王洪燕

(兗州市人民醫(yī)院皮膚科,山東 兗州 272000)

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Toll樣受體9和CD123在尋常型銀屑病患者皮損中的表達

王洪燕

(兗州市人民醫(yī)院皮膚科,山東 兗州 272000)

目的 探討Toll樣受體9(TLR9)和CD123在尋常型銀屑病患者皮損中的表達及意義。 方法 選擇2012年6月至2013年4月兗州市人民醫(yī)院收治的26例尋常型銀屑病患者為試驗組，另選23例健康體檢者為對照組，分別按照常規(guī)皮膚手術采集軀干部皮損樣本進行活檢，并采用免疫組織化學S-P法及反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測其組織中的CD123及TLR9表達情況，分析其過表達與尋常型銀屑病患者發(fā)病的機制。結果 試驗組免疫組織化學S-P法CD123及TLR9陽性表達率均為100%，其表達水平分別為(10.1±2.3)個/mm3和(14.4±2.0)個/mm3，而對照組表達水平分別為(1.5±0.6)個/mm3，(2.2±1.0) 個/mm3，但無陽性表達；試驗組RT-PCR法TLR mRNA表達水平高于對照組[(1.32±0.08) 比 (0.87±0.04)],差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論 漿細胞樣樹突狀細胞可能參與激發(fā)自身免疫T細胞活化和增殖，是尋常型銀屑病發(fā)病的一個重要機制之一。

銀屑??；Toll樣受體9；漿細胞樣樹突細胞；CD123

銀屑病是一種發(fā)生在遺傳基礎上細胞免疫介導的多種炎性因子與中性粒細胞共同參與的慢性炎癥性皮膚病[1]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是免疫細胞的主要模式識別受體，在免疫反應和慢性炎癥中起重要作用,而銀屑病患者體內存在免疫反應異?，F象。漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells，PDCs)是近年來被認識的一種具有特征性的樹突狀細胞的一個亞類，其在免疫應答中發(fā)揮重要作用，也是天然的Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)所產生的細胞,CD123是其表面特征標志之一[2]。PDCs通過其表面TLR9受體產生Ⅰ型IFN。本研究采用免疫組織化學S-P法及反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測尋常型銀屑病患者皮損中的CD123和TLR9，旨在探討銀屑病發(fā)病、演變過程中PDCs表面CD123和TLR9所起的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月至2013年4月兗州市人民醫(yī)院收治的26例尋常型銀屑病患者為試驗組，均符合臨床和病理學診斷，其中男14例，女12例，年齡10～43歲，平均(34.4±2.5)歲，病程1個月～25年，平均(18.5±3.2)年，患者近1個月內均未接受治療。另選23例健康體檢者為對照組，無免疫性或系統(tǒng)性疾病，無銀屑病家族史，其中男12例，女11例，年齡13～47歲，平均(33.8±2.9)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準,所有研究對象簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人TLR9抗體由上海麗臣生物科技有限公司提供，鼠抗人CD123抗體由廣州長瑞生物有限公司提供，生物素標記的二抗、3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色劑均為上海江萊生物科技有限公司提供，過氧化氫(H2O2)、枸櫞酸緩沖液由廣州市博翱中誠化工科技有限公司提供。

1.2.2 標本采集 兩組受試者按照常規(guī)皮膚手術采集軀干部皮損樣本進行活檢，每位受試者取一塊皮損樣本，均分為兩份，一份常規(guī)石蠟組織包埋，免疫組織化學備用，一份冷凍-70 ℃ 保存，RT-PCR，冰凍切片免疫組織化學備用。

1.2.3 免疫組織化學S-P法 石蠟組織包埋標本4 μm連續(xù)切片，脫蠟至水，3% H2O2去離子水氧化，枸櫞酸溶液抗原修復，免疫組織化學染色；冷凍標本4～6 μm冰凍切片，冷丙酮(二甲基酮)固定，免疫組織化學染色。正常羊血清封閉，室溫孵育。滴加TLR9抗體，平衡鹽溶液沖洗，滴加二抗，PBS沖洗。3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色，水洗，蘇木素復染，封片。陰性對照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。

