周俊 陳列松 游曉星 曾焱華 吳移謀

生殖支原體（mycoplasma genitalium,Mg），是迄今發(fā)現(xiàn)能進(jìn)行自我復(fù)制的最小的原核微生物，透射免疫電鏡已證實(shí)Mg在宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)完整存在，在細(xì)胞培養(yǎng)模型中，M g能快速地粘附到上皮細(xì)胞，定植于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。M g侵入人類靶細(xì)胞后，導(dǎo)致宿主細(xì)胞持續(xù)性慢性致病，且癥狀隱蔽或無癥狀，可能其具有一系列的自身抵抗氧化應(yīng)激的機(jī)制來確保其持續(xù)性感染和致病。先前有報(bào)道氧化修復(fù)酶蛋氨酸亞砜還原劑A(M srA)在氧化應(yīng)激中能保護(hù)生殖支原體（M g）[1]，近年來發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶基因家族中的有機(jī)氫過氧化物抗性蛋白（Oh r），烷基氫過氧化物還原酶（AHPR）及滲透壓誘導(dǎo)蛋白C（Osm C）分布于各種病原體，在感染部位將有機(jī)氧化物變?yōu)榇碱惖慕舛具^程中發(fā)揮了重要作用。同樣地，生殖支原體基因組中也發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的Oh r/Osm C同系物[2-3]，作為滲透壓調(diào)節(jié)器系統(tǒng)被廣泛研究的Osm C直到最近發(fā)現(xiàn)與Oh r相似性后才揭示其功能，有學(xué)者認(rèn)為部分Osm C蛋白與Oh r一樣，能在體外降解H2O2和有機(jī)氫過氧化物[4-5]。生殖支原體MG 427是否有其類似功能，國內(nèi)外研究甚少，本研究利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-6 p-1/MG 427，從而為進(jìn)一步研究Osm C樣蛋白，闡明Mg的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Mg-G 37標(biāo)準(zhǔn)株、pGEX-6 p-1載體及E.coliJM 109均為南華大學(xué)病原微生物研究所保存。細(xì)菌DNA提取及純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、基因定點(diǎn)突變試劑盒為美國Axygen產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHI與NotI、T 4連接酶購自美國NEB公司；

1.2 細(xì)菌基因組DNA提取及MG 427擴(kuò)增 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒從培養(yǎng)好的Mg標(biāo)準(zhǔn)株G 37中提取基因組DNA。從Gen Bank中獲取mg427全基因序列，依據(jù)pGEX 6p-1載體上的多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)mg427基因的特異性引物。P 1:CGGAT AAA AAA TAC GAT ATC ACA，P 2: AAGGAAAAAATTA GTG GAC TAA AGT AAC GCT A。按94℃預(yù)變性5m in； 94℃變性30 s；55℃退火45 s；72℃延伸60 s；共35個(gè)循環(huán)的參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；末次循環(huán)后72℃延伸5m in，終止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠中電泳并在紫外燈下觀察，將產(chǎn)物純化回收保存。

1.3 PCR產(chǎn)物和pGEX-6 p-1空載體的酶切 雙酶切總體積為40.0μL，均含: 10×NEB bu ffer 3 4.0μL；100×BSA 0.4μL；BamHI 1.0μL；NotI 1.0μL；其中PCR雙酶切體系中加mg427純化產(chǎn)物10.0μL；d d H2O 23.6μL； pGEX-6 p-1載體雙酶切體系中加PGEX-6P-1 15μL；ddH2O 18.6μL；然后分別置入37℃水浴箱中，保溫酶切12 h。取酶切后于1.7%的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察目的條帶并回收純化目的片段。

1.4 原核表達(dá)重組體pGEX-6 p-1/MG 427的構(gòu)建 將純化好的pGEX-6 p-1雙酶切產(chǎn)物 2.5μL與mg 427PCR純化產(chǎn)物6.0μL，加入T 4 DNA Linkage 0.5μL、T 4 buffer 1.0μL；置于22℃水循環(huán)儀中，連接30m in。之后轉(zhuǎn)化至宿主E.coliJM 109構(gòu)建pGEX-6 p-1/MG 427，經(jīng)培養(yǎng)篩選陽性克隆對重組體進(jìn)行擴(kuò)增、雙酶切及測序鑒定。

