陳宏武，王曙東，3

(1.鹽城工業(yè)職業(yè)技術學院紡織服裝學院，江蘇 鹽城 224005;2.鹽城工業(yè)職業(yè)技術學院生態(tài)紡織研發(fā)工程中心，江蘇 鹽城 224005;3.蘇州大學紡織與服裝學院，江蘇 蘇州 215123)

蠶絲的使用有上千年的歷史，因其產(chǎn)量豐富，有良好的力學性能、珍珠般的光澤、柔和的手感，享有纖維皇后的美譽［1－3］。蠶絲纖維主要由30%的絲膠蛋白和70%的絲素蛋白構成，作為蠶絲纖維最主要的成分，絲素蛋白(又稱蠶絲蛋白)因其優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，良好的透氣透濕性，無毒、無刺激性和良好的力學性能［4－5］，已成為當前的研究熱點。目前國內(nèi)外已有大量關于絲蛋白支架材料的研究報道，如蠶絲蛋白凝膠［6］、蠶絲蛋白納米纖維［7］、蠶 絲 蛋白海綿支架［8］、蠶絲蛋白微球［9］、蠶絲蛋白粉末［10］、蠶絲蛋白膜［11］和蠶絲蛋白管［12］等，被廣泛應用于組織工程支架材料［13］、藥物緩釋材料［14］、光子晶體材料［15］、電子器件［16］等領域。蠶絲蛋白水凝膠因其制備技術簡單成熟，與細胞的親和性好，植入機體內(nèi)不會產(chǎn)生免疫排斥反應，可生物降解易吸收等優(yōu)點，引起了國內(nèi)外學者極大的興趣，并被廣泛應用于各種機體組織的修復。

本文從蠶絲蛋白水凝膠的制備方法、蠶絲蛋白基水凝膠及其力學性能、凝膠成型機制、蠶絲蛋白水凝膠的快速成型等方面結合本課題組對蠶絲蛋白水凝膠的相關研究對蠶絲蛋白水凝膠的研究進展進行了綜述。

1 蠶絲蛋白水凝膠的制備方法

蠶絲蛋白水凝膠是由蠶絲蛋白水溶液通過不同的凝膠方法制備而成。而蠶絲蛋白水溶液的制備已非常成熟并不斷優(yōu)化，即蠶繭(或蠶絲)經(jīng)碳酸鈉(或碳酸氫鈉)脫膠去除絲膠后經(jīng)溶解體系溶解，用去離子水透析可制得蠶絲蛋白水溶液。常用的溶解體系為三元溶劑(乙醇-碳酸鈣-水)和溴化鋰水溶液。圖1示出采用溴化鋰溶解體系制備的蠶絲蛋白水溶液［17］。蠶絲蛋白水溶液經(jīng)旋流剪切、超聲振蕩、酸(離子液體或表面活性劑)處理、濃縮(或自然凝膠)、通過電流等可制備蠶絲蛋白水凝膠。

圖1 蠶絲蛋白水溶液的制備Fig.1 Preparation of silk fibroin solution and hydrogels

1.1 旋流剪切凝膠

旋流剪切凝膠方法較為簡單，即采用渦旋振蕩器對絲蛋白溶液進行高速的旋流剪切振蕩(如圖2所示)，振蕩后凝膠成為蠶絲蛋白水凝膠。Yucel等［18］采用旋流剪切凝膠的方法制備了蠶絲蛋白水凝膠，渦旋振蕩器的旋流剪切頻率為3200 r/min，研究了旋流剪切時間對蠶絲蛋白水凝膠的二級結構以及凝膠黏彈性的影響。Rockwood等［17］認為將蠶絲蛋白水溶液與細胞復合，可制備蠶絲蛋白細胞復合凝膠體系。

