李曉丹，胡遠艷，邴　暉，于樹潤，丁　青，羅素蘭，長孫東亭

(海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室，海口市海洋藥物重點實驗室，海南 ?？?570228)

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不同因素對嗎啡誘導的小鼠CPP實驗的影響

李曉丹，胡遠艷，邴暉，于樹潤，丁青，羅素蘭，長孫東亭

(海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室，海口市海洋藥物重點實驗室，海南 ?？?570228)

摘要：為了比較不同因素對嗎啡誘導的小鼠條件性位置偏愛(CPP)實驗模型的影響，以建立理想的CPP模型，本實驗首先篩選出符合條件的小鼠來注射嗎啡(5 mg·kg-1)，分為皮下注射和腹腔注射2種不同給藥方式組，于不同給藥時間組連續(xù)皮下注射嗎啡3 d,5 d,7 d，并于不同測試時間(15 min或30 min)組，分別對小鼠進行CPP訓練，然后進行測試，同時以小鼠在伴藥箱(白箱)的活動時間為指標進行比較.結(jié)果表明：皮下注射和腹腔注射生理鹽水組與嗎啡組相比較，均存在極顯著性差異(P<0.001)；皮下注射嗎啡組與腹腔注射嗎啡組的差異性不顯著(P>0.05)，連續(xù)給藥3 d,5 d,7 d均能成功建立CPP模型(P<0.001)，CPP訓練后，3 d嗎啡組與5 d、7 d嗎啡組相比較，均存在極顯著差異(P<0.001)，5 d與7 d嗎啡組相比較，則存在顯著性差異(P<0.05).在連續(xù)給藥5 d的基礎上，不同測試時間(15 min與30 min)嗎啡組與生理鹽水組相比較，小鼠在伴藥箱的活動時間具有極顯著差異性(P<0.001).由此得出結(jié)論：皮下注射和腹腔注射2種給藥方式對嗎啡誘導的小鼠CPP模型的建立無影響；連續(xù)注射5 d所建立的CPP模型更穩(wěn)定，更經(jīng)濟，更理想；測試時間為 15 min時更省時，更具代表性.

關(guān)鍵詞：條件性位置偏愛(CPP)； 嗎啡； 小鼠； 影響因素

條件性位置偏愛(conditioned place preference, CPP)模型是根據(jù)巴甫洛夫的條件反射學說建立的，是研究藥物精神依賴性的重要模型之一[1]，它對深入研究藥物依賴的特征、開發(fā)治療成癮的藥物、探索形成藥物依賴的機制、以及指導臨床的脫毒治療等具有十分重要的意義.CPP模型訓練周期短，操作簡單，無藥狀態(tài)的監(jiān)測能排除藥物對檢測結(jié)果的干擾.但是， 目前CPP模型的建立尚無統(tǒng)一的標準，各種實驗因素，包括動物種類、藥物劑量、給藥途徑、給藥時程、用藥時間等的不同, 都會在不同程度上影響實驗研究的可靠性和準確性.CPP實驗裝置、藥物( 嗎啡、可卡因) 劑量等多方面對CPP模型建立的影響已有報道[2-4].國內(nèi)文獻所報道的多數(shù)是通過連續(xù)數(shù)天每天注射藥物或生理鹽水各1次，并且2次給藥的時間間隔為8 h的實驗方案來建立嗎啡CPP模型[5-7].在此基礎上，本研究比較了不同給藥方式、給藥時程、測試時間等關(guān)鍵因素對嗎啡所誘導的小鼠CPP模型的影響，以期選擇最佳的實驗條件來建立理想的嗎啡誘導的小鼠CPP模型，從而為后續(xù)用于戒煙或戒毒芋螺毒素的海洋藥物的研發(fā)提供整體的動物模型，同時也為其他來源的化合物提供藥效篩選的模型.

1材料與方法

1.1　材　料

1.1.1試驗動物昆明種小鼠(20～25 g)，雄性，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2013-0002.在標準環(huán)境下隨機分籠飼養(yǎng)( 7:00—19:00，明暗交替條件下飼養(yǎng))，試驗期間自由飲水和攝食.

1.1.2藥物鹽酸嗎啡注射液，青海制藥廠生產(chǎn)，批號：951030，用生理鹽水配制成所需的濃度.

