馮 春,馮 磊,梁素麗,曹 寧,么福勤,閆杰培,王 琪,李 楊,鄭 引(綜述),郭 鐳(審校)

(1.圣釋(北京)生物工程有限公司 SCLGL圣釋再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100018; 2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科,長(zhǎng)春 130033)

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人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征及在婦產(chǎn)科中的研究進(jìn)展

馮 春1,馮 磊1,梁素麗1,曹 寧1,么福勤1,閆杰培1,王 琪1,李 楊1,鄭 引1(綜述),郭 鐳2※(審校)

(1.圣釋(北京)生物工程有限公司 SCLGL圣釋再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100018; 2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科,長(zhǎng)春 130033)

間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于發(fā)育早期中胚層的多能干細(xì)胞，具有高度多能性和可塑性，通過(guò)特定條件的體外定向增殖、分化培養(yǎng)，可獲得包括成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等在內(nèi)的多種體細(xì)胞。臍間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于相對(duì)純凈的新生兒臍帶組織，具有成本較低、不涉及倫理問(wèn)題且不損害供者等優(yōu)勢(shì)，為組織細(xì)胞工程在臨床婦產(chǎn)科學(xué)的廣泛應(yīng)用提供了新的思路。

間充質(zhì)干細(xì)胞；婦產(chǎn)科；生物學(xué)特征；應(yīng)用前景

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是目前實(shí)驗(yàn)和臨床研究最多的成體多能干細(xì)胞,在造血干細(xì)胞移植、移植物抗宿主病等中具有重要應(yīng)用。根據(jù)來(lái)源可分為骨髓來(lái)源MSC(bone marrow MSC，BMSC)、脂肪來(lái)源MSC和臍帶來(lái)源MSC(human umbilical cord MSC，hUCMSCs)[1]。目前研究最為深入廣泛的是BMSC，但由于當(dāng)前人骨髓來(lái)源BMSC水平極低，且存在病毒感染率較高、細(xì)胞增殖分化潛能隨年齡的增大而下降且穿刺取材是一個(gè)侵襲性、有創(chuàng)傷、易污染的操作，對(duì)其臨床廣泛應(yīng)用帶來(lái)限制。研究發(fā)現(xiàn)從人臍帶中分離出的hUCMSCs，在細(xì)胞含量、增殖能力均優(yōu)于BMSC，多次傳代擴(kuò)增仍能保持旺盛功能，不表達(dá)或低表達(dá)免疫排斥相關(guān)標(biāo)記，免疫原性比BMSC低[2]，且取材方便，無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，是目前認(rèn)為較為理想的種子細(xì)胞。現(xiàn)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征及在婦產(chǎn)科中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 hUCMSCs分離及培養(yǎng)

目前，研究者們嘗試不同的方法進(jìn)行hUCMSCs的分離、培養(yǎng)，主要應(yīng)用酶消化法和組織塊貼壁培養(yǎng)法。酶消化法是將小塊臍帶，在包含透明質(zhì)酸酶和膠原酶的酶液混合物中進(jìn)行0.5～16 h的消化處理。Wang等[3]取人臍帶組織除臍血管后，消化處理16 h，3 d后可見(jiàn)成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)，傳代后細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定。Weiss等[4]用酶處理細(xì)胞后，傳代培養(yǎng)后每厘米臍帶可獲得15 000～17 000 個(gè)細(xì)胞。分離后的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，消化后的懸浮細(xì)胞在換液的過(guò)程中逐漸被除去，24 h后可見(jiàn)鋪路石樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞，成纖維樣細(xì)胞即為MSC前體細(xì)胞。體外培養(yǎng)hUCMSCs能快速增殖，傳10代以上細(xì)胞可增加5～10倍且細(xì)胞增殖速度無(wú)明顯降低，體外增殖能力較強(qiáng)；組織塊貼壁法步驟相對(duì)簡(jiǎn)便，完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)小塊臍帶組織，10～14 d后即獲得較為純化的細(xì)胞。Romanov等[5]首先采用hUCMSC組織培養(yǎng)方法，從人臍靜脈內(nèi)分離到具有端粒酶活性和表達(dá)干細(xì)胞因子受體C-kit 類似BMSC的細(xì)胞。相比較而言，酶消化法在培養(yǎng)過(guò)程中混有多種細(xì)胞，須進(jìn)行技術(shù)層面要求高的細(xì)胞標(biāo)記，然后再分離純化，培養(yǎng)過(guò)程中不能排除污染和損傷，貼壁法則操作簡(jiǎn)單，細(xì)胞生物學(xué)特征更穩(wěn)定，污染機(jī)會(huì)少。

