任 娜，劉 杰，吳 倫，田振坤

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040)

正交實驗法確定坤凈泡騰膠囊栓最優(yōu)提取方案

任 娜，劉 杰，吳 倫，田振坤

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040)

通過正交設(shè)計法與紫外可見分光光度法確定坤凈泡騰膠囊栓提取的最優(yōu)方案.采用L9(34)正交實驗法設(shè)計實驗，以柴胡總皂苷的得率為考察指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)作為考察因素，各因素取3個水平進行考察，采用紫外可見分光光度法，以柴胡皂苷d為對照品，在波長543 nm處對樣品中的總皂苷進行測定，進行統(tǒng)計分析，篩選最優(yōu)工藝.最優(yōu)的提取條件為12倍量80%的乙醇，提取3次，每次0.5 h.優(yōu)選后的提取工藝柴胡總皂苷的提取效率最高，可增加各處方藥材的利用率.

正交實驗法；坤凈泡騰膠囊栓；柴胡總皂苷；最優(yōu)提取方案

當(dāng)今社會，陰道炎、宮頸炎、宮頸糜爛等婦科疾病困擾著越來越多的女性，給廣大女性的工作生活帶來很多不便.許多專家學(xué)者對這一方面的疾病進行了研究，而坤凈泡騰膠囊栓是由柴胡、火絨草、呋喃唑酮等中西藥混合而成的一種栓劑，專門治療陰道炎、宮頸炎、宮頸糜爛的女性疾病.具有清熱燥濕，去腐生肌的功能.泡騰膠囊栓的君藥是柴胡、火絨草和呋喃唑酮，柴胡中的柴胡皂苷d為藥材的主要藥理活性成分[1]，故以柴胡皂苷d作為研究指標(biāo)進行總皂苷量的測定.采用正交實驗法L9(34)優(yōu)化提取條件，以柴胡皂苷d的量作為指標(biāo)測定，研究并確定坤凈泡騰膠囊栓的最佳提取工藝.

1 實驗材料和儀器

柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品(批號：110778-200402)：由中國藥品生物制品檢定所提供；電子分析天平(萬分之一)：Mettler Toledo AL204；DT系列電子天平：中國江蘇常熟長青儀器儀表廠；756P型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；對二甲氨基苯甲醛、甲醇等均為分析純.柴胡購于哈爾濱市松茂藥材站，經(jīng)鑒定為傘形科柴胡屬植物北柴胡(bup-leurumchinense DC.)的根.

2 方法與結(jié)果

2.1.1檢測波長的選擇

以甲醇配制一定質(zhì)量濃度的柴胡皂苷d溶液，精密吸取0.2 mL加入0.1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL70 ℃反應(yīng)10 min，冷卻，加入磷酸4.0 mL70 ℃反應(yīng)30 min，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010年版一部附錄VA)于200～800 nm范圍內(nèi)進行波長掃描.結(jié)果在543 nm處，有最大吸收峰，故確定檢測波長為543 nm.結(jié)果見圖1.

圖1 柴胡皂苷d的檢測波長

2.1.2對照品溶液的制備

精密稱取5.00 mg柴胡皂苷d對照品，用甲醇定容到5 mL容量瓶中，制成1 mg/mL的溶液，搖勻，即得.

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL分別置10mL具塞試管中，加甲醇稀釋至1 mL，加入0.1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液1 mL搖勻，于70 ℃反應(yīng)10 min，取出，放冷，加入磷酸5.0 mL 70 ℃反應(yīng)30 min，取出，放冷，于543 nm處測定吸收度.以吸收度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，柴胡皂苷d的質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：A=0.79 244C-0.004 09，r2=0.999 74.表明在0.1～1mg范圍內(nèi)柴胡皂苷d的量與吸收度值呈良好的線性關(guān)系.

2.1.4精密度試驗

近年來，中央及各地政府機構(gòu)加大財政投入，加強資源整合，在農(nóng)村地區(qū)開展衛(wèi)生治理、村莊環(huán)境建設(shè)、道路修建等一系列基礎(chǔ)建設(shè)工作，使得鄉(xiāng)村呈現(xiàn)出天藍、水綠、村民安居樂業(yè)的美好景象。

精密吸取0.6 mL對照品溶液，置10 mL具塞試管中，加甲醇至1.0 mL，制成0.6 mg/mL對照品溶液，按“2.1.3”項方法操作，于543 nm處測定吸收度，測定6次.計算對照品的RSD值為0.26%.

2.1.5穩(wěn)定性試驗

取精密度項下的第6號樣品按“2.1.3”項方法操作，于0、6、12、24、36、48 h測定吸收度.結(jié)果RSD為0.19%.對照品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.1.6重復(fù)性試驗

平行吸取6份0.6 mL對照品溶液，置10 mL具塞試管中，加甲醇至1.0 mL，制成0.6 mg/mL對照品溶液，制備供試品溶液，按“2.1.3”項方法操作進行測定.計算RSD值為0.19%，表明重現(xiàn)性良好.

2.1.7加樣回收率試驗

精密稱取已知量的同一批樣品9份，按照高、中、低劑量加入柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.1.3”項方法操作并測定.結(jié)果的平均回收率為99.85%，RSD為0.29%.

2.2 正交試驗

2.2.1正交設(shè)計

根據(jù)預(yù)試驗和文獻[2-4]報道，影響中藥有效成分提取工藝的主要因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時間等.本研究以柴胡總皂苷的量作為測定指標(biāo)，每個因素各取3個水平，進行L9(34)正交試驗，因素水平見表1.

