吳靖娜

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013;

2.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013)

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鮑內(nèi)臟肽粉的抗氧化活性研究

吳靖娜1,2

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013;

2.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013)

摘要：建立了酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠模型，通過檢測模型組、對照組和各給藥組的小鼠血清和肝臟組織中的丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)羰基含量(PCO)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的變化來評價(jià)鮑內(nèi)臟肽粉(AVPP)的抗氧化活性.結(jié)果表明，長期低濃度的酒精攝入可顯著提高小鼠的MDA和PCO含量，降低T-SOD和T-AOC活力(P<0.05)，對小鼠具有一定的氧化損傷作用，建模方式可行.AVPP可顯著降低模型小鼠的MDA和PCO含量，提高T-SOD、T-AOC、GSH和GSH-PX活力，對小鼠的氧化損傷可起到保護(hù)作用，具有較好的抗氧化活性.

關(guān)鍵詞：鮑內(nèi)臟肽粉； 抗氧化； 小鼠； 酒精

氧化應(yīng)激源自內(nèi)源性抗氧化物防御體系與生成自由基間的不平衡，在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體具有糾正這種不平衡的能力[1]，然而衰老及不利的環(huán)境因素會(huì)引起這種代謝失衡，導(dǎo)致自由基的積累，破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，從而引起一系列的病理過程[2-3].隨著人們生活水平的提高，抗氧化與抗衰老問題越來越受到人們的關(guān)注，目前臨床證實(shí)有效且應(yīng)用較多的外源性抗氧化活性物質(zhì)有維生素C、維生素E、D-甘露醇等[4].近年來，隨著海洋生物資源開發(fā)的研究不斷深入，通過補(bǔ)充源于海洋生物的抗氧化活性因子來調(diào)整自由基的平衡已成為機(jī)體氧化損傷修復(fù)的研究熱點(diǎn)[5-6].鮑內(nèi)臟含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分及一些生物活性物質(zhì)，鑒此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證其抗氧化功效，本項(xiàng)目組對鮑內(nèi)臟抗氧化活性肽制備工藝進(jìn)行了研究，并通過體外化學(xué)和細(xì)胞試驗(yàn)證明其具有較好的抗氧化功效，因此，本文期望通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對其抗氧化功效進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，從而為鮑內(nèi)臟多肽功能產(chǎn)品的開發(fā)提供理論支持.

建立具代表性的和可靠的氧化應(yīng)激動(dòng)物模型是進(jìn)行體內(nèi)評價(jià)的重要前提，目前的制模方式主要有外源性(給予受試動(dòng)物D-半乳糖、四氯化碳等)和內(nèi)源性(基因改良型模型)兩種制模方式[7]，但是它們主要是局部氧化應(yīng)激模型，而對于更具意義的系統(tǒng)性氧化應(yīng)激模型的研究卻仍然較少.酒精是一種具有高滲透性的氧化應(yīng)激源，研究表明，酒精經(jīng)醇脫氫酶(ADH)、微粒體酒精氧化系統(tǒng)(MEOS)、過氧化氫酶(Catalase)催化代謝[8]后，會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)、活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)以及導(dǎo)致體內(nèi)不利微環(huán)境的形成[9]，如組織缺氧、細(xì)胞因子釋放等，酒精所誘發(fā)的損傷可以波及機(jī)體的各個(gè)組織器官[10]，它是誘導(dǎo)組織氧化應(yīng)激的方式之一.本研究采用長期攝入低濃度酒精的方式來建立小鼠氧化應(yīng)激模型，并在試驗(yàn)過程中分不同時(shí)期給予不同劑量的鮑內(nèi)臟肽粉，借此來對其抗氧化活性進(jìn)行評價(jià).

1材料與方法

1.1材料與儀器鮑內(nèi)臟肽粉(AVPP)：福建省水產(chǎn)研究所研制；SPF級8周齡KM雄性小鼠，體重(25±5)g：購自上海斯萊克動(dòng)物有限公司；抗壞血酸(分析純)：購于西隴化工股份有限公司；無水乙醇(分析純)：購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水(0.9%)：購于福州海王福藥制藥有限公司.

丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、谷胱甘肽(glutathione ,GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase ,GSH-Px)、蛋白質(zhì)羰基含量(protein carbonyl content, PCO)、蛋白定量測試盒均購于南京建成生物制品研究所.

UV-3200紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)； HH-6小型三用恒溫水浴箱：國華電器有限公司；5810R臺式高速大容量冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf 公司；BS124S型分析天平：賽多利亞科學(xué)儀器(北京)有限公司；JXFSTPRP系列F6/10手持式高速顯勻漿機(jī)：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司.

1.2方法試驗(yàn)

1.2.1動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)72只KM小鼠在溫度(21±2)℃，相對濕度(65±10)%的動(dòng)物房適應(yīng)1周后，按體重隨機(jī)將其分為6組，每組12只，第Ⅰ組：正常對照組；第Ⅱ組：酒精模型組；第Ⅲ組：VC陽性對照組(200 mg/kg·wb)；第Ⅳ～Ⅵ組：AVPP低(100 mg/kg·wb)、中(200 mg/kg·wb)、高(300 mg/kg·wb)劑量組.

每隔7 d稱1次小鼠體重，實(shí)驗(yàn)期共持續(xù)5周：預(yù)防性干預(yù)期(第1周)，第Ⅰ組與第Ⅱ組以0.3 mL生理鹽水灌胃；第Ⅲ組給予0.3 mL VC溶液灌胃；第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ各組按比例給予0.3 mL(低、中、高濃度) AVPP水溶液灌胃.試驗(yàn)期(第2周～第5周)，第Ⅰ組每天給予0.3 mL生理鹽水灌胃；第Ⅱ組每天給予0.3 mLφ=25 %的酒精灌胃；第Ⅲ組給予0.3 mLφ=25 % 的酒精與VC(200 mg/kg·wb)的混合液灌胃；第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別給予0.3 mLφ=25 % 的酒精與100 mg/kg·wb、200 mg/kg·wb、300 mg/kg·wb相應(yīng)劑量AVPP混合液灌胃[11].所有小鼠自由攝食飲水，試驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物禁食24 h后，經(jīng)眼靜脈取血，同時(shí)以頸椎脫臼法處死，取肝臟，用生理鹽水洗凈后，置于離心管中，于-80 ℃儲(chǔ)存，待測.

1.2.2抗氧化功能指標(biāo)測定 取血，靜置10 h后，在4 ℃以 3 000 r·min-1離心10 min(制備血清)，并按測試盒的說明分別測定血漿的MDA含量、T-SOD活性 和T-AOC活性.

取肝臟，1份用適量的w=0.9 %的生理鹽水配成w=10 %的肝臟勻漿液，以2 500 r·min-1離心10 min，然后測定肝臟組織中的蛋白質(zhì)含量、MDA含量、T-SOD活性、GSH和GSH-PX活性；1份用PCO測試劑的勻漿介質(zhì)配成w=10 % 的肝臟勻漿液，并以2 500 r·min-1離心10 min，用以測定肝臟組織中的PCO.

1.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用單因子方差分析(One-way ANOVN, Duncan)進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示.

2結(jié)果與分析

2.1對小鼠體重的影響體重指標(biāo)可以在一定程度上反應(yīng)小鼠的生長發(fā)育情況.在整個(gè)飼養(yǎng)過程中，各組小鼠均活潑好動(dòng)，食欲良好，皮毛順滑有光澤.由表1可知，小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后(第1天)，各組小鼠體重均衡，無顯著差異(P>0.05)；隨著喂養(yǎng)時(shí)間的增加，各組小鼠體重都有所增加，其中酒精模型組(Ⅱ)、Vc陽性對照組(Ⅲ)、低劑量AVPP(Ⅳ)組、高劑量AVPP (Ⅵ)組與正常對照組(Ⅰ)間無顯著差異(P>0.05)，說明灌胃酒精、VC、低劑量以及高劑量AVPP對小鼠的體重、生長發(fā)育未造成明顯的影響；灌胃第7天開始，中劑量AVPP( Ⅴ)組的小鼠體重與正常對照組(Ⅰ)間有顯著差異(P<0.05)，說明中劑量AVPP灌胃對小鼠體重有一定的增長作用.