1.5 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 在mg 427基因序列中第289～291位核苷酸所組成的密碼子為TGA，為確保其在E.coli中表達(dá)，將其同義突變?yōu)門GG，突變引物如下：TB 1：5′—CGT GAA CTT AAC ATT CAC TGG GAA ATT CAC TCT CCT AAT G—3′，TB 2：5′—C ATT AGG AGA GTG AAT TTCGTG AAT GTT AAG TTC ACG—3 ，突變擴(kuò)增條件如下：95℃ 30 s；95℃ 50 s，55℃ 40 s，68℃ 5m in，共12個(gè)循環(huán)，68℃補(bǔ)全延伸10m in，4℃保存。在反應(yīng)體系中加1μLDpnI限制性內(nèi)切酶37℃下恒溫水浴箱孵育1 h消化目板質(zhì)粒DNA。將突變好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliXL-Blue。篩選陽性克隆對重組體進(jìn)行雙酶切及測序鑒定。

2 結(jié)果

2.1mg 427基因的擴(kuò)增 用特異性引物擴(kuò)增MG-37標(biāo)準(zhǔn)株目的基因mg427，獲得約426 bp大小條帶，與目的片段大小一致。見圖1。

圖1 瓊脂糖電泳分析mg427 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 pGEX-6 p-1/MG 427重組質(zhì)粒的鑒定 PCR擴(kuò)增重組好的pGEX-6 p-1/MG 427質(zhì)粒也可獲得約426 bp的片段；經(jīng)BamHI和NotI雙酶切重組質(zhì)粒，結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下可見：大片段接近5000 bp,小片段與目的基因長度426 bp相近，初步證明mg427目的基因成功地嵌入pGEX-6 p-1 載體中。見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-6 p-1/MG 427的酶切與PCR鑒定

2.3 重組質(zhì)粒目的基因測序 將重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行DNA序列測定，測序結(jié)果與GenBank所登錄的Mg G 37的mg 427序列進(jìn)行blast，結(jié)果顯示二者完全一致，且密碼子讀碼框架正確。

2.4 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變后目的基因測序 將突變后的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank所登錄的Mg G 37的mg 427序列進(jìn)行blast，在mg 427基因序列中第289～291位核苷酸所組成的密碼子為TGA突變?yōu)門GG，整個(gè)核苷酸序列未發(fā)生缺失、錯(cuò)配、移碼。

3 討論

支原體的致病機(jī)制主要包括掠奪宿主細(xì)胞營養(yǎng)成分、黏附或融合以及免疫病理引起的損傷。當(dāng)支原體感染宿主細(xì)胞后，能在原發(fā)部位產(chǎn)生ROS，包括超氧化物、H2O2以及有機(jī)氫過氧化物等(OHPS)[6-7]，這些物質(zhì)作用于DNA堿基或磷酸核糖部分，可引起病原體DNA不可逆的損傷[8-9],這要求支原體必須具備某些保護(hù)性機(jī)制以防止宿主對自身損傷，以維持其入侵宿主細(xì)胞，并能在在宿主內(nèi)形成慢性感染的過程中具有非常重要的意義。通過我們前期的生物信息學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在Mg種系群中也有Osm C的基因同源編碼序列mg 427存在，然而其功能目前尚未明了。

本研究以Mg G 37基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出mg 427基因序列，同時(shí)選用pGEX-6 P-1為表達(dá)載體，構(gòu)建pGEX-6 p-1/mg 427重組質(zhì)粒。由于Mg的一個(gè)重要的分子生物學(xué)特征是在其轉(zhuǎn)錄翻譯過程中以TGA作為色氨酸的密碼子，而在E.coli中TGA卻是轉(zhuǎn)錄終止的信號，這影響了Mg基因在E.coli中的表達(dá)。我們利用單點(diǎn)突變技術(shù)將TGA特異性突變?yōu)門GG。突變篩選后再行測序鑒定，確使該基因全序列在大腸埃希菌中得以高效表達(dá)。通過對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和進(jìn)一步的核苷酸序列分析，證實(shí)了插入序列與目的基因的一致性及讀碼框正確。在成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6 p-1/mg 427后，為后續(xù)進(jìn)一步研究生殖支原體的致癥機(jī)制提供了可能。

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