韓殿冰，梁　玲，張朝陽(yáng)，趙　剛，馮大猛　(.汝州市第四人民醫(yī)院肝膽外科，河南 汝州 467500；.臨沂市婦幼保健院藥劑科，山東 臨沂 76000;.汝州市第一人民醫(yī)院普通外科，河南 汝州 467500)

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正性脾自體移植對(duì)DEN誘發(fā)大鼠肝癌的治療作用

韓殿冰1，梁玲2，張朝陽(yáng)3，趙剛3，馮大猛3(1.汝州市第四人民醫(yī)院肝膽外科，河南 汝州 467500；2.臨沂市婦幼保健院藥劑科，山東 臨沂 276000;3.汝州市第一人民醫(yī)院普通外科，河南 汝州 467500)

[摘要]目的探討正性脾自體移植對(duì)DEN誘發(fā)大鼠肝癌的治療作用。方法40只健康大鼠平均隨機(jī)分為A、B 2組，全部行脾切除，切除的脾凍存于液氮中；以DEN液喂食切除脾的大鼠以誘導(dǎo)肝癌；12周后誘癌成功的A組大鼠行自體脾移植，誘癌成功的B組假手術(shù)作為對(duì)照。結(jié)果A組大鼠術(shù)后生存期顯著高于B組大鼠，但A組大鼠死亡時(shí)移植脾組織尚未恢復(fù)到正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)論正性脾自體移植對(duì)DEN誘發(fā)的大鼠肝癌具有治療作用。

[關(guān)鍵詞]脾；移植；肝癌；治療

脾是人體最大的免疫器官，具有重要的免疫功能和抗癌作用[1-2]。脾的抗癌作用表現(xiàn)為雙時(shí)相性，在癌癥晚期可能促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，在癌癥早期脾尚有一定的抗癌作用[3-4]，那么，在更早期，即尚未發(fā)生癌癥的時(shí)候，脾的抗癌作用如何呢？目前尚未見(jiàn)此類(lèi)報(bào)道。為敘述方便，在此，我們將無(wú)癌癥時(shí)的健康脾稱(chēng)為“正性脾”，癌癥晚期的脾臟稱(chēng)為“負(fù)性脾”。基于正性脾的抗癌作用及脾與肝的密切關(guān)系，本研究試圖探討正性脾自體移植對(duì)DEN誘發(fā)的大鼠肝癌的治療作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

5周齡健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量145～160 g，隨機(jī)分為2組，每組20只。A組為實(shí)驗(yàn)組，B組為對(duì)照組。2組大鼠全部行脾切除，切除的脾編號(hào)后放在液氮中保存[5-6]。

1.2大鼠肝癌模型的建立

脾切除后大鼠的編號(hào)保持清晰可辨，必要時(shí)以記號(hào)筆重寫(xiě)以免造成混亂。術(shù)后7 d 用0.01%二乙基亞硝胺(DEN，購(gòu)于北京百靈威科技有限公司)的飲用水讓大鼠自由飲用誘癌。因DEN液易揮發(fā)，飲水瓶應(yīng)避光，每2 d更換1次新配的DEN液以保持濃度一致。

1.3自體脾移植

誘癌12周后全部大鼠開(kāi)腹探查，對(duì)疑有肝癌的部位取肝組織備病理學(xué)檢查，同時(shí)對(duì)A組行大網(wǎng)膜內(nèi)自體脾組織移植。B組假手術(shù)作為對(duì)照，病理證實(shí)未發(fā)現(xiàn)肝癌者棄之不用。術(shù)后所有大鼠開(kāi)始自由飲用不含DEN液的飲用水。

脾移植方法：取上腹部橫切口，探查肝。將12周前置于液氮中保存的脾解凍后，去除表面的包膜，將其剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎片，在大網(wǎng)膜上用3-0的絲線做1個(gè)荷包，將脾組織包埋移植于大網(wǎng)膜的荷包內(nèi)。假手術(shù)組僅用3-0的絲線荷包縫合大網(wǎng)膜，腹部切口絲線縫合。注意脾組織移植時(shí)應(yīng)做到自體移植。

1.4觀察指標(biāo)

