張 億，朱 蓉，鄭 萍，熊 玲（成都市食品藥品檢測(cè)中心，成都 610045）

鹽酸賴氨酸為人體必需的8種氨基酸之一，具有刺激胃蛋白酶與胃酸的分泌、增進(jìn)食欲、提高鈣的吸收及其在體內(nèi)的積累、加速骨骼生長(zhǎng)的作用。其常與其他維生素組成復(fù)方制劑，用于調(diào)節(jié)幼兒新陳代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)與發(fā)育[1]。因此，建立這類復(fù)方制劑中鹽酸賴氨酸含量的測(cè)定方法，有利于更加嚴(yán)格地控制制劑的質(zhì)量，保證用藥安全。目前，復(fù)方賴氨酸制劑已有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多采用甲醛滴定法[2-3]或茚三酮比色法[4-7]，但這兩種方法的專屬性和精密度均不夠高，僅適合于含單一賴氨酸成分且濃度較高的樣品。考慮到復(fù)方制劑中輔料和其他成分都可能會(huì)對(duì)賴氨酸成分的測(cè)定造成干擾，且賴氨酸含量較低，筆者采用了高效液相色譜（HPLC）法，并以鄰苯二甲醛（OPA）試劑對(duì)鹽酸賴氨酸進(jìn)行柱前衍生化，這樣不僅解決了鹽酸賴氨酸無發(fā)色基團(tuán)、在紫外檢測(cè)器下無特征吸收的問題，而且通過自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了被分析樣品衍生后的在線分析，方法簡(jiǎn)便、快速，無需配置特殊衍生設(shè)備。

1 材料

1260 HPLC儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、帶二級(jí)管陣列的紫外檢測(cè)器（美國Agilent公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸賴氨酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140624-200805，純度：100%）；五維賴氨酸顆粒（批號(hào)：120925，規(guī)格：每克含鹽酸賴氨酸50 mg、維生素B11.2 mg、維生素B20.15 mg、維生素B60.075 mg、煙酰胺2.4 mg、泛酸鈣0.15 mg、枸櫞酸0.09 mg）、賴氨肌醇維B12口服溶液（批號(hào)：130605，規(guī)格：每毫升含鹽酸賴氨酸60 mg、維生素B123 μg、肌醇10 mg）、賴氨酸磷酸氫鈣片（批號(hào)：1306071，規(guī)格：每片含鹽酸賴氨酸100 mg、磷酸氫鈣100 mg）均為日常監(jiān)督抽檢樣品；OPA為美國Agilent公司市售產(chǎn)品（將鄰苯二醛與3-巰基丙酸混合于硼酸鹽緩沖液中）；甲醇、乙腈為色譜純，硼酸鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉為分析純，水為Millipore超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 鹽酸賴氨酸對(duì)照品溶液 取鹽酸賴氨酸對(duì)照品約100 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1 ml中含1 mg鹽酸賴氨酸的對(duì)照品貯備液；精密量取上述對(duì)照品貯備液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1 ml中含0.2 mg鹽酸賴氨酸的對(duì)照品溶液。

2.1.2 五維賴氨酸顆粒供試品溶液（S1）取五維賴氨酸顆粒1 g，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度；精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀釋制成每1 ml中含0.2 mg鹽酸賴氨酸的供試品溶液。

2.1.3 賴氨肌醇維B12口服溶液供試品溶液（S2）取賴氨肌醇維B12口服溶液1 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度；精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，加水制成每1 ml中含0.24 mg鹽酸賴氨酸的供試品溶液。

2.1.4 賴氨酸磷酸氫鈣片供試品溶液（S3）取賴氨酸磷酸氫鈣片10片，研細(xì)，精密稱取約相當(dāng)于50 mg鹽酸賴氨酸的細(xì)粉，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾；精密量取續(xù)濾液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水制成每1 ml中含0.2 mg鹽酸賴氨酸的供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.04 mol/L磷酸二氫鈉溶液（10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2）-甲醇-乙腈（70∶15∶15，V/V/V）；流速：1.5 ml/min；柱溫：35 Ⅰ；檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm。將供試品按照自動(dòng)衍生化進(jìn)樣程序，與硼酸鹽緩沖溶液（取硼酸鈉15.25 g，加水100 ml溶解，并用45%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.2）混合后，再與OPA混合并定時(shí)反應(yīng)2 min后，注入HPLC儀中。自動(dòng)衍生化進(jìn)樣程序見表1。在此色譜條件下，空白溶劑中未見未反應(yīng)的衍生試劑OPA的色譜峰，供試品溶液中未見干擾賴氨酸衍生物色譜峰的雜質(zhì)峰，賴氨酸理論板數(shù)＞3 000。色譜見圖1。

表1 自動(dòng)衍生化進(jìn)樣程序Tab 1 Automatic derivatization and injection procedure

2.3 線性關(guān)系考察

圖1 柱前衍生化高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.對(duì)照品；C.供試品Fig 1 Pre-column derivatization HPLC chromatogramsA.blank solution；B.reference；C.test sample

