信號通路也成為了一個腫瘤治療的研究點[8-9]。CD47在乳腺癌中研究不多，研究發(fā)現(xiàn)骨髓中高表達(dá)CD47的乳腺癌患者生存率明顯降低，是不良預(yù)后的獨立因素，且和骨髓中SIRP-α的表達(dá)高度一致[10]。近來Baccelli等研究發(fā)現(xiàn)基底細(xì)胞樣型乳腺癌中CD47單獨表達(dá)或和酪氨酸激酶受體MET的共同表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總生存率呈負(fù)相關(guān)[11]。本研究課題中，我們發(fā)現(xiàn)隨著乳腺癌細(xì)胞的凋亡，CD47表達(dá)相應(yīng)增高，可能基于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸反應(yīng)，避免被吞噬死亡。

表1　不同濃度紫杉醇在不同時間點的MDA-MB-231細(xì)胞抑制率

表2　MDA-MB-231細(xì)胞CD47分子平均熒光強(qiáng)度

注：同一時間點與對照組比較，aP<0.05；各處理組之間比較，bP<0.05;每個時間點設(shè)3個復(fù)孔

表3　MDA-MB-231細(xì)胞CRT分子平均熒光強(qiáng)度

注：同一時間點與對照組比較，aP<0.05；各處理組之間比較，bP<0.05；每個時間點設(shè)3個復(fù)孔

而CRT是高度保守、普遍存在于哺乳動物細(xì)胞中的鈣結(jié)合蛋白，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激、心血管反應(yīng)等多種生理和病理生理過程的多功能蛋白[12]。目前已發(fā)現(xiàn)CRT在多種惡性腫瘤中的表達(dá)增加，且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等呈正相關(guān)[13]。研究表明細(xì)胞發(fā)生凋亡時，膜表面CRT 分子增多、聚集成簇，形成凋亡細(xì)胞的“吞噬我”信號(Eat me signal)被吞噬細(xì)胞表面清道夫受體? LDL 受體相關(guān)蛋白(LRP)識別，啟動吞噬、清除凋亡細(xì)胞的過程[14]。而Gameiro等[15]最近的研究更是發(fā)現(xiàn)放療使得腫瘤細(xì)胞表達(dá)CRT，易于被殺傷性T淋巴細(xì)胞消滅。我們的研究發(fā)現(xiàn)化療藥物紫杉醇誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡過程中CRT表達(dá)也增高，存在類似的殺傷機(jī)制。

目前國內(nèi)外對乳腺癌細(xì)胞CD47和CRT的聯(lián)合研究尚未進(jìn)行過，我們對誘導(dǎo)凋亡的乳腺癌細(xì)胞CD47和CRT表達(dá)變化的檢測，顯示在凋亡中乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)相比于對照組有明顯增高。故CD47和CRT在乳腺癌細(xì)胞的凋亡和免疫逃逸中扮演重要角色，該結(jié)論對通過干擾CD47和CRT途徑來治療乳腺癌提供了一定的理論依據(jù)。

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(收稿日期:2014-12-20)

通信作者:方曉明，博士，主任醫(yī)師，Emai:fxm117@163.com

作者簡介:陳琪楓,博士,主治醫(yī)師,Email:chenqifeng76@163.com

基金項目:杭州市衛(wèi)生科技計劃面上項目(2012B056)

中圖分類號：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.022