朱 勇，羅宗濤，周麗絨，吳銀良，江瀟瀟

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室 (寧波)，浙江寧波 315040;2.寧波市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，浙江寧波 315040)

豆芽是深受廣大消費者歡迎的食品，具有較高的營養(yǎng)價值。但因近年新聞媒體曝光市場豆芽存在的質(zhì)量安全隱患，如添加各類生長調(diào)節(jié)劑等，使豆芽質(zhì)量安全問題受到社會各界的廣泛關(guān)注。較為常見的添加劑為氯吡苯脲，是具有細(xì)胞分裂素活性的苯脲類植物生長調(diào)節(jié)劑，其生物活性卻較6-芐氨基嘌呤高10～100倍，能影響植物芽的發(fā)育，加速細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞增大和分化，防止果實和花的脫落的作用，從而促進(jìn)植物生長、早熟、延緩作物后期葉片的衰老、增加產(chǎn)量，廣泛用于農(nóng)業(yè)，園藝和果樹［1-3］。中國登記的使用氯吡脲的農(nóng)作物有6種，分別為黃瓜、西瓜、甜瓜、葡萄、獼猴桃和枇杷［4］。在日常的豆芽監(jiān)測中，時有個別樣品檢出氯吡脲這一事實也證明個別豆芽生產(chǎn)商拓展用途，將氯吡脲用于豆芽生產(chǎn)。

生產(chǎn)過程中氯吡脲使用濃度與豆芽體內(nèi)殘留量之間的關(guān)系、殘留風(fēng)險及快速檢測準(zhǔn)確定性的方法研究都至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

WatersUPLC-XEVO超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，Acquity BHE C18色譜柱 (美國Waters公司);DYJ-S6031豆芽機(jī) (廣東小熊電器有限公司);氯吡脲 (四川施特優(yōu)化工有限公司);氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號:68157-60-8，SIGMA公司);無水甲醇、甲酸均為色譜純試劑 (德國merck公司)。

供試綠豆為購自超市的上海裕田農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)的禾煜牌綠豆，黃豆為購自種子公司的當(dāng)年新豆。豆芽均在農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室 (寧波)實驗室內(nèi)采用小熊豆芽機(jī) (DYJS6031)孵化。

1.2 UPLC條件

色譜條件。Acquity BHE C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm，內(nèi)徑1.7μm);流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫條件:流動相B在0.5 min內(nèi)保持20%，然后在2.5 min內(nèi)上升到80%，保持1.5 min;再在0.1 min內(nèi)降至20%，保持 1.4 min;流速 0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。

質(zhì)譜條件。ESI源正負(fù)離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)，毛細(xì)管電壓2.0 kV，萃取錐孔電壓30 V，RF透鏡電壓0.5 V，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，錐孔氣流速50 L·h-1，脫溶劑氣流速1 000 L·h-1，倍增器電壓650 V，二級碰撞氣為氬氣，定性離子對m/z:248.2＞129.0*，248.2＞155.0(248.2為母離子，129.0為定量離子，129.0與155.0同為定性離子，*代表定量離子);錐孔電壓:24 V;碰撞能量:16，14 eV。

1.3 樣品制備

1.3.1 豆芽制作

綠豆芽、黃豆芽制作。分別稱取綠豆、黃豆各80 g，加水250 mL，浸泡3 h后，將豆均勻撒于豆芽機(jī)的培育盤上，豆芽機(jī)選擇“綠豆/黃豆，正?！边x項開機(jī)孵化，前5 h為泡豆階段，隔5 min噴水1次，5 h之后是培育時間，隔1 h噴水1次，噴水時間均為1 min，孵化水溫為26.4℃。上機(jī)后16，40 h，從培育盤中隨機(jī)選擇5顆豆芽，測量其芽長，然后將培育盤放入濃度梯度依次為0，0.02， 0.04， 0.08， 0.1， 0.2， 0.4， 0.8 和1.0 mg·L-1的氯吡脲溶液中浸泡，浸泡時間1 min，再次上機(jī)孵化，64 h后等豆芽成熟后再次隨機(jī)選擇5顆豆芽，測量其芽長，然后采收稱重。