2 hUCMSCs生物學(xué)特性

MSC目前研究較多，仍無(wú)特異性判定標(biāo)準(zhǔn)?；就ㄟ^(guò)細(xì)胞形態(tài)、增殖分化特點(diǎn)、免疫表型等來(lái)判斷。

2.1 增殖特征 hUCMSCs分離培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下可見(jiàn)貼壁、均一的梭形細(xì)胞和多角形細(xì)胞。傳代后培養(yǎng)2～3 d即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞膜粗糙呈不規(guī)則圓形，胞核位于中央、體積較大，核仁明顯，多次傳代后，細(xì)胞的核型保持穩(wěn)定，旋渦狀生長(zhǎng)。持續(xù)3～4 d后進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。研究表明12代以內(nèi)的細(xì)胞代間無(wú)增殖能力差異，增殖能力較強(qiáng),見(jiàn)圖1、2(圖片來(lái)源-SCLGL圣釋再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室)。

圖1 臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)(×40)

圖2 臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞HE染色(×200)

2.2 免疫表型 國(guó)際干細(xì)胞協(xié)會(huì)規(guī)定hUCMSCs應(yīng)至少達(dá)到如下標(biāo)準(zhǔn)[6]：表達(dá)CD13、CD44、CD29及CD105，對(duì)C-kit、CD14、CD11b、CD45、CD34、CD19、CD79和人類白細(xì)胞抗原-外源性抗原的呈遞分子(human leukoyte antigen DR,HLA-DR)抗原不表達(dá)。Karahuseyinoglu等[7]研究表明，hUCMSCs在表達(dá)

CD44、CD13、CD29、CD105的基礎(chǔ)上還表達(dá)CD10、CD73、CD49、CD166、CD90、CD146；而對(duì)CD14、CD34、CD56、CD45等不表達(dá)，對(duì)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子低水平表達(dá)， 對(duì)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子不表達(dá)，使同體CD4+T細(xì)胞不能識(shí)別MSC，從而逃脫了CD4+T細(xì)胞的免疫監(jiān)視從而在異體甚至異種體內(nèi)長(zhǎng)期存活。張浪輝等[8]用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析hUCMSCs：傳代細(xì)胞間免疫表型符合國(guó)際干細(xì)胞協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(CD13、CD44、CD105和CD29均強(qiáng)表達(dá))，對(duì)CD106弱表達(dá)，對(duì)HLA-Ⅰ弱表達(dá)或不表達(dá)；不表達(dá)HLA-Ⅱ抗原和CD45、CD14、CD31、CD34。以上研究均肯定hUCMSCs具有干細(xì)胞特性。除此之外，CD73，CD95等也可作為hUCMSCs的細(xì)胞表型標(biāo)志，見(jiàn)圖3。SCLGL圣釋再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的hUCMSCs多能性檢測(cè)顯示，此類細(xì)胞通常表達(dá)與胚胎干細(xì)胞類似的多能性基因如OCT-4、Nanog、Sox-2、SSEA-4、Vimitin等，見(jiàn)圖4(封三)。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征及在婦產(chǎn)科中的研究進(jìn)展

圖4 臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞免疫熒光染色 4A：SOX-2基因表達(dá)(×4);4B:SSEA-4基因表達(dá)(×10)；4C：OCT-4基因表達(dá)(×4)；4D：Nanog基因表達(dá)(×4)