表1　實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠的體重變化

注：Ⅰ—正常對照組；Ⅱ—酒精模型組；Ⅲ—Vc陽性對照組；Ⅳ—低劑量AVPP組；V—中劑量AVPP組；Ⅵ—高劑量AVPP組；*表示與Ⅰ組相比差異顯著(P<0.05).

2.2對小鼠血清MDA含量、T-SOD活力和T-AOC活力的影響從圖1-A可知，酒精模型組小鼠血清的MDA含量為10.06 nmol·mL-1，明顯高于正常對照組(P<0.05)，這表明長期的酒精攝入對小鼠造成了一定程度的脂質(zhì)氧化損傷；VC、低、中、高AVPP劑量組的MDA含量比酒精模型組分別少了2.77，1.35，1.69，3.59 nmol·mL-1，其中，VC、高劑量AVPP組與酒精模型組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與正常對照組的差異不顯著(P>0.05).

經(jīng)口灌胃35 d后(見圖1-B)，酒精模型組小鼠血清的T-SOD活力為248.36 U·mL-1，顯著低于正常對照組的215.98 U·mL-1(P<0.05)，表明長期的酒精灌胃對小鼠具有一定的氧化應(yīng)激損傷作用；與酒精模型組相比，各組小鼠血清中 T-SOD活力均有所升高，VC、低、中、高AVPP劑量組的T-SOD活力分別升高了 17.59，9.72，32.74，29.54 U·mL-1，其中，中、高AVPP劑量組的T-SOD活力顯著高于酒精模型組(P<0.05)，與正常對照組無顯著差異(P>0.05)，這表明AVPP能顯著提高血液中T-SOD的活力.

由圖1-C發(fā)現(xiàn)，酒精模型組小鼠血清的T-AOC明顯低于正常對照組(P<0.05)，表明酒精對小鼠的健康狀況造成了一定的影響，致使小鼠的總抗氧化能力減弱；各組小鼠血清的T-AOC均高于酒精模型組，分別高出4.52，7.11，8.30，9.62 U·mL-1，且差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，表明Vc和AVPP對小鼠都有抗氧化保護(hù)作用，能增強(qiáng)小鼠的總抗氧化能力.

圖1　對小鼠血清中MDA、T-SOD和T-AOC的影響

注：同列數(shù)值中標(biāo)注不同字母表示對應(yīng)組別間差異顯著(P<0.05)；反之，標(biāo)注相同字母則表示對應(yīng)組別間差異不顯著(P>0.05)；圖2同

2.3對小鼠肝臟MDA、PCO、SOD、GSH和GSH-PX活性的影響如圖2-A所示，酒精模型組小鼠肝臟的MDA含量均高于其他組，比正常、 VC、 低、 中、 高AVPP劑量組分別高出了 3.66，7.32，1.86，6.18，7.80 nmol·mg-1prot，但差異均不顯著(P>0.05).經(jīng)口灌胃35 d后(見圖2-B)，酒精模型組小鼠肝臟的PCO明顯高于正常對照組的PCO(P<0.05)，表明酒精對小鼠機(jī)體的蛋白質(zhì)造成了氧化損傷；酒精模型組的PCO比VC、低、中、高AVPP劑量組分別高出了8.81，4.25，11.17，16.14 nmol·mg-1prot，其中與高AVPP劑量組的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05).