1.3.2 氯吡脲提取

豆芽樣品打漿后，稱取5 g樣品，加入10 mL甲醇，勻漿，以5 000 r·min-1離心3 min后吸取上清液200μL，與800μL甲酸溶液混合均勻，過0.22μm濾膜后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

準(zhǔn)確配制1.0，2.0，5.0，10.0和20.0μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)濃度工作液，進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的檢出限、回收率和精密度

在綠豆芽和黃豆芽空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加3個濃度分別是0.01，0.10，1.00 mg·kg-1，每濃度添加3個樣品。按上述條件1.3.2進(jìn)行樣品處理，按1.2進(jìn)行樣品分析，測定加標(biāo)回收率，考察方法的準(zhǔn)確性和可靠性。結(jié)果表明，3個添加濃度的回收率分別為89.1%，81.9%和81.7%，均在70%～120%，批內(nèi)變異系數(shù)分別為4.2%，4.0%和 3.9%，均小于 10%，檢測限均為0.001 mg·kg-1，可滿足風(fēng)險評估樣品監(jiān)測的要求。

2.2 豆芽中氯吡脲的分析結(jié)果

2.2.1 氯吡脲對綠豆芽的生長影響

從表1可知，與未使用氯吡脲的對照比較，孵化綠豆芽使用浸泡氯吡脲溶液濃度在0.02～1.00 mg·L-1，在生長初期16 h，由于綠豆芽還未浸泡氯吡脲，所以胚軸長度上相差不大，直徑也相差不大，此時胚根還未長出來;第1次浸泡后24 h(上機(jī)40 h，)再次測量，與對照相比胚根胚軸沒有更長反而有縮短的跡象;第2次浸泡后24 h(上機(jī)64 h)后，綠豆芽成熟，使用了氯吡脲的豆芽比對照組胚根和胚軸更短，豆芽更粗，隨著浸泡濃度的增加，胚根胚軸都有縮短的跡象，抑制效果明顯。將采收后的綠豆芽稱重，采用0.02 mg·L-1氯吡脲浸泡的綠豆產(chǎn)量最大，隨著浸泡濃度的增加，綠豆芽的產(chǎn)量均有一定程度的下降。這與朱杰麗等［5］在研究氯吡脲對楊梅果實生長時發(fā)現(xiàn)過高濃度反而對楊梅產(chǎn)生偏生、偏小、偏少的情況相吻合。

表1 氯吡脲對綠豆芽孵化的影響

2.2.2 氯吡脲對黃豆芽的生長影響

從綠豆芽的孵化結(jié)果來看，浸泡的氯吡脲濃度超過0.10 mg·L-1后，生長趨勢反而抑制，短小很多。

在黃豆芽試驗中，將氯吡脲的最高濃度設(shè)在0.10 mg·L-1。黃豆芽孵化使用的氯吡脲溶液濃度為0.02～0.10 mg·L-1，黃豆芽試驗的結(jié)果與綠豆芽相類似 (表2)。

表2 黃豆芽孵化時使用氯吡脲的試驗結(jié)果

在生長初期16 h，由于黃豆芽此時均未浸泡氯吡脲，所以胚軸長度上相差不大，直徑也相差不大，此時胚根還未長出來;在第1次浸泡后24 h(上機(jī)40 h，)再次測量，與對照相組比較其胚軸、胚根有縮短的跡象，但無規(guī)律;在第2次浸泡后24 h(上機(jī)64 h)黃豆芽成熟，浸泡了氯吡脲的黃豆芽比對照組胚軸變短，特別是浸泡濃度為0.10 mg·L-1時，縮短25%，胚根變化不大;但浸泡過氯吡脲后黃豆芽胚軸直徑均比對照組粗。低濃度的氯吡脲溶液能促進(jìn)黃豆芽胚軸的伸長，但隨著氯吡脲濃度的增加，抑制效果明顯，反應(yīng)在采收后的重量上，采用0.02 mg·L-1濃度浸泡后的黃豆產(chǎn)量最大，隨著浸泡濃度的增加，黃豆芽的產(chǎn)量均有一定程度的下降。