表1 各因素水平表

水平乙醇體積分?jǐn)?shù)/%乙醇用量/倍提取次數(shù)提取時間/hABCD123607080610121230．51．52 0

2.2.2結(jié)果分析

直觀分析：通過比較各因素的極差值可以看出，影響柴胡總皂苷的因素順序為A>B>D>C，最佳提取條件是A3B3C2D1.具體結(jié)果見表2.

表2 九次實驗柴胡總皂苷測定結(jié)果

實驗號因素ABCD柴胡總皂苷的量/%1111112．69212229．963133312．5654212315．5995223114．046231215．8767313217．5248321318．0569332121．128I11．73815．27115．54115．953II15．17214．01915．56214．453III18．90316．52314．71015．407極差R7．1652．5040．8521．500

方差分析：可以看出影響總皂苷的量的因素中，A和B差異有顯著性(P<0.05)，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量對總皂苷量的影響顯著，其他因素未見有顯著影響.四因素的影響大小依次為A>B>C>D.具體結(jié)果見表3.

表3 各因素方差分析表

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性乙醇體積77．036254．32719．000P<0．05分?jǐn)?shù)9．40826．63519．000P<0．05分?jǐn)?shù)3．45522．43719．000提取次數(shù)1．41821．00019．000提取時間誤差1 422

注:F0.05(2, 2) = 19F0.01(2, 2) = 99.

綜合直觀分析和方差分析，最優(yōu)工藝為A3B2C1D3，即10倍量80%乙醇提取1次，每次2 h，但考慮柴胡皂苷為主要的藥效成分和實際生產(chǎn)情況，最終確定的最佳提取條件為：A3B3C3D1，即用12倍量的80%體積分?jǐn)?shù)乙醇提取3次，每次0.5 h.

2.2.3工藝驗證

按最優(yōu)提取條件進行驗證試驗，結(jié)果證明所選工藝條件提取率最高，吸光度為1.755，柴胡總皂苷的量為18.871%.

3 討 論

正交設(shè)計是一種高效率、快速、經(jīng)濟的設(shè)計方法.L9(34)正交試驗設(shè)計，通過比較醇提量、醇提體積、提取時間和提取次數(shù)，以柴胡皂苷d為測量指標(biāo)，用紫外分光光度法進行測量，對工藝進行優(yōu)化.皂苷類是柴胡的主要成分之一.實驗結(jié)果表明，4個因素中對提取率影響最為顯著的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇用量.在實驗范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，用量越大，柴胡皂苷d的量越高.而提取次數(shù)和提取時間比較不明顯，可能和乙醇揮發(fā)，提取劑質(zhì)量濃度降低有關(guān).本文采用文獻[5-6]中對二甲氨基苯甲醛-磷酸法則測定柴胡中柴胡皂苷d的量，從驗證結(jié)果可以看出，最佳工藝的提取效果穩(wěn)定，所得的提取物的量較高.該工藝簡單，可行性高，可以為以后的生產(chǎn)提供可靠的參考和指導(dǎo).

[1] 中華人民共和國藥典(一部)[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010. 124.

[2] SUN Y, WEI L, WANG J,etal. Optimization of supercritical fluid extraction of saikosaponins from Bupleurumfalcatum with orthogonal array design [J].J Sep Sci., 2010, 33(8): 1161-1166.

[3] 彭支蓮, 張 丹, 李業(yè)洪, 等. 正交法優(yōu)選續(xù)斷中綠原酸的提取工藝[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(7): 269-270.

[4] 趙森銘. 正交實驗法優(yōu)選柴黃咀嚼片的提取工藝[J]. 北方藥學(xué), 2013, 10(7): 56-57.

[5] 浦錦寶, 胡軼娟, 梁衛(wèi)青, 等. 紫外可見分光光度法測定柴胡中柴胡總皂苷的含量[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2008, 37(6): 98-100.

[6] 張文娓，崔 闊，謝 明，等.萆術(shù)硝痛顆粒提取工藝研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015，31(4)：389-392.

Optimum extraction program of Kunjing effervesce capsule plug using orthogonal experimental method

REN Na, LIU Jie, WU Lun, TIAN Zhen-kun

(Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To determine the optimal extraction program of Kunjing effervesce capsule plug by orthogonal experimental method with UV-visible spectrophotometry. By using the L9(34) orthogonal experimental method, the saikosaponin extraction rate and the extractum rate of the saikosaponin d were investigated. The ethanol concentration, solid-liquid ratio, extraction time and extraction times were used as investigation factors and three levels of each factor were investigated. By using UV visible spectrophotometry, with saikosaponin d as

tandard, the content of total saponins was determined at 543 nm. The optimal process was screened using statistical analysis. Results indicated the optimum extraction conditions were as follows: the concentration of ethanol 80%, 12 times the volume, extraction time of 30 min, extracting times of three. After the optimization of extraction the efficiency of saikosaponin d was the highest, and it could increase the utilization of various prescription medicines.

orthogonal experiment; Kunjing effervesce capsule plug; radix bupleuri total saponins; optimum extraction program

2015-08-10.

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項目(12541736)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項目(12541755)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究基金項目(2013xy02)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士創(chuàng)新基金項目(2012bs02)

任 娜(1990-)，女，碩士，研究方向：中藥創(chuàng)新藥物研究.

田振坤(1955-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥創(chuàng)新藥物研究.

R286

A

1672-0946(2015)06-0664-03