崔明宇，孫志偉，李艷鳳，馬英麗

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

蓬子菜中活性成分DXG大鼠血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定

崔明宇1，孫志偉2，李艷鳳1，馬英麗1

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

考察蓬子菜中活性成分DXG在大鼠血漿中的蛋白結(jié)合情況.采用平衡透析法測(cè)定DXG的大鼠血漿蛋白結(jié)合率.建立DXG透析外液和透析內(nèi)液的HPLC測(cè)定方法，求得高、中、低不同質(zhì)量濃度下，DXG的血漿蛋白結(jié)合率分別為29.39%，29.85%，32.94.該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，符合生物樣品測(cè)定要求要求.DXG的大鼠血漿蛋白結(jié)合率較低，且不具有質(zhì)量濃度依賴性.

蓬子菜；DXG；血漿蛋白結(jié)合率；平衡透析法

蓬子菜(Galium verum L.)為茜草科(Rubiaceae)拉拉藤(Galium)屬植物蓬子菜的干燥全草，性溫，味苦、甘，具有清熱解毒、利膽、利濕止癢、行血的功效.蓬子菜制劑在臨床上用于治療血管系統(tǒng)疾病取得了良好的效果[1]，DXG(diosmetin-7-O-b-D-xylopyranosyl-(1(6)-b-D-glucopyranoside)為蓬子菜(Galium verum L.)有效部位中分離得到的高含量活性指標(biāo)成分，藥理研究表明DXG對(duì)過(guò)氧化氫損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的保護(hù)和修復(fù)作用，使內(nèi)皮素(ET-1)水平降低，降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)水平升高[2].血漿蛋白結(jié)合率是重要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，影響藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，進(jìn)一步影響藥物的消除半衰期及藥理作用強(qiáng)度.本文采用平衡透析法考察了DXG與大鼠血漿蛋白的結(jié)合情況，為新藥開(kāi)發(fā)及保證合理的臨床用藥提供參考依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

DXG對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自提，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)；DXG (實(shí)驗(yàn)室自提，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%)；甲醇(色譜純，DIMA公司)；磷酸 (分析純) ；醋酸(分析純，天津市耀華化學(xué)試劑廠)；肝素鈉(北京奧博星生物技術(shù)公司)；EDTA(天津市恒興化學(xué)試劑制造公司)；磷酸二氫鉀(分析純，天津市津東天正化學(xué)公司) ；氯化鈉(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑公司)； 氫氧化鈉(天津市津東天正化學(xué)公司)；超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(LC-2010A，島津公司)、紫外檢測(cè)器(SPD-M10 AVP)；色譜工作站(Class-VP)；空氣浴振蕩器(HZQ-C，常州諾基儀器有限公司)；BF-2000 氮吹儀(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠)；渦旋混合器(XW-SOC，上海醫(yī)用儀器廠)；透析袋(MW 8000-14000，美國(guó)Sigma公司)；電子天平(BT25S，德國(guó)Sartorius公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠(雄性，(220±20) g；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)安全評(píng)價(jià)中心；許可證號(hào)：SYXK黑2008001).大鼠眼眶取血，肝素抗凝，5 000 r/min離心10 min，分離上層血漿備用.

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1透析液的配制

精密稱取磷酸二氫鉀2.74 g和氯化鈉8.8 g加入0.1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH=7.4，并定容至1 000 mL，即得pH=7.4的0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液.

2.1.2DXG標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液的配制

精密稱取DXG對(duì)照品適量，加70%乙醇溶解并定容至刻度，得0.3 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液.

2.1.3含藥透析液的配制

分別精密稱取DXG(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%)適量于25 mL容量瓶中，加空白透析液定容，得DXG質(zhì)量濃度分別為125、250、500 μg/mL的含藥透析液.

2.2 色譜條件

Hypersil ODS-2 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(大連伊利特公司)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水 (39∶61)；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；靈敏度為0.2AUFS.

2.3 樣品的處理

2.3.1透析內(nèi)液(血漿)樣品的處理

取透析內(nèi)液100 μL，加甲醇400 μL，渦旋混合1 min后，離心 10 min(10 000 r/min)，精密吸取上清液400 μL氮?dú)獯蹈?，加流?dòng)相200 μL溶解，以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，HPLC進(jìn)樣10 μL分析.

2.3.2透析外液(緩沖液)樣品的處理

取透析外液100 μL，加甲醇400 μL，渦旋混合1 min后，離心 10 min(10 000 r/min)，精密吸取上清液400 μL氮?dú)獯蹈?，加流?dòng)相200 μL溶解，以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，HPLC進(jìn)樣10 μL分析.