圖2 旋流剪切制備蠶絲蛋白凝膠Fig.2 Preparation of vortexed silk fibroin gels

1.2 超聲凝膠

超聲凝膠方法即采用超聲波振蕩器對蠶絲蛋白水溶液進行處理。Wang等［19］采用功率為450W的超聲振蕩器對蠶絲蛋白水溶液進行振蕩處理，獲得蠶絲蛋白水凝膠，并研究了超聲振蕩的凝膠機制以及蠶絲蛋白水凝膠的細胞親和性。Hu等［20］采用超聲振蕩法制備蠶絲蛋白/透明質酸復合水凝膠，并研究了復合凝膠的二級結構和生物相容性。

1.3 酸凝膠

酸凝膠是將一些弱酸、離子液體、表面活性劑等化學試劑加入到蠶絲蛋白水溶液中以改變蠶絲蛋白的二級結構，從而使蠶絲蛋白水溶液凝膠。Yucel等［21］向質量分數(shù)為7.3%的蠶絲蛋白水溶液中滴入稀釋的鹽酸溶液以調整蠶絲蛋白水溶液的pH值，達到制備蠶絲蛋白水凝膠的目的，研究了pH值對蠶絲蛋白水凝膠黏彈性的影響和酸凝膠機制，比較了幾種常見凝膠方法對蠶絲蛋白二級結構的影響。Silva等［22］采用向蠶絲蛋白基水溶液滴加離子液體的方法，制備了殼聚糖/蠶絲蛋白復合水凝膠，研究了離子液體加入量對復合凝膠體系二級結構和黏彈性的影響。Wu等［23］向蠶絲蛋白水溶液中加入十二烷基硫酸鈉，使得蠶絲蛋白快速凝膠，并著重研究了該方法的凝膠機制。

1.4 濃縮凝膠和自然凝膠

濃縮凝膠是將一定質量分數(shù)(通常為3% ～8%)的蠶絲蛋白水溶液置于再生纖維素透析袋中，然后將該透析袋置于聚乙二醇的水溶液中，使得聚乙二醇溶液從蠶絲蛋白水溶液中不斷進行吸水，蠶絲蛋白水溶液不斷濃縮以達到凝膠的目的，凝膠時間通常要1～2 d。自然凝膠是將蠶絲蛋白水溶液置于流通的空氣中或置于冰箱保鮮層中一段時間后自行凝膠的現(xiàn)象，但是自然凝膠通常需要1個月以上的時間。這種方法存在凝膠周期長、凝膠質量較差的問題，作為生物醫(yī)用材料的蠶絲蛋白水凝膠不宜采用該種方法。

1.5 電凝膠

電凝膠是將直流電源(通常為15～30 V)的正負極通入蠶絲蛋白水凝膠中，蠶絲蛋白水凝膠會逐漸集聚到直流電源的正極。圖3示出采用30 V的直流電源通入蠶絲蛋白水溶液中的集聚現(xiàn)象。由圖可見，在直流電源的正極(石墨板)逐漸集聚一層蠶絲蛋白水凝膠，且隨著時間的延長，蠶絲蛋白水凝膠逐漸增大。

圖3 蠶絲蛋白電凝膠Fig.3 Preparation of silk fibroin electrogels

Leisk等［24］研究表明采用電凝膠制備蠶絲蛋白水凝膠是一個可逆的過程(如圖4所示)，即當交換通入電源的正負極時，原集聚在電源正極的蠶絲蛋白水凝膠逐漸消失，但又不斷地積聚到新的電源正極(原負極)上。

圖4 蠶絲蛋白電凝膠的可逆現(xiàn)象Fig.4 Reversible phenomenon in process of silk fibroin electrogel

綜上所述，制備蠶絲蛋白水凝膠的方法多種多樣，旋流剪切凝膠和超聲凝膠會在一定程度上破壞蠶絲蛋白大分子結構;酸、離子液體、表面活性劑的加入也會在一定程度上影響蠶絲蛋白水凝膠的生物相容性;濃縮凝膠的時間較長;電凝膠方法簡單、效率較高，不破壞蠶絲蛋白大分子結構、不影響蠶絲蛋白生物相容性，且存在可逆現(xiàn)象，因此本文認為電凝膠是制備蠶絲蛋白水凝膠的理想方法。