1.1.3儀器條件性位置偏愛(CPP)試驗裝置(上海吉量公司生產(chǎn)的視頻跟蹤-計算機自動分析系統(tǒng))，該裝置由一塊中間隔板(一端有開口，供動物自由穿梭)將箱體分割成兩部分，分別為白箱和黑箱.試驗動物進入裝置后，該裝置頂部的攝像系統(tǒng)將監(jiān)視其行為活動，并由計算機記錄保存.

1.2　方　法

1.2.1嗎啡誘導的小鼠CPP模型的建立按照通用方法建立嗎啡誘導的小鼠CPP模型，分為預處理、訓練和測試3個階段.具體如下.

預處理階段：實驗開始第1天，小鼠被放置在兩箱中間，可任其自由穿梭，記錄小鼠一定時間內(nèi)在各箱活動的時間.試驗采取的是傾向性試驗程序，淘汰在黑箱時間百分比低于50%的小鼠，以小鼠在非偏愛的白箱作為伴藥箱進行試驗.

訓練階段：將符合條件的小鼠隨機分為不同實驗組，連續(xù)數(shù)天于早上8：00，對嗎啡模型組的小鼠注射嗎啡(5 mg·kg-1)，同時將對照組的小鼠注射同體積的生理鹽水后放入伴藥箱(白箱)，使其不可自由穿梭，持續(xù)時間為40 min；下午16：00，均注射等體積的生理鹽水后，放入黑箱，持續(xù)時間仍為40 min.

測試階段：即停止給藥24 h后，將小鼠放置在兩箱中間，可任其自由穿梭活動，記錄小鼠一定時間內(nèi)在伴藥箱活動的時間.

1.2.2不同因素對嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的影響在一般設計程序的基礎上，采用單因素試驗設計的方式，對影響嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的各個因素進行優(yōu)化，包括給藥方式、給藥時程、測試時間，以確立最佳的因素組合，用于CPP模型的建立.各試驗設計方法見表1 ，具體步驟如下.

不同給藥方式：將符合條件的小鼠隨機分為皮下注射(subcutaneous，s.c.)生理鹽水對照組、嗎啡模型組以及腹腔注射( intraperitoneal，i.p.)生理鹽水對照組、嗎啡模型組，每組8只，連續(xù)訓練5 d，測試時間為15 min.

不同給藥時程：將達到條件的小鼠隨機平均分為3 d組、5 d組和7 d組，每組8只, 并采用皮下注射的方式連續(xù)訓練3 d、5 d、7 d，測試時間為15 min.

不同測試時間：將達到條件的小鼠隨機平均分為3 d組，15 min組、30 min組；5 d，15 min組、30 min組，每組8只，同時采用皮下注射的方式連續(xù)訓練5 d，測試時間分別為15 min 或30 min.

表1　不同因素影響嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的試驗設計

1.3統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，用GraphPad Prism 5 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖；同時采用單因素方差分析，分析比較各組動物在伴藥箱中的活動時間；計算訓練前后小鼠在伴藥箱活動時間的增幅百分數(shù)，計算公式為：[(訓練后小鼠在伴藥箱的活動時間-訓練前小鼠在伴藥箱的活動時間)/訓練前小鼠在伴藥箱的活動時間]× 100 %，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異.

2結(jié)果與分析

2.1不同給藥方式對嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的影響對于CPP訓練前小鼠在伴藥箱的活動時間，皮下注射和腹腔注射嗎啡組與相應的生理鹽水組都在350~370 s 的范圍內(nèi)，在它們之間進行比較，統(tǒng)計分析顯示無顯著性差異(P>0.05).而在CPP訓練后，小鼠在伴藥箱的活動時間卻顯示，無論是皮下注射，還是腹腔注射，嗎啡組小鼠的活動時間范圍為 617~635 s，而生理鹽水組的小鼠，其活動時間范圍為 364~374 s，嗎啡組小鼠的活動時間明顯長于生理鹽水組，且它們之間的差異達到了極顯著水平(P< 0.001)，因而皮下注射和腹腔注射嗎啡這兩種給藥方式都能建立合格的小鼠CPP模型，它們的效果相等(見表2和圖1).因此，皮下注射和腹腔注射這兩種注射方式對嗎啡誘導的小鼠CPP模型的建立沒有影響.