圖3 hUSMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物 流式檢測(cè)結(jié)果顯示hUSMSCs高表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD95、CD105、HLA-ABC，低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR；3A：CD34；3B：CD45；3C：CD44；3D：CD73；3E：CD90；3F：CD95；3G：CD105；3H：HLA-ABC;3I:HLA-DR;hUSMSCs:臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞；FITC：異硫氯酸熒光素；HLA-DR：人類白細(xì)胞抗原-外源性抗原的呈遞分子；HLA-ABC：人類白細(xì)胞ABC抗原

2.3 多分化潛能和細(xì)胞因子表達(dá) hUCMSCs相比于BMSC更接近胚胎干細(xì)胞，具有更大的分化潛能。經(jīng)體外誘導(dǎo)后，hUCMSCs既可以分化為中胚層來(lái)源的多種組織細(xì)胞，又可以分化為內(nèi)胚層來(lái)源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞和外胚層來(lái)源神經(jīng)元樣細(xì)胞。伴有多種細(xì)胞特異性標(biāo)志物，顯示細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)[9-10]。Baksh等[11]體外誘導(dǎo)hUCMSCs時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)有脂肪小滴出現(xiàn)。Wang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs經(jīng)誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，伴有脂滴和成骨樣組織鈣結(jié)節(jié)表達(dá)。另外，還發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(osteopontin)、成骨細(xì)胞特異性的縫隙連接蛋白43以及調(diào)控MSC向成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor，RUNX)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表明hUCMSCs呈現(xiàn)典型的脂肪樣細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞分化。在向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)，hUCMSCs內(nèi)堿性磷酸酶高表達(dá)、產(chǎn)生骨涎蛋白并形成鈣結(jié)節(jié)[12]。周佳等[13]和何紅燕等[14]利用微團(tuán)塊成軟骨誘導(dǎo)法發(fā)現(xiàn)軟骨特異性的陷窩樣結(jié)構(gòu)軟骨細(xì)胞及尼氏小體樣等結(jié)構(gòu)并釋放神經(jīng)元特異性烯醇化酶。此外，有實(shí)驗(yàn)證明hUCMSCs具有向胰島樣細(xì)胞分化的潛能[15]。雖然hUCMSCs具有多向分化的潛能, 但仍需深入系統(tǒng)研究，以為臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

3 hUCMSCs應(yīng)用進(jìn)展

hUCMSCs作為種子細(xì)胞，因其增殖特征和多分化潛能修復(fù)或代替多種病變組織，為暫時(shí)難治愈的疾病提供了可行性、安全性的治療方案，在多個(gè)器官、系統(tǒng)均有廣泛研究，特別在婦產(chǎn)生殖方面受到廣泛關(guān)注。

3.1 卵巢早衰 卵巢早衰是指婦女40歲前，引發(fā)的閉經(jīng)、體內(nèi)激素缺乏或紊亂而致不孕的疾病。在國(guó)外，普通人群卵巢早衰發(fā)病率約為1%[16]，中國(guó)約3.8%，其中特發(fā)性卵巢早衰約占80%[17]。卵巢早衰的病因包括染色體異常、酶缺陷、及醫(yī)源性因素等。當(dāng)前受自然、社會(huì)因素影響，腫瘤發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢(shì)，在腫瘤治療過(guò)程中各種化療藥物的使用而導(dǎo)致婦女卵巢早衰的病例越來(lái)越多，通常表現(xiàn)為情緒失控、內(nèi)分泌失調(diào)而致不孕。當(dāng)前如何預(yù)防卵巢早衰、修復(fù)受損卵巢是研究人員努力方向。

李彩霞等[18]通過(guò)化療損傷小鼠卵巢早衰動(dòng)物模型進(jìn)行hUSMSCs尾靜脈移植，發(fā)現(xiàn)其定向卵巢部位歸巢的能力。目前采用多種方法預(yù)防和治療化療所致卵巢早衰，如激素替代療法和輔助生殖技術(shù)。應(yīng)用激素替代療法在緩解患者生理狀態(tài)的同時(shí)，可以改善由內(nèi)分泌紊亂引起的癥狀，使極少數(shù)患者在短時(shí)間恢復(fù)排卵，但長(zhǎng)期應(yīng)用激素替代療法有增加乳腺癌、心臟病和中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂[19]。