2 蠶絲蛋白水凝膠形成機制

Kim等［25］研究表明蠶絲蛋白水凝膠的形成機制是由于蠶絲蛋白大分子鏈相互之間存在作用力，這些作用力主要包含疏水基團之間的相互作用力和氫鍵等相互作用力。當受到外界因素(電場、超聲、酸等)作用時，蠶絲蛋白分子鏈之間更易形成相互作用力，導致蠶絲蛋白大分子鏈之間形成物理交聯(lián)，生成蠶絲蛋白凝膠。Lu等［26］研究了蠶絲蛋白水凝膠的電凝膠機制，研究結果表明正常狀態(tài)下蠶絲蛋白水溶液中蠶絲蛋白無規(guī)卷曲部分的負電荷在蠶絲蛋白大分子鏈中占據(jù)主導地位，溶液的pH值大于蛋白質的等電點(pI)，分子間相互排斥阻止了分子間相互作用形成β折疊結構(如圖5所示)。此時蠶絲蛋白呈溶液狀態(tài)。當給蠶絲蛋白水溶液施加電場后，蠶絲蛋白水溶液中的電源正極附近的質子濃度逐漸增加，導致該區(qū)域的pH值小于蛋白質的等電點，蠶絲蛋白大分子鏈之間相互作用形成β折疊結構，并逐漸交聯(lián)形成蠶絲蛋白膠束(微球)。蠶絲蛋白膠束(微球)的形貌如圖6所示。

圖5 蠶絲蛋白水凝膠形成機制示意圖Fig.5 Mechanism of electrogels of silk fibroin

圖6 蠶絲蛋白膠束(微球)的形貌結構Fig.6 Morphology of silk fibroin micelle.(a)SEM image of silk fibroin micelle;(b)AFM image of silk fibroin micelle

蠶絲蛋白膠束的數(shù)量不斷增加，逐漸形成了蠶絲蛋白水凝膠。Wang等［19］研究了蠶絲蛋白水凝膠超聲凝膠機制，如圖7所示。研究結果表明由于超聲波振蕩導致蠶絲蛋白大分子鏈中的β折疊結構(疏水基團之間的相互作用)逐漸增加并相互交聯(lián)逐漸形成蠶絲蛋白水凝膠。

圖7 蠶絲蛋白水凝膠的超聲凝膠機制Fig.7 Mechanism of ultrasonic-induced silk fibroin gel

綜上所述，無論是哪種方法制備的蠶絲蛋白水凝膠，其主要機制均是通過蠶絲蛋白大分子之間相互作用形成β折疊結構，導致蠶絲大分子鏈之間相互糾纏、集聚，形成蠶絲蛋白微球膠束，隨著為微球膠束的集聚逐漸形成凝膠。

3 蠶絲蛋白復合水凝膠

蠶絲蛋白具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，但也存在材料力學性能差，凝膠質量低，效率低，對骨支架修復存在缺陷，抗菌性能差，吸水(保水)性差(親水性差)等缺陷，為改善這些缺陷，研究人員常采用一些功能性納米材料或功能性高聚物材料對蠶絲蛋白水凝膠進行改性(如表1所示)。

Huang等［27］將氧化石墨烯共混加入蠶絲蛋白中制備了蠶絲蛋白/氧化石墨烯復合凝膠體系，研究結果表明氧化石墨烯的共混極大地增加了蠶絲蛋白水凝膠的力學強度，控制適當?shù)难趸┕不毂壤梢允箯秃夏z體系的斷裂強度增加至純絲蛋白凝膠的5倍。Huang等［28］采用旋流剪切法制備了蠶絲蛋白/聚氨酯復合水凝膠，研究結果表明聚氨酯與蠶絲蛋白具有良好的相容性，且聚氨酯的共混改善了蠶絲蛋白硬脆的特性，復合凝膠體系的柔性有了較大的改善。