2.4 蛋白結(jié)合率的測(cè)定

2.4.1透析袋的處理

將透析袋剪成8 cm長(zhǎng)的小段，置500 mL燒杯中，加入等體積的2%NaHCO3和1 mol/L的EDTA溶液，煮沸10 min，冷卻后水洗，再用1 mol/L的EDTA溶液煮10 min，冷卻水洗后，于EDTA溶液中冰箱保存?zhèn)溆?4 ℃)，用前以蒸餾水沖洗干凈.

2.4.2平衡透析法測(cè)定蛋白結(jié)合率

將已預(yù)處理的透析袋一端扎緊，分別加入1mL空白血漿，扎緊，懸浮于裝有10 mL不同質(zhì)量濃度透析外液的離心管內(nèi)，透析外液中DXG質(zhì)量濃度分別為125、250、500 μg/mL，每組平行3份.調(diào)節(jié)透析袋內(nèi)外液面，使其保持同一高度，將蓋子旋緊，于37 ℃恒溫振蕩器中，透析達(dá)平衡后，取少量透析外液加等量的10%的高氯酸溶液，觀察是否有蛋白外漏，漏出者作廢.分別測(cè)定透析袋內(nèi)、外藥物的峰面積[3-5].

2.4.3平衡時(shí)間的考察

以磷酸緩沖液代替血漿置透析袋內(nèi)，透析外液DXG質(zhì)量濃度分別為125、250、500 μg/mL，置于37 ℃恒溫振蕩器中，分別于3、6、9、12、24、30、36 h測(cè)定透析袋內(nèi)外DXG的質(zhì)量濃度，以二者質(zhì)量濃度比值確定平衡時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30 h之后透析袋內(nèi)外質(zhì)量濃度不再發(fā)生變化，故透析平衡時(shí)間采用30 h.

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1專屬性

制備DXG對(duì)照品、空白血漿、透析內(nèi)液樣品、透析外液樣品，按2.3項(xiàng)下操作，HPLC每份進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖.DXG保留時(shí)間為8.9 min，并具有良好分離效果，樣品在處理過(guò)程中未引入雜質(zhì)；且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)與透析液對(duì)DXG的分析測(cè)定無(wú)干擾.見(jiàn)圖1(A)～(D).

圖1 DXG不同樣品中 HPLC色譜圖

3.1.2線性關(guān)系

李林，任校長(zhǎng)19年來(lái)，他把“引導(dǎo)學(xué)生走向幸?！弊鳛閷W(xué)校的辦學(xué)宗旨，積極探索教育規(guī)律，努力實(shí)施“以德立校，依法治校，科研興校，文化強(qiáng)?！钡霓k學(xué)策略，著力培養(yǎng)學(xué)生適應(yīng)終身發(fā)展和社會(huì)發(fā)展需要的必備品格和關(guān)鍵能力。

1)透析內(nèi)液標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

于100 μL空白血漿中加入100 μL不同質(zhì)量濃度DXG標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，使血漿中所含DXG質(zhì)量濃度分別為3、9、15、21、27、33 μg/mL，按2.3項(xiàng)處理后，以DXG血藥質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(C)，對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(A)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程A=-2 536.5+17 206C(R2=0.999 7)，表明在3～33 μg/mL范圍內(nèi)具良好線性關(guān)系.

2)透析外液標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

100 μL透析外液中加入不同質(zhì)量濃度DXG標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液各100 μL，使相應(yīng)緩沖液中所含DXG質(zhì)量濃度為10、11、12、13、14、15 μg/mL，按2.3項(xiàng)處理后，以DXG質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(C)，對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(A)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A= 17 029C-494.29(R2= 0.999 9)，結(jié)果表明在10～15 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

3.1.3精密度與準(zhǔn)確度

表1 血漿、透析液中DXG測(cè)定方法的精密度與回收率(n=5)

3. 1.4 提取回收率

分別取空白血漿與空白透析液100μL，按藥物的質(zhì)量濃度配制成低、中、高不同質(zhì)量濃度的血漿樣品溶液(3、15、30μg/mL)和透析外液樣品溶液(11、13、15μg/mL)，按2.3項(xiàng)方法處理后進(jìn)行HPLC分析.將樣品處理后血漿和透析外液樣品的峰面積，同未經(jīng)樣品處理的相同質(zhì)量濃度的DXG標(biāo)準(zhǔn)溶液和透析外液直接進(jìn)樣所得峰面積相比.結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度下，血漿和透析液的提取回收率達(dá)75%以上，且RSD<10%，方法符合生物樣品測(cè)定要求.見(jiàn)表2.