2.2不同給藥時程對嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的影響CPP訓練前后小鼠在伴藥箱的活動時間，不同給藥時程(3 d、5 d、7 d)嗎啡組與生理鹽水組的比較結(jié)果見表3和圖2. 6組小鼠于CPP訓練前在伴藥箱的活動時間均在283～301 s的范圍內(nèi)，它們之間在訓練前的偏愛性是沒有差異的(P>0.05).在CPP訓練后，3 d、5 d和7 d嗎啡組的小鼠在伴藥箱的活動時間顯著延長，對于3 d嗎啡組的小鼠，其活動時間在424 s 左右，3 d生理鹽水組的小鼠，其活動時間在284 s左右；5 d嗎啡組的小鼠，活動時間在630 s左右，5 d生理鹽水組的小鼠，活動時間在298 s左右；7 d嗎啡組的小鼠，活動時間在566 s左右，7 d生理鹽水組的小鼠，活動時間在289 s左右.將3個嗎啡組與其相應的生理鹽水組的小鼠偏愛性進行比較，結(jié)果都存在極顯著差異(P<0.001)，這說明采用3 d、5 d、7 d這3個不同給藥時程均能建立小鼠CPP模型.當對這3個嗎啡組進行統(tǒng)計分析時，在3 d嗎啡組與5 d和7 d嗎啡組之間小鼠偏愛性存在極顯著性差異(P<0.001)，5 d和7 d嗎啡組的小鼠于CPP訓練后，其在伴藥箱的活動時間存在顯著性差異(P<0.05).結(jié)果顯示：連續(xù)給藥5 d所建立的嗎啡誘導的小鼠CPP模型的偏愛性最高，而且最穩(wěn)定、最經(jīng)濟和最理想.

2.3不同測試時間對嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的影響在給藥3 d和5 d的兩種條件下，分別研究了15 min、30 min這兩種測試時間對小鼠CPP模型建立的影響.在給藥3d的條件下(見表4，圖3)，對于CPP訓練前后小鼠在伴藥箱的活動時間，不同測試時間(15 min、30 min)嗎啡組與生理鹽水組間均具有差異顯著性，這說明無論是測試15 min，還是30 min，都能體現(xiàn)出小鼠CPP模型的建立是成功的.測試時間為15 min的嗎啡組與生理鹽水組，于訓練前小鼠在伴藥箱的活動時間為 283～300 s，訓練后嗎啡組的小鼠在伴藥箱的活動時間提高到 424 s左右，而訓練后生理鹽水組的小鼠在伴藥箱的活動時間幾乎沒有變化，在286 s左右.測試時間為15 min的嗎啡組小鼠比生理鹽水組小鼠的活動時間延長了約51%.對于測試時間為30 min的嗎啡組與生理鹽水組，于訓練前小鼠在伴藥箱的活動時間介于719～731 s之間，訓練后嗎啡組的小鼠在伴藥箱的活動時間提高到1 131 s左右，而訓練后生理鹽水組的小鼠在伴藥箱的活動時間同樣幾乎沒有變化，在726 s左右.測試時間為30 min的嗎啡組小鼠比生理鹽水組小鼠的活動時間延長了約58%(見表4，圖3).在測試時間為15 min和30 min的嗎啡組之間，于訓練前后其小鼠在伴藥箱的活動時間的增幅沒有顯著性差異.

在給藥5 d的條件下(見表5，圖4)， 對于CPP訓練前后小鼠在伴藥箱停留的時間，不同測試時間(15 min、30 min)嗎啡組與生理鹽水組相比較，都具有極顯著差異性(P<0.001)，說明無論是測試15 min，還是30 min，在給藥5 d的情況下，小鼠CPP模型的建立是最成功的.對于測試時間為15 min的嗎啡組與生理鹽水組，于訓練前小鼠在伴藥箱停留的時間在290～296 s 之間，訓練后嗎啡組的小鼠在伴藥箱停留的時間提高到 630 s左右，而訓練后生理鹽水組的小鼠在伴藥箱停留的時間沒有太大變化，平均在298 s左右；測試時間為15 min的嗎啡組小鼠比生理鹽水組小鼠的停留時間延長了約119%.對于測試時間為30 min的嗎啡組與生理鹽水組，于訓練前小鼠在伴藥箱停留的時間在747～803 s之間，訓練后嗎啡組小鼠在伴藥箱停留的時間提高到 1342 s左右，而訓練后生理鹽水組的小鼠在伴藥箱停留的時間同樣幾乎沒有變化，在763 s左右.測試時間為30 min的嗎啡組小鼠比生理鹽水組小鼠停留的時間延長了約67%(見表5，圖4).對于測試15 min和30 min的嗎啡組，于訓練前后其小鼠在伴藥箱停留的時間增幅存在極顯著性差異，也就是說，測試15 min的嗎啡組小鼠比測試30 min的嗎啡組小鼠所表現(xiàn)出的偏愛性更高，更靈敏.