Gong等［29］采用超聲法制備了蠶絲蛋白/羥基纖維素復合凝膠體系，羥基纖維素的混入改善了凝膠質量，縮短了凝膠時間。Kojic等［30］在蠶絲蛋白水凝膠中摻雜金納米粒子，研究結果表明摻雜了金納米粒子的蠶絲蛋白水凝膠具有優(yōu)異的抗菌性能，用于組織修復時可避免細菌感染。Kim等［31］和Ming等［32］將羥基磷灰石與蠶絲蛋白復合制備蠶絲蛋白/羥基磷灰石復合水凝膠體系，研究結果表明羥基磷灰石的共混有效地模擬了骨的成分，更利于骨細胞的培養(yǎng)。Vasconcelos等［33］將彈性蛋白共混至蠶絲蛋白水凝膠中促進了傷口的愈合。Mandal等［34］制備了蠶絲蛋白/聚丙烯酰胺復合水凝膠，聚丙烯酰胺的復合改善了凝膠體系的親水性，更加有利于后續(xù)細胞培養(yǎng)實驗。Hu等［20］采用超聲法制備了蠶絲蛋白/透明質酸復合凝膠，研究結果表明透明質酸的共混增加了材料的吸水保水性，提高了凝膠的蓬潤性。

表1 高分子材料復合對蠶絲蛋白水凝膠的修飾改性Tab.1 Modification of silk fibroin hydrogels by blending of polymers

綜上所述，因蠶絲蛋白本身固有的缺陷，單純的蠶絲蛋白水凝膠支架應用于生物醫(yī)用材料常常受到限制，因此將蠶絲蛋白水凝膠與一種乃至多種功能性材料復合是目前以及今后的研究趨勢。

4 蠶絲蛋白水凝膠的力學性能

作為生物醫(yī)用支架材料需擁有良好的力學性能，因此蠶絲蛋白水凝膠的力學性能是在制備蠶絲蛋白水凝膠及其應用過程中需著重考慮的問題。Leisk等［24］研究表明蠶絲蛋白水凝膠較蠶絲蛋白水溶液具有較高的強度和模量，但是由于蠶絲蛋白水凝膠力學強度差、硬脆等問題，極大的限制了蠶絲蛋白水凝膠的應用;因此有必要通過一些物理、化學等方法改善蠶絲蛋白水凝膠的力學性能。

Huang等［27］將功能材料氧化石墨烯共混至蠶絲蛋白水凝膠體系中，研究結果表明控制適當?shù)难趸┕不毂壤梢猿杀兜卦黾有Q絲蛋白水凝膠的斷裂強度。Ghosh等［35］將制備的蠶絲蛋白水凝膠置于采用有機醇(甲醇)處理，研究結果表明，有機醇處理同樣可以成倍地增加蠶絲蛋白水凝膠的力學性能。

綜上所述，雖然蠶絲蛋白水凝膠較蠶絲蛋白水溶液的力學性能有較大的改善，但仍需通過一定的物理或化學方法進行改善，才能更好地應用于生物醫(yī)用材料領域。

5 蠶絲蛋白水凝膠快速成型研究

蠶絲蛋白水凝膠作為組織工程之家修復材料需要有良好的結構穩(wěn)定性、優(yōu)異的力學性能，上述方法制備的蠶絲蛋白水凝膠存在凝膠成型慢，結構不穩(wěn)定等問題，因此需要通過特定的快速成型方法來提高蠶絲蛋白水凝膠的結構穩(wěn)定性。目前國內(nèi)外有關蠶絲蛋白水凝膠快速成型方法主要有光固化、有機醇處理、環(huán)氧樹脂固化等。Kundu等［36］制備了蠶絲蛋白/聚乙烯醇復合水凝膠體系，并采用光敏引發(fā)劑Irgacure作為中間體，將凝膠體系置于紫外光燈下照射15 min，制備了結構穩(wěn)定、成型較好的蠶絲蛋白水凝膠體系。Ghosh等［35］將制備的蠶絲蛋白水凝膠置于甲醇中處理，獲得了結構較為穩(wěn)定的蠶絲蛋白凝膠支架。