2.2.3 氯吡脲在豆芽的殘留風(fēng)險

氯吡脲是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，據(jù)國內(nèi)外現(xiàn)有的毒理評估資料，對哺乳動物毒性低。氯吡脲對鼠的急性經(jīng)口LD50為4 902 mg·kg-1bw，屬于低毒;兔急性經(jīng)皮LD50≥ 2 000 mg·kg-1bw，也屬于低毒，鼠急性吸入LC50≥3.0 mg·L-1，屬于無毒;兔眼睛刺激性為中等強(qiáng)度，但對皮膚無刺激性;鳥類急性經(jīng)口LD50≥2 250 mg·kg-1，亞急性LC50≥5 620 mg·kg-1，均為低毒;對冷水魚和溫水魚，LC50＞9.2和8.8 mg·kg-1，屬于中等毒性。慢性和亞慢性試驗結(jié)果表明，氯吡脲只對鼠腎臟有輕微的影響，而對其他器官無影響，也無神經(jīng)毒性、致癌或內(nèi)分泌干擾毒性。歐盟、美國、澳大利亞和日本評估后規(guī)定氯吡脲每日允許攝入量 (ADI)值分別為 0.05，0.07，0.07 和 0.093 mg·kg-1bw［6-9］。

按照國際上普遍認(rèn)可的分析評估原理和方法，用式 (1)估計每日攝入量 (EDI)，慢性攝入風(fēng)險用式 (2)，估計每日攝入量占ADI的百分率表示:

當(dāng)風(fēng)險商＞100時，表示存在不可接受的較大風(fēng)險，數(shù)值越大，風(fēng)險越大;當(dāng)風(fēng)險商≤100時，表示風(fēng)險可以接受，數(shù)值越小，風(fēng)險越小。

以本次豆芽機(jī)孵化黃綠豆芽為例，豆芽體內(nèi)所含氯吡脲濃度隨著浸泡液濃度的增加而上升，浸泡溶液為1.0 mg·L-1時，綠豆芽最高殘留量為0.035 mg·kg-1，以綠豆芽黃豆芽產(chǎn)量最大的0.02 mg·L-1浸泡濃度，綠豆芽體內(nèi)含0.002 mg·kg-1，黃豆芽含0.003 mg·kg-1，約為氯吡脲濃度的10%～15%，殘留量不高。

根據(jù)表3，不同年齡階段消費人群的體重以及蔬菜消費量，同時根據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的調(diào)查估算數(shù)據(jù)，我國成年人豆芽平均每日消費量15 g左右，兒童按成人的1/2計，按實驗室豆芽機(jī)的黃豆芽0.003 mg·kg-1殘留量為Ci，同時以最為嚴(yán)格的歐盟ADI值為考量，以食用實驗室豆芽機(jī)孵化豆芽的作為情形1，氯吡脲的風(fēng)險商在各年齡段在0.0013%～0.0035%;如果假設(shè)所有年齡段人群每天消費的所有蔬菜均為實驗室豆芽機(jī)孵化的豆芽作為情形2，氯吡脲的各類人群攝入量也只有 0.014～0.030μg·kg-1，僅占 ADI值的0.027% ～0.059%，此數(shù)據(jù)與張志恒等［10］報道的氯吡脲在果蔬中的慢性膳食攝入風(fēng)險相吻合。所以即使按照最大風(fēng)險原則每天消費的蔬菜均為含