病理變化：大鼠自然死亡后即刻打開(kāi)腹腔暴露肝臟，疑為肝癌的部位取部分肝組織，同時(shí)在大網(wǎng)膜內(nèi)切取部分脾組織以備病理檢查。所有切取的肝脾組織均置于10%福爾馬林液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色后觀察病理學(xué)變化。所有大鼠最后死亡時(shí)抽取心內(nèi)血液2 mL留待檢查肝功能及AFP。HITACH717全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行肝功能測(cè)定，ELISA法測(cè)定血清AFP水平。術(shù)后生存時(shí)間是指自體脾移植手術(shù)(或假手術(shù))后至自然死亡的時(shí)間。

1.5數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果

2.1誘發(fā)肝癌的情況

誘癌12周末A組存活17只，病理證實(shí)有肝癌15只。B組存活18只，病理證實(shí)有肝癌15只。誘癌成功的30只大鼠的肝癌結(jié)節(jié)散在分布于肝表面，在肝不同部位可見(jiàn)同時(shí)存在的癌結(jié)節(jié)。這些癌結(jié)節(jié)直徑1～3 mm，常有10～20個(gè)聚集成團(tuán)，如芝麻粒樣呈灰白色，肉眼觀察無(wú)明顯肝硬化表現(xiàn)(圖1a)。這些癌腫鏡下呈典型的肝細(xì)胞癌表現(xiàn)，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞異形性明顯，細(xì)胞核深染，大小不等，核仁明顯(圖1b)。

2.2移植脾的情況

液氮中保存12周的脾行病理檢查發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯壞死區(qū)，脾組織結(jié)構(gòu)清晰，紅髓、白髓、邊緣帶分界清楚，可見(jiàn)巨噬細(xì)胞，脾組織結(jié)構(gòu)基本正常(圖1c)。脾移植后48 d，脾組織的中心區(qū)以片狀壞死為主，紅、白髓結(jié)構(gòu)不清，在移植脾組織的周邊部位殘存有少量的組織細(xì)胞及散在淋巴細(xì)胞(圖1d)。

2.3肝功能及AFP的情況

肝功能及AFP的情況見(jiàn)表1，A組血清AFP明顯低于B組，2組比較P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別ALTASTALPAFPA組69.32±13.3483.25±16.74329.28±30.268.74±1.21*B組78.65±11.2189.57±18.21358.74±31.3613.25±2.06P值0.580.680.650.01

*：與B組比較，P<0.05

2.4術(shù)后生存情況

誘癌成功的30只大鼠無(wú)手術(shù)死亡，術(shù)后生存期A組24～48 d，平均(35.8±6.7)d，B組13～26 d，平均(18.5±3.6)d，2組大鼠術(shù)后生存期有顯著差異(P<0.05)。死亡原因均為肝癌破裂出血，死亡后剖腹發(fā)現(xiàn)2組大鼠癌腫均明顯變大。

a:誘癌12周后，肉眼見(jiàn)肝癌結(jié)節(jié)散在分布于肝臟的表面，如芝麻粒大小呈灰白色;b:誘癌12周后，病理切片見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞異形性明顯(HE×1 000);c:保存12周的脾組織結(jié)構(gòu)基本正常(HE×100);d:脾移植后48 d，脾組織的中心區(qū)以片狀壞死為主，紅、白髓結(jié)構(gòu)不清(HE×100)

圖1實(shí)驗(yàn)組誘發(fā)肝癌移植脾情況

3討論

DEN是一種很強(qiáng)的化學(xué)毒劑，作用的靶器官主要是肝，其誘發(fā)的大鼠腫瘤多為肝細(xì)胞癌，與人肝細(xì)胞癌發(fā)生過(guò)程相似，常被用于肝癌動(dòng)物模型的制備[7-10]。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，具有很強(qiáng)的抗癌能力，如人類(lèi)脾本身的惡性腫瘤發(fā)生率比其他實(shí)質(zhì)性臟器要少，有實(shí)驗(yàn)也表明以DEN誘發(fā)大鼠肝癌, 脾切除組大鼠的成癌更快、數(shù)目更多、直徑更大[11]。