本文作者也開展了蠶絲蛋白水凝膠快速成型的相關研究，采用電凝膠方法制備了蠶絲蛋白水凝膠體系，并用乙醇處理、紫外光固化等方法研究了蠶絲蛋白水凝膠的快速成型。本文采用流變儀測定了不同蠶絲蛋白體系的儲存模量和力學性能(反映了材料的結構穩(wěn)定性)，結果見圖8。由圖可見，蠶絲蛋白電凝膠的儲存模量要優(yōu)于蠶絲蛋白水溶液體系，而經(jīng)乙醇處理后(處理10 min)的蠶絲蛋白水凝膠的儲存模量明顯高于未經(jīng)處理的蠶絲蛋白水凝膠，表明經(jīng)乙醇處理后蠶絲蛋白水凝膠成型較好，結構較穩(wěn)定。而經(jīng)紫外光固化后(光固化1 min)的蠶絲蛋白凝膠體系的儲存模量要遠高于蠶絲蛋白凝膠和經(jīng)乙醇處理后的凝膠體系，顯示出光固化蠶絲蛋白凝膠體系的成型較好、成型速度快且結構穩(wěn)定。

圖8 不同蠶絲蛋白體系的儲存模量Fig.8 Storage modulus of different silk fibroin systems

圖9 不同蠶絲蛋白體系的力學性能Fig.9 Mechanical properties of different silk fibroin system

圖9示出不同蠶絲蛋白體系的力學性能。由圖可見，經(jīng)乙醇處理后的蠶絲蛋白凝膠體系的斷裂強度為6.5 MPa，較未經(jīng)處理蠶絲蛋白水凝膠的斷裂強度(3.2 MPa)增加了1倍以上，表明經(jīng)乙醇處理后蠶絲蛋白水凝膠成型較好，結構較穩(wěn)定。而經(jīng)紫外光固化后的蠶絲蛋白水凝膠的斷裂強度達到7.8 MPa，較未經(jīng)處理的蠶絲蛋白水凝膠的斷裂強度增加了2倍以上，同樣顯示出光固化蠶絲蛋白凝膠體系的成型較好、成型速度快且結構穩(wěn)定。

綜合文獻分析，蠶絲蛋白水凝膠體系存在制備效率較低、結構(性能)不可控、工序繁瑣、費用高昂等缺點，將蠶絲蛋白水凝膠復合體系與當前熱門的三維生物打印技術相結合，通過三維生物打印蠶絲蛋白水凝膠，制備結構、尺寸、材料組分可控的蠶絲蛋白水凝膠生物支架材料。主要對蠶絲蛋白水凝膠在打印過程中的快速凝膠成型機制進行研究，著重解決打印過程中凝膠、結構、尺寸、組分以及表面生物兼容性控制與三維打印技術的集成等難點。

6 結語

采用對蠶絲蛋白水溶液旋流剪切、超聲振蕩、酸處理、濃縮、施加電場等方法可成功制備蠶絲蛋白水凝膠。采用一些功能性納米材料或功能性高聚物材料對蠶絲蛋白水凝膠進行改性。蠶絲蛋白水凝膠的快速成型是蠶絲蛋白水凝膠應用于組織修復的關鍵，可采用光固化、有機醇處理、環(huán)氧樹脂固化等方法來實現(xiàn)蠶絲蛋白水凝膠的快速固化成型。本文詳細地介紹了蠶絲蛋白水凝膠的制備方法、凝膠機制、改性處理、快速成型方法，并結合目前本課題組三維生物打印蠶絲蛋白水凝膠制備結構與性能可控的支架材料，為蠶絲蛋白水凝膠更廣泛的應用于臨床提供了思路。

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