1.2.4 RT-PCR 稱取50 mg皮損樣本用Trizol法常規(guī)提取RNA并反轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增反應，反應體系為25 μL：dNTPmix(10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，PCR緩沖液2.5 μL，cDNA模板、1 mmol/L上游及下游引物各2 μL，余下用雙蒸水補足25 μL。擴增條件：預變性95 ℃ 15 min，變性95 ℃ 40 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共32個循環(huán)。采用南京金斯瑞生物科技有限公司合成的引物序列：β-肌動蛋白為參照物，上游引物、下游引物、預擴增片斷分別為5′-GTGGGGCGCGCCCAGGCACCA-3′、5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′、 538 bp；TLR9上游引物、下游引物、預擴增片斷分別為5′-TGGTGCAGGAGCCAAGAC-3′、 5′-GAAGGGACATCGACGACAGG-3′、415 bp。

1.2.5 結果判定 免疫組織化學染色以細胞質或細胞膜有棕黃色染色為陽性，用顯微鏡10×40下觀察，隨機選4個視野，計算平均陽性細胞數/mm3(個/mm3)。RT-PCR用HPIAS-1000軟件對電泳條帶分析，計算TLR9/β-肌動蛋白的值，作為TLR9的相對水平。

2 結 果

2.1 兩組受試者免疫組織化學結果 試驗組患者皮損中CD123、TLR9陽性表達率均為100%，對照組均為0%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；試驗組患者皮損中CD123、TLR9陽性表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 兩組受試者皮損中CD123及TLR9陽性表達情況 個/mm3)

TLR9：Toll樣受體9;試驗組：尋常型銀屑病患者；對照組：健康體檢者

2.2 兩組受試者RT-PCR測定結果 試驗組患者TLR9 mRNA相對水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義[(1.32±0.08)比(0.87±0.04)](t=24.390,P<0.01)，見圖1。

M:標準參照； 1、2：正常對照； 3、4：尋常型銀屑病皮損

圖1 Toll樣受體9(TLR9)mRNA 反轉錄-聚合酶鏈反應產物電泳圖

3 討 論

近年來，銀屑病患者體內存在天然免疫異?，F象已被大量研究所證實。TLR是一種天然免疫受體，已發(fā)現人體有11種 TLRs，主要分布于免疫細胞，如PDCs、淋巴細胞、單核巨噬細胞等，主要介導急性炎癥反應，釋放大量致炎因子，如白細胞介素(interluekin,IL)-1、IL-6、IL-12等，同時輔助建立以Th1型免疫應答為主的抗原特異性獲得性免疫應答[3]。PDCs有極強的分泌IFN(IFN-α/β)的能力，這種能力在一些內源性配體和病原體相關分子模式反應中是其他細胞的1000倍[4]，故被認為是天然的Ⅰ型IFN產生細胞。PDCs可同時分泌高水平的Ⅰ型IFN和IL-12。Ⅰ型IFN可上調所有T細胞亞類上的IL-12受體,因此被認為是兩種受體共同激發(fā)Th1反應機制。髓樣樹突狀細胞由單核細胞分化產生，在微生物刺激下并不能同時分泌Ⅰ型IFN和IL-12,僅能分泌IL-12。一些自身免疫性疾病(如紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風濕關節(jié)炎等)的炎癥組織中均存在PDCs的浸潤。本研究銀屑病患者皮損中有PDCs的表面特征識別標記CD123及TLR9受體表達，而正常人沒有，證實了PDCs存在于銀屑病患者皮膚炎癥組織中，提示其表達具有較高的特異性，可能參與了銀屑病的免疫應答，可能是其發(fā)病的機制之一。