式中:EDI為估計每日攝入量 (μg·kg-1bw);Ci為第i種食物的平均殘留值 (mg·kg-1);Fi為第 i種食物的消費量 (g·d-1);bw為體重 (kg)。0.003 mg·kg-1殘留量進(jìn)行評估，各類人群的氯吡脲攝入量也遠(yuǎn)低于每日允許攝入量，通過實驗室豆芽機(jī)孵化出的豆芽風(fēng)險可以接受 (表3)。居民實際食用豆芽的量與上述的調(diào)查數(shù)據(jù)會有出入，但考慮到上述的評估已顯示氯吡脲的膳食風(fēng)險很低，因此對最終結(jié)論基本沒有影響。

表3 不同年齡階段消費人群的體重、蔬菜消費量及氯吡脲風(fēng)險

3 小結(jié)與討論

豆芽生長中單獨使用氯吡脲的效果不明顯，0.02 mg·L-1的氯吡脲浸泡對產(chǎn)量的增加有作用，隨著浸泡液濃度的增加，抑制效果開始產(chǎn)生，作為一種具有細(xì)胞分裂素活性的苯脲類植物生長調(diào)節(jié)劑，其生物活性較6-芐氨基嘌呤高10～100倍，所以使用的濃度很低，從實驗效果看增產(chǎn)作用不明顯，故與其他植物生長調(diào)節(jié)劑混合使用的概率較大。以濃度為0.02 mg·L-1浸泡液為例，豆芽中殘留量僅為0.003 mg·kg-1，即使按照最大風(fēng)險原則進(jìn)行評估，各類人群的氯吡脲攝入量也遠(yuǎn)低于每日允許攝入量，風(fēng)險可以接受。

［1］ 朱杰麗，楊柳，柴振林，等.氯吡脲對“徐香”獼猴桃果實品質(zhì)的影響［J］.福建林業(yè)科技，2014(1):113-115，165.

［2］ 張立恒，高秀巖，潘鳳榮，等.赤霉素與氯吡脲對“早霞玫瑰”葡萄無核化及果實品質(zhì)的影響 ［J］.北方園藝，2014(14):25-27.

［3］ 宋新，丁璞，李先寬，等.氯吡脲對五味子果實形態(tài)和木脂素的影響 ［J］.中國中藥雜志，2015，39(9):1579-1583.

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.農(nóng)藥電子查詢服務(wù)系統(tǒng) ［DB/OL］.http://www.ny100.cn/.2011-09-14.

［5］ 朱杰麗，楊柳，柴振林，等.不同濃度氯吡脲對東魁楊梅果實生長及品質(zhì)影響 ［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(12):172-174.

［6］ European Commission Health ＆ Consumer Protection Directorate-General.Review report for the active substance forchlorfenuron［R/OL］. (2005-09-23) http://ec.europa.eu/food/plant/protection/evaluation/newactive/forchlorfenuron_draft_review_report.pdf.2011-09-14.

［7］ United States Environmental Protection Agency.Pesticide fact sheet:forchlorfenuron［R/OL］.(2004-09).http://www.epa. gov/opprd001/factsheets/forchlorfenuron. pdf. 2011-09-14.

［8］ Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority.Publicrelease summary on evaluation of the new active forchlorfenuron ［R/OL］.(2005-09).http://www.apvma.gov.au/registration/assessment/docs/prs_forchlor-fenuron.pdf.2011-09-14.

［9］ 協(xié)和醗酵工業(yè)株式會社バイオケミカル事業(yè)本部.ホルクロルフェニュロンの毒性試験の概要［R/OL］.(1998-02-02)http://wwwsoc.nii.ac.jp/pssj2/journal/tec_info/forchlor.pdf.2011-09-14.

［10］ 張志恒，湯濤，徐浩，等.果蔬中氯吡脲殘留的膳食攝入風(fēng)險評估［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(10):1982-1991.