3討論與結(jié)論

對嗎啡類藥物的依賴是由于濫用該類藥物所形成的復雜而異常的行為性疾病，它是不同個體受遺傳因素和社會環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果[8].迄今為止，嗎啡類藥物導致依賴性的機理還未被完全闡明，在臨床上亦缺乏有效的治療成癮的藥物.因而，建立動物的嗎啡依賴性模型是研究嗎啡依賴發(fā)生機制、以及研發(fā)戒煙或戒毒新藥過程中很關(guān)鍵的一步.條件性位置偏愛(CPP) 實驗模型是一種廣泛應用于藥物獎賞以及藥物渴求研究的動物模型.但是，由于目前國內(nèi)外研究中所選擇的試驗條件均不一致，模型的建立尚無統(tǒng)一的標準，各種試驗因素的不同，如動物種類、藥物劑量、給藥途徑、給藥時間、用藥時間、給藥次數(shù)、實驗箱的選擇、條件線索的設立等不同，都會在不同程度上影響整個試驗研究的可靠性和準確性[9]，為此，不同實驗室應該在參照以往實驗經(jīng)驗的基礎上，合理地設計，使條件性位置偏愛模型能更準確地應用到藥物成癮研究中.本實驗研究了皮下注射和腹腔注射2種不同給藥方式，不同給藥時程(3 d、5 d、7 d)及不同測試時間(15 min和30 min)對嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的影響，并利用優(yōu)化的實驗條件，建立了重復性好、敏感度高、穩(wěn)定而經(jīng)濟的CPP動物模型，它可為本實驗室后續(xù)海洋藥物(如用于戒煙或戒毒芋螺毒素的藥物)的研發(fā)提供實驗模型，同時它也可為其他來源的化合物提供抗成癮藥物的篩選模型.

注射嗎啡后小鼠會出現(xiàn)豎尾反應，這是鑒別藥物成癮的一種簡易方法[10]，因為小鼠的豎尾反應與毒品成癮有一定的平行關(guān)系[11]，對于成癮性強的藥品，如鴉片、海洛因、嗎啡、冰毒等，小鼠的豎尾指數(shù)較大；而對于成癮性弱的藥品，如可待因、K粉等，小鼠的豎尾指數(shù)則較小.在本試驗中，于注射完嗎啡15 min后，小鼠出現(xiàn)豎尾，非常興奮并且不停走動，歷經(jīng)2 h左右才趨于正常，這與所文獻報道的相類似.由于小鼠批次不同，相同的處理組在訓練前后小鼠在伴藥箱的活動時間會有所差異，但由于本實驗采用的是單因素試驗設計的方式，所以該差異對本實驗無影響.

根據(jù)文獻記載[2]，給藥方式對CPP模型的建立有影響，以皮下注射和腹腔注射較為常見.本實驗通過皮下注射和腹腔注射兩種給藥方式建立了嗎啡誘導的小鼠CPP模型，結(jié)果顯示，連續(xù)5 d皮下注射或者腹腔注射嗎啡(5 mg/kg) ，均可成功地誘導和訓練小鼠建立CPP模型.然而，腹腔注射時，容易出現(xiàn)意外，例如：注射入膀胱、針頭扎傷內(nèi)臟等，這都會影響試驗結(jié)果，皮下注射則相對簡單且易操作；因此，對于不同給藥方式組和不同測試時間組，均可采用皮下注射法.所以，在根據(jù)實驗室條件的基礎上，可以自由選擇皮下注射或者腹腔注射法，而本實驗室多采用皮下注射法.