人體中，TLR9主要表達于PDCs，不表達于髓樣樹突狀細胞。PDCs依賴于其表面TLR9受體分泌Ⅰ型IFN和IL-12。周郅軻等[5]報道，TLR9及其mRNA在與感染有關的銀屑病皮損中高表達。本研究中，試驗組銀屑病患者皮損中存在TLR9及其mRNA高表達，而對照組TLR9無表達，低表達其mRNA，提示銀屑病皮損中TLR9轉錄活躍，可能高表達其基因產物。TLR9主要識別細菌DNA中非甲基化CpG基序(CpG DNA)，通過蛋白髓樣分化因子88的信號傳遞，在機體中參與免疫應答[6]。研究證實，T細胞自身反應通過TLR介導外周靶器官炎癥,誘發(fā)明顯的自身免疫性疾病[7]。銀屑病發(fā)病與病毒感染有關，病毒通過表達于PDCs的TLR9誘導Ⅰ型 IFN和IL-12的分泌。病毒成分與TLR9結合而活化，經蛋白髓樣分化因子88信號轉導，激活核因子κB、干擾素調節(jié)因子7等轉錄因子和蛋白激酶，釋放IL-6、IL-8、IL-12等炎性介質和Ⅰ型IFN，介導急性炎癥反應，誘發(fā)Thl型細胞免疫應答[8]。這反映了PDCs的TLR9在銀屑病發(fā)病過程的抗感染防御反應中起重要作用。

綜上所述，銀屑病皮損高表達CD123、TLR9及其mRNA,證實PDCs出現在銀屑病患者皮損中，因此認為其可能參與激發(fā)自身免疫T細胞活化和增殖，導致銀屑病發(fā)病的一個天然免疫途徑，但有待進一步的論證。若能進一步了解PDCs的功能以及其與T細胞、其他免疫細胞的相互作用，將為銀屑病的免疫反應及病理生理研究拓展新的思路。

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Expression of Toll-like Receptors 9 and CD123Plasmacytoid Dendritic Cells in Lesions of Patients with Psoriasis Vulgaris

WANGHong-yan.

(DepartmentofDermatology,People′sHospitalofYanzhouCity,Yanzhou272000,China)

Objective To investigate the expression of toll-like receptors 9(TLR9) and CD123plasmacytoid dendritic cells in skin lesions of patients with psoriasis vulgaris and its significance.Methods A total of 26 patients with psoriasis vulgaris admitted in People′s hospital of Yanzhou City from Jun.2012 to Apr.2013 were selected as the experimental group，another 23 healthy people underwent physical examination were selected as the control group.Skin lesion samples from the bodies of all the cases were collected by the method of general skin surgeries and received biopsies,and the expression of CD123and TLR9 in the samples were detected by S-P immunohistochemical method and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR),and the relationship between the overexpression of the two factors and the pathogenesis of psoriasis vulgaris was analyzed.Results The positive expression rate of CD123and TLR9 in the experiment group detected by S-P immunohistochemical method were both 100%,the expression mean values of CD123and TLR9 were respectively (10.1±2.3) figures/mm3，(14.4±2.0)figures/mm3，while in control group，the expression mean values of CD123and TLR9 were respectively (1.5±0.6) figures/mm3，(2.2±1.0) figures/mm3，both without positive expression;the expression levels of TLR mRNA in experiment group and control group detected by RT-PCR method were (1.32±0.08) figures/mm3and (0.87±0.04) figures/mm3，respectively，the difference was statistically significant(P<0.01).Conclusion Plasmacytoid dendritic cells may be involved in stimulating the activation and proliferation of autoimmune T cell,which is an important mechanism of the incidence of psoriasis vulgaris.

Psoriasis; Toll like receptor 9; Plasmacytoid dendritic cells; CD123

R758.63

A

1006-2084(2015)12-2249-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.052

2014-03-23

2014-09-23 編輯:伊姍