表2 血漿、透析液中DXG的提取回收率(n=5)

3.1.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取空白血漿和空白透析液，按2.3項(xiàng)方法預(yù)處理后配制成低、中、高不同質(zhì)量濃度血漿樣品溶液(3、15、30μg/mL)和透析外液樣品溶液(11、13、15μg/mL)，考察血漿樣品在-20 ℃凍融1周、室溫放置24h及透析外液樣品37 ℃放置36h后的穩(wěn)定性.結(jié)果表明，血漿樣品和透析外液樣品在以上條件下具有良好的穩(wěn)定性.

3.1.6透析膜對(duì)DXG的吸附性

將空白磷酸鹽緩沖液1mL(設(shè)體積為V2)加入透析袋內(nèi)，于透析袋外分別加入己知不同質(zhì)量濃度CA(125 、250 、500μg/mL)的磷酸緩沖液10mL(設(shè)體積為Vl)，透析36h后，達(dá)平衡，測(cè)定透析袋外藥物質(zhì)量濃度(CE)，根據(jù)下式計(jì)算透析膜對(duì)藥物的吸附率X，X= CA×V1-CE×(V1+V2)/CA×V1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明透析袋對(duì)藥物顯微量吸附，可忽略不計(jì).見(jiàn)表3.

表3 透析膜對(duì)DXG的吸附率

3.2 蛋白結(jié)合率

透析達(dá)平衡后，測(cè)定透析袋內(nèi)、外的藥物質(zhì)量濃度A與B，根據(jù)公式F=(A-B)/A計(jì)算DXG血漿蛋白結(jié)合率.結(jié)果見(jiàn)表4，DXG低、中、高三個(gè)劑量大鼠血漿蛋白結(jié)合率較低，且無(wú)明顯質(zhì)量濃度依賴性.見(jiàn)表4.

表4 不同劑量藥物的血漿蛋白結(jié)合率

4 討 論

蛋白結(jié)合率測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DXG低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的大鼠血漿蛋白結(jié)合率分別為29.39%、29.85%和32.94%.且在給藥劑量范圍內(nèi)無(wú)質(zhì)量濃度依賴性，屬于蛋白結(jié)合率較低的藥物，游離型藥物質(zhì)量濃度較高，可以推斷DXG受病理狀態(tài)及聯(lián)合用藥的相互作用影響較小，聯(lián)合用藥后游離型藥物質(zhì)量濃度在體內(nèi)亦不會(huì)發(fā)生較大的變化，因此安全性較高.而根據(jù)低蛋白結(jié)合率推測(cè)游離型藥物在體內(nèi)分布速度會(huì)較快，易經(jīng)過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)排除體外，這與藥動(dòng)學(xué)參數(shù)求得DXG較短的分布與消除半衰期相吻合.

[1] 高 杰, 吳華臣, 陳文閣, 等. 康脈2號(hào)膠囊治療下肢深靜脈血栓形成98例[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2009, 18(3): 259-260.

[2] 趙 鋼, 吳明遠(yuǎn), 田旭升, 等. 蓬子菜沖劑對(duì)降鈣素基因相關(guān)肽和腎上腺髓質(zhì)素水平的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志, 2007, 13(1): 66-68.

[3] 馬英麗, 盧衛(wèi)紅, 曉 敏, 等. 蓬子菜的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥, 2005, 36(10): 1464-1465.

[4] 曹露曄, 陳 子. 高效液相色譜法研究藍(lán)萼甲素與大鼠血漿蛋白的結(jié)合率[J]. 中草藥, 2007, 38(5): 693-695.

[5] 劉東亮, 耿 婷. 荊芥內(nèi)酯大鼠血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2012, 21(1): 21-25.

Determination of plasma protein binding rate of DXG from Galium verum L. in rat

CUI Ming-yu1, SUN Zhi-wei2, LI Yan-feng1, MA Ying-li1

(1. College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;2. College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076)

To determinate the protein-bound fraction of serum of DXG from Galium verum L. Equilibrium dialysis was used to determine the in vitro binding rate of DXG to rat plasma. A HPLC method for determination of DXG dialysated inside solution and outer solution was established. Plasma protein binding rate of DXG in different concentration was 29.39%, 29.85%, 32.94%, respectively. The methods were specific and sensitive, which can be used in determination of biological specimen. The plasma protein binding of DXG in rats reveals a low binding and has no concentration dependence.

Galium verum L.; DXG; plasma protein binding rate; equilibrium dialysis

2015-03-04.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201281274034)； 黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531625)

崔明宇(1971-)，女，博士，研究方向：中藥活性成分及其藥物動(dòng)力學(xué).

馬英麗(1954-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥活性成分及作用機(jī)制研究.

R96

A

1672-0946(2015)06-0678-04