根據(jù)文獻報道[12]，一次注射定量的嗎啡不易成癮，而分次注射一段間后則容易成癮.國內(nèi)一般多選用連續(xù)給藥數(shù)天，如每天上午和下午分別注射嗎啡和生理鹽水(間隔8 h),因此，給藥時間與嗎啡誘導的小鼠CPP模型的建立有相關(guān)性.本實驗選擇了不同的給藥時間，并將其分為3組，即3 d組、5 d組和7 d組，觀察了其對嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的影響，目的是為了選擇最佳的給藥時程.實驗結(jié)果顯示：3 d組、5 d組和7 d組均可建立CPP模型，然而3 d與5 d比較，3 d所建立的CPP模型不夠穩(wěn)定，7 d與5 d比較，7 d所建立的CPP模型其效果不夠顯著，且耗時長，所需嗎啡較多，不夠經(jīng)濟.所以，連續(xù)給藥5 d所建立的嗎啡誘導的小鼠CPP模型最穩(wěn)定、最經(jīng)濟、最理想，因此，在比較不同測試時間時僅連續(xù)訓練3 d 和5 d.

目前，在動物CPP 實驗環(huán)境中通常采用活動時間和活動距離兩種行為指標來監(jiān)測CPP模型的建立效果[13].對于測試時間， 有文獻報道，過長的測試時間會引起CPP條件反應的消退[14].為此，本實驗通過不同的測試時間(15 min和30 min)來記錄嗎啡誘導的小鼠CPP模型建立的效果，結(jié)果顯示：測試時間為30 min與15 min時，均能顯示CPP模型的成功建立，在連續(xù)給藥3 d的基礎上，二者無明顯差異，在連續(xù)給藥5 d的基礎上，測試時間為15 min的嗎啡組小鼠，其偏愛性更靈敏，且它與測試時間為30 min的嗎啡組小鼠之間存在極顯著差異.因而，選用連續(xù)注射嗎啡5 d和測試時間為15 min來建立CPP模型，且以來建立的模型更省時、偏愛性更顯著、更具代表性.

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Effects of Different Factors on Morphine-induced Conditioned Place Preference of Mice

Li Xiaodan, Hu Yuanyan, Bing Hui, Yu Shurun, Ding Qing, Luo Sulan, Zhangsun Dongting

(Key Laboratory of Tropical Biological Resources, Ministry of Education; Key Lab for Marine Drug of Haikou, Hainan University, Haikou 570228,China)

Abstract：To compare the effects of the different experimental conditions on morphine-induced conditioned place preference of mice and establish satisfactory CPP model, in the report, the eligible mice injected with morphine (5mg/kg) were divided into different groups random for conditioned place preference (CPP) training according to intraperitoneal injection (i.p.) or subcutaneous injection (s.c.); 3 d, 5 d, and 7 d different continuous injection time; and 15 min or 30 min different testing time. Each group mice received an injection of morphine (5mg/kg) or saline, and then, the time spent in the drug-paired box was observed. The results indicated that it was obvious that morphine groups significantly induced CPP effect after training, but no CCP effects occurred in saline groups, whatever it was s.c. or i.p. injection (P<0.001). CPP model could be constructed through 3d, 5d, or 7d different continuous injection of morphine, the differences among these groups were significant. The time spent in drug-paired box was significant difference between 15 min and 30 min testing time based on 5 d continuous injection of morphine (P<0.01). These results suggested that the different injection s.c. or i.p. has no effects on morphine induced CPP model of mice; 5d continuous injection is the most stable, economical, and ideal condition for the construct of the morphine-induced CPP mice model; the test time of 15 min is the most time-saving and most representative.

Keywords：Conditioned place preference (CPP); Morphine; Mice; Experimental factors

中圖分類號：R 964

文獻標志碼：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2015.0026

文章編號：1004-1729(2015)02-0141-06

收稿日期：------------------------ 2015-12-08基金項目： 國家自然科學基金(41366002)；海南省社會發(fā)展科技專項(SF201328); ?？谑兄攸c科技計劃項目(2013-16)；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT1123)資助.

作者簡介：李曉丹(1990-)，女，漢，山西運城，2013級碩士研究生，研究方向：海洋藥物，E-mail:lixiaodan816@163.com通信作者： 長孫東亭， 男，副研究員，研究方向：海洋藥物，E-mail: zhangsundt@163.com