惡性腫瘤的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可以認(rèn)為，惡性腫瘤的發(fā)生不僅是腫瘤自身的病變，也是一種全身性、系統(tǒng)性病變，這包括機(jī)體免疫功能的病變，即對(duì)惡性腫瘤免疫監(jiān)視和免疫排斥能力減弱。鑒于此，我們?cè)O(shè)想，肝癌發(fā)生時(shí)作為機(jī)體最大的免疫器官脾也發(fā)生了病變，其免疫功能減退，不能對(duì)肝癌的發(fā)展起到抑制作用。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)，即將健康大鼠的“正性脾”切除后凍存，此時(shí)脾屬健康脾,具有正常的免疫功能，待誘導(dǎo)肝癌成功后再將凍存的脾予以自體移植，以此來(lái)檢驗(yàn)正性脾的抗癌作用。

本實(shí)驗(yàn)表明，正性脾自體移植組肝癌大鼠的生存期明顯高于假手術(shù)組，血清AFP低于假手術(shù)組，表明移植的脾組織發(fā)揮了抗癌作用，但是，脾移植組大鼠術(shù)后最長(zhǎng)生存期為48 d，最終死于癌腫的增大和破裂出血，表明移植脾在生存期內(nèi)發(fā)揮的抗癌作用是有限的。有資料表明，小鼠大網(wǎng)膜內(nèi)自體脾移植2個(gè)月后出現(xiàn)白髓、紅髓結(jié)構(gòu)，術(shù)后6個(gè)月其結(jié)構(gòu)和功能才接近正常[12-13]。因此本實(shí)驗(yàn)可能是出現(xiàn)了這種情況，肝癌的發(fā)展速度快于移植脾的生長(zhǎng)速度，即移植脾尚未恢復(fù)到完全發(fā)揮其功能的時(shí)候，大鼠已過(guò)早地死亡。我們觀察到移植脾48 d時(shí)脾組織仍以壞死為主。如果我們能采取一些措施延緩肝癌的發(fā)展(如腫瘤切除)或加速移植脾功能的恢復(fù)，如肝表面脾片移植[14]，此不失為一種治療肝癌的非常有效的方法。

臨床上器官或組織移植治療惡性腫瘤的方法很多，如肝移植治療肝癌，骨髓移植治療白血病等，這些移植無(wú)論配型如何成功，或多或少都會(huì)表現(xiàn)出排異反應(yīng)，且免疫抑制劑的應(yīng)用常促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)[15]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的出發(fā)點(diǎn)不同于上述的器官或組織移植，我們是基于一種“自救”的想法設(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)：假設(shè)全身的免疫功能降低是惡性腫瘤發(fā)生的原因，則在惡性腫瘤發(fā)生前預(yù)存一些自體免疫器官或組織，待腫瘤發(fā)生后再移植這些器官或組織使其發(fā)揮抗腫瘤作用?；谶@種“自救理論”，我們還將進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)研究。

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(編輯：左艷芳)

Therapeutic effect of splenic autologous transplantation on rat liver cancer induced by DEN

HAN Dian-bing,LIANG Ling,ZHANG Zhao-yang,ZHAO Gang,FENG Da-meng(1.Department of Hepatobiliary Surgery,Fourth People’s Hospital of Ruzhou City,Ruzhou Henan 467500;2.Department of Pharmacy,Maternity and Child Care Centers of Linyi City,Linyi Shandong 276000;3.Department of General Surgery,First Hospital of Ruzhou City,Ruzhou Henan 467500,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of autologous transplantation of spleen on rat liver cancer induced by DEN. MethodsForty rats were randomly divided into A and B group on average.Total spleens of 40 rats were resected, which preserved in liquid nitrogen.All splenectomy rats were feeded with DEN to induce hepatocellular carcinoma.After 12 weeks ,all rats which had were successfully induced liver cancer were transplanted by autologous spleen in group A.Group B were sham operation as control. ResultsSurvival period was significantly higher in group A than that in group B.But transplanted splenic tissue had not recovered to normal morphological structure until these rats died. ConclusionAutologous transplantation of spleen has therapeutic effect for liver cancer induced by DEN.

Keywords:spleen;transplantion;liver cancer;treatment

[收稿日期]2014-09-29[修回日期] 2014-10-27

doi:10.11659/jjssx.09E014014

[中圖分類(lèi)號(hào)]R657.6；R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)02-0138-03