胚胎移植和激素替代周期的卵子贈(zèng)送是目前有效的治療方式。Lutjen等[20]報(bào)道世界首例卵巢早衰婦女通過(guò)該技術(shù)成功生育。雖然能夠有效解決生育問(wèn)題，但是該技術(shù)存在倫理和法律上的爭(zhēng)議，所以尋求恢復(fù)患者自身的卵巢功能的方法才是最理想的治療途徑。

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠MSC卵巢局部移植能修復(fù)卵巢結(jié)構(gòu)、改善內(nèi)分泌功能，對(duì)化療所致的卵巢早衰有明顯效果[21]。Kang等[22]研究表明，鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞與卵巢顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)后，刺激表達(dá)卵泡刺激素受體的顆粒細(xì)胞超過(guò)90%，且E2濃度明顯上升，且在7 d內(nèi)呈正相關(guān)。Liu等[23]將經(jīng)紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD44+/CD105+的羊水MSC在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后移植入環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢早衰小鼠卵巢內(nèi)3周，標(biāo)記細(xì)胞仍可探測(cè)，說(shuō)明標(biāo)記細(xì)胞的增殖。黨建紅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，臍血MSC移植入放療引起卵巢早衰的裸鼠卵巢內(nèi)可使E2上升及黃體生成素、促卵泡素下降，未閉鎖卵泡數(shù)增加并可見(jiàn)各個(gè)發(fā)育階段卵泡。朱少芳[25]發(fā)現(xiàn)hUSMSCs能部分修復(fù)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的大鼠卵巢早衰，改善卵巢的內(nèi)分泌功能，修復(fù)卵巢損傷。對(duì)比卵巢早衰大鼠卵巢和尾靜脈注射MSC的效果，前組大鼠的促卵泡激素恢復(fù)較快，生育幼仔早，而靜脈注射更為微創(chuàng)，損傷更少，并可以多次注射提高細(xì)胞濃度，有望成為卵巢早衰替代的治療方式。

3.2 婦科腫瘤 卵巢癌是婦科腫瘤中病死率居于首位的惡性腫瘤，以腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲為主要特征。目前常規(guī)的治療手段難以明顯提高患者，尤其是晚期患者的遠(yuǎn)期生存率，生物防治是繼手術(shù)、放化療后第4種腫瘤治療模式，逐漸成為治療的新熱點(diǎn)，包括腫瘤免疫和基因治療。MSC逐漸顯示出作為抗腫瘤基因載體系極好的應(yīng)用前景。趙雯紅等[26]將抗腫瘤細(xì)胞因子白細(xì)胞介素12結(jié)合hUCMSCs重組腺病毒載體(AdIL-12-MSC)，研究發(fā)現(xiàn)重組的AdIL-12-MSC通過(guò)表達(dá)白細(xì)胞介素12基因，顯著抑制SKOV3 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并抑制卵巢癌在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。此研究提示hUCMSCs作為抗腫瘤基因治療負(fù)載體系具有可行性。

3.3 免疫調(diào)控 English等[27]在研究MSC抑制免疫排斥反應(yīng)的機(jī)制中證實(shí)，MSC可以從多層次對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控。MSC的抗凋亡效應(yīng)與抑制炎性因子腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β的產(chǎn)生密切相關(guān)，MSC對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等的激活和增殖具有抑制作用。MSC進(jìn)入機(jī)體優(yōu)勢(shì)分布于受損部位，促進(jìn)其恢復(fù)原有功能。將羊膜及絨毛膜來(lái)源的MSC利用其低免疫原性與人外周單個(gè)核細(xì)胞及豬外周單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞并無(wú)刺激增殖現(xiàn)象的產(chǎn)生，并以間接接觸方式抑制同種異體淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)。胎盤MSC與異體外周單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)，同樣細(xì)胞并無(wú)刺激增殖現(xiàn)象的產(chǎn)生淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，抑制效應(yīng)與細(xì)胞數(shù)量有正相關(guān)趨勢(shì)。MSC在為其他細(xì)胞增殖分化提供良好的微環(huán)境的同時(shí)，并無(wú)直接參與器官、組織修復(fù)再生。因此，MSC進(jìn)入機(jī)體后是否可以定向分化并準(zhǔn)確進(jìn)入靶部位；能否引發(fā)急性免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題就顯得尤為重要。