精密稱取鹽酸賴氨酸對(duì)照品20 mg，置于25 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，以此溶液作為線性試驗(yàn)?zāi)敢?。分別精密吸取上述線性試驗(yàn)?zāi)敢哼m量，加水制成質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/ml的系列對(duì)照品溶液。取上述系列對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸賴氨酸的回歸方程為y＝2.021 9×103x－26.34（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，鹽酸賴氨酸質(zhì)量濃度在0.027 4～0.438 8 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取鹽酸賴氨酸對(duì)照品溶液0.5 μl，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，峰面積RSD為0.55%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下供試品溶液S1、S2、S3各1份，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果，峰面積RSD分別為0.67%、0.58%、0.79%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取五維賴氨酸顆粒、賴氨肌醇維B12口服溶液、賴氨酸磷酸氫鈣片各6份，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法計(jì)算鹽酸賴氨酸的含量。結(jié)果，含量RSD分別為0.78%、0.66%、0.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取五維賴氨酸顆粒0.20 g，共9份，分別置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為五維賴氨酸顆粒加樣回收率試驗(yàn)樣品溶液。精密量取賴氨肌醇維B12口服溶液0.2 ml，共9份，分別置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為賴氨肌醇維B12口服溶液加樣回收率試驗(yàn)樣品溶液。取賴氨酸磷酸氫鈣片10片，研細(xì)，精密稱取約相當(dāng)于10 mg鹽酸賴氨酸的細(xì)粉，共9份，分別置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為賴氨酸磷酸氫鈣片加樣回收率試驗(yàn)樣品溶度。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 3種復(fù)方制劑的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test of 3 compound preparations（n＝9）

2.8 樣品含量測(cè)定

取鹽酸賴氨酸對(duì)照品溶液與供試品溶液S1、S2、S3，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。同時(shí)，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法茚三酮比色法測(cè)定五維賴氨酸顆粒及賴氨酸磷酸氫鈣片中鹽酸賴氨酸的含量，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法甲醛滴定法測(cè)定賴氨肌醇維B12口服溶液中鹽酸賴氨酸的含量。將HPLC法測(cè)定結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。由表2可知，HPLC法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定的結(jié)果一致，精密度有所提高。

表3 3種復(fù)方制劑的鹽酸賴氨酸含量測(cè)定結(jié)果比較（%）Tab 3 Comparison of lysine hydrochloride content of 3 compound formulations（%）

3 討論

3.1 衍生化方法的選擇

柱前衍生化HPLC法具有分析時(shí)間短、方法靈活多樣、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，一直是分析化學(xué)領(lǐng)域探索的重要課題。OPA法為一種常用的衍生化方法，其缺點(diǎn)是OPA只能與一級(jí)氨反應(yīng)，不能同時(shí)檢測(cè)二級(jí)氨，使OPA-氨基酸的穩(wěn)定性差、需要及時(shí)進(jìn)樣；考慮到復(fù)方鹽酸賴氨酸制劑所含的氨基酸為一級(jí)氨，且其他主藥成分和輔料對(duì)衍生化的干擾較小，故選用反應(yīng)迅速、對(duì)儀器設(shè)備要求較低的、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的OPA法。OPA與硫醇試劑聯(lián)用，能與賴氨酸迅速反應(yīng)，產(chǎn)生具有高熒光強(qiáng)度的異吲哚衍生物，這些衍生物可以被熒光檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器檢出[8]?？紤]到本次樣品的質(zhì)量濃度在20μg/ml以上，故采用紫外檢測(cè)器。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

唐濤[9]曾以O(shè)PA及2，4-二硝基氟苯為衍生劑，考察了柱溫、衍生劑用量、反應(yīng)時(shí)間及流動(dòng)相pH等因素對(duì)HPLC分析結(jié)果的影響。本文參考其色譜條件，確定了新的色譜條件：柱溫為35 Ⅰ，流動(dòng)相pH為7.2，衍生劑比例為OPA-賴氨酸（50∶1，V/V）。由于OPA與賴氨酸的衍生物不穩(wěn)定，其峰面積會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，故采用自動(dòng)程序進(jìn)行衍生化，供試品與衍生劑精確混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)2 min后立即進(jìn)樣分析。

利用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行光譜掃描，提取衍生物紫外吸收?qǐng)D譜，可見在231 nm和338 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。考慮到衍生劑在230 nm波長(zhǎng)處有紫外末端吸收，會(huì)在色譜中形成雜峰，故選擇338 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 不同測(cè)定方法對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響

賴氨肌醇維B12口服溶液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用甲醛直接滴定鹽酸賴氨酸，通過pH的變化來指示終點(diǎn)；五維賴氨酸顆粒（片）、賴氨酸磷酸氫鈣片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用茚三酮比色法定量測(cè)定鹽酸賴氨酸的含量。這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。甲醛滴定法操作簡(jiǎn)單、成本低，當(dāng)樣品中只含有單一的已知氨基酸，則可由此法滴定的結(jié)果算出氨基酸的含量；但該反應(yīng)的終點(diǎn)依靠pH來顯示，根據(jù)堿的消耗量來計(jì)算賴氨酸濃度，誤差較大，且測(cè)試的誤差隨樣品濃度的降低逐漸增大，僅適合測(cè)定高濃度樣品[10]。茚三酮比色法是利用茚三酮與氨基酸反應(yīng)生成有色物質(zhì)，該物質(zhì)在565 nm波長(zhǎng)附近有最大吸收，且吸收強(qiáng)度與氨基酸含量呈正比；但該方法受溶液pH、顯色劑用量、加熱時(shí)間和冷卻時(shí)間多重影響，精密度、重復(fù)性、專屬性均較差[11-12]。柱前衍生化HPLC法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性和準(zhǔn)確性均較好，將其所測(cè)得的鹽酸賴氨酸的含量結(jié)果與原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，基本一致，而精密度有所提高。因此，該方法可用于含有鹽酸賴氨酸的復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。

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[5]國家藥典委員會(huì)編.WS-10001-（HD-0596）國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)：第7冊(cè)[S].2002：20.

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