3.4 修復(fù)子宮內(nèi)膜 MSC可以分化為子宮內(nèi)膜上皮樣，成纖維樣及蛻膜成纖維樣間質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)MSC遷移至子宮內(nèi)膜受損處，通過(guò)旁觀者效應(yīng)機(jī)制對(duì)原有受損靶細(xì)胞優(yōu)先刺激并進(jìn)行修復(fù)處理，并非增殖、分化為受損靶細(xì)胞后再進(jìn)行靶組織功能修復(fù)。此修復(fù)機(jī)制表明，外源性的MSC經(jīng)誘導(dǎo)分化后，在損傷發(fā)生急性期，會(huì)有更好的治療效果。

4 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，干細(xì)胞替代治療和基因治療成為生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)和前沿, 并證實(shí)在組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。hUCMSCs的研究已成為傳統(tǒng)骨髓MSC的新生力量，雖然hUCMSCs的研究成果豐碩，但仍有許多問(wèn)題阻礙在臨床上正式應(yīng)用。首先關(guān)于hUCMSCs的生物學(xué)特點(diǎn)并不完善，同其免疫表型間有不確定性，因此應(yīng)控制并確認(rèn)hUCMSCs的生物學(xué)穩(wěn)定性。另外，MSC仍無(wú)明確標(biāo)志物，主要是根據(jù)它的形態(tài)、功能等鑒定MSC，沒(méi)有特異性標(biāo)志物或復(fù)合標(biāo)志物可供識(shí)別。其次細(xì)胞增殖、分化培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)因培養(yǎng)試劑、細(xì)胞密度、添加生長(zhǎng)因子等不同，造成同一來(lái)源干細(xì)胞再細(xì)胞表型、免疫表型、生物學(xué)特性等存在較大差異，進(jìn)而影響其應(yīng)用[28]。綜上所述，hUCMSCs作為MSC的新生力量，隨著其在組織、器官修復(fù)、細(xì)胞基因靶向治療、免疫移植治療等方面作用機(jī)制的不斷完善，會(huì)有更廣闊應(yīng)用前景。

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Study on the Biological Characteristics of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells and Related Research Progress in Obstetrics and Gynecology

FENGChun1,FENGLei1,LIANGSu-li1,CAONing1,YAOFu-qin1,YANJie-pei1,WANGQi1,LIYang1,ZHENGYin1,GUOLei2.

(1.TheShengShi(Beijing)BiologicalEngineeringCo.,LtdSCLGLtheShengShiofregenerativemedicinelab,Beijing100018,China; 2.DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,ChinaJapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Mesenchymal stem cells derives from multipotent stem cells of early development inmesoderm,with high degree of pluripotency and plasticity.Through culture in vitro under specific conditions,mesenchymal stem cells can proliferate and differentiate into a variety of somatic cells including cartilage cells,fat cells,nerve cells,etc.Human umbilical cord mesenchymal stem cells come from the relatively pure tissue of neonatal umbilical cord tissue,with the advantages of low cost and free from ethical issues and no damage to the provider,which provides a new approach for the wide application of tissue engineering in clinical obstetrics and gynecology.

Mesenchymal stem cells; Obstetrics and gynecology department; Biological characteristics; Application prospect

R711

A

1006-2084(2015)12-2133-04

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.008

2014-09-01

2014-12-03 編輯：相丹峰