由圖2-C可以看出，T-SOD活力指標(biāo)的測定效果較明顯，酒精模型組小鼠肝臟的T-SOD活力顯著低于正常對照組(P<0.05)，說明長期攝入低濃度酒精會(huì)引起肝臟組織的氧化損傷；Vc、低、中、高AVPP劑量組小鼠肝臟的T-SOD活力比酒精模型組分別高出33.05，39.86，43.30，81.43 U·mg-1prot，且均達(dá)到顯著水平(P<0.05).經(jīng)口灌胃35 d后(見圖2-D)，酒精模型組小鼠肝臟的GSH含量與正常對照組差異不顯著(P>0.05)，表明酒精造模對小鼠GSH含量影響不大；VC陽性對照組和高AVPP劑量組的GSH含量顯著高于酒精模型組的GSH含量(P<0.05)，分別高出4.97 U·mg-1prot和5.59 U·mg-1prot.同時(shí)，由圖2-E可發(fā)現(xiàn)，正常對照組小鼠肝臟的GSH-PX活力雖然略高于酒精模型組小鼠肝臟的GSH-PX活力，但是差異沒有顯著性意義(P>0.05)，表明酒精攝入對小鼠GSH-PX活力的影響不大；VC陽性對照組和中劑量AVPP組小鼠肝臟的GSH-PX活力顯著高于酒精模型組(P<0.05)，分別高出71.72、41.24 U·mg-1prot.

圖2　對小鼠肝臟組織MDA、PCO、SOD、GSH和GSH-PX的影響

3討論

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其可進(jìn)一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，使細(xì)胞脆性增加和變形性降低，從而導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能的改變[12].PCO是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的一個(gè)重要標(biāo)志物，它產(chǎn)生于活性氧攻擊氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基后最終生成的NH3和相應(yīng)的羰基衍生物[13].因此，測定MDA和PCO含量能間接反映氧化應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體受損傷的程度.T-SOD、GSH-PX和GSH是體內(nèi)重要的抗氧化酶系.T-SOD可有效地清除自由基反應(yīng)的啟動(dòng)因子(O2-)，抑制和阻斷自由基，降低自由基代謝產(chǎn)物的生成[14]；GSH-PX可特異地催化還原型GSH對過氧化物的還原反應(yīng)，阻斷由過氧化物所引發(fā)的自由基對機(jī)體的損害，保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化的損傷，亦可催化對生物體有害的H2O2的分解，減少自由基和過氧化脂質(zhì)的形成；而GSH含量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素；機(jī)體防御體系的T-AOC能力強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系[15].

本研究以長期低濃度的酒精攝入的方式建立了系統(tǒng)性氧化應(yīng)激小鼠模型，結(jié)果顯示，酒精模型組小鼠血清的MDA含量高于正常對照組，T-SOD和T-AOC活力均低于正常對照組(P<0.05)，酒精模型組小鼠肝臟的PCO高于正常對照組，T-SOD活力低于正常對照組(P<0.05)；表明長期低濃度的酒精攝入對小鼠具有一定的氧化損傷作用，建模方式可行.然而，雖然酒精模型組中小鼠肝臟的MDA含量高于正常對照組，而GSH和GSH-PX活力低于正常對照組，但是其差異不顯著(P>0.05)，為此，在酒精劑量、持續(xù)灌胃周期的選擇上仍需進(jìn)一步優(yōu)化.

在攝入酒精進(jìn)行造模的基礎(chǔ)上又給小鼠灌喂VC和低、中、高劑量的AVPP，各劑量組小鼠血清的MDA含量相對于酒精模型組均有降低，T-SOD和T-AOC活力均有所升高，其中，VC、高劑量AVPP組的MDA含量，中、高劑量AVPP組的T-SOD活力，VC和低、中、高劑量AVPP組的T-AOC活力與酒精模型組的差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；各劑量組小鼠肝臟組織的MDA和PCO含量相對于酒精模型組均有下降，T-SOD、GSH和GSH-PX活力均有所提高，其中，高劑量AVPP組的MDA含量，VC、低、中、高AVPP劑量組的T-SOD活力，VC和高劑量AVPP組的GSH含量，VC和中劑量AVPP組的GSH-PX活力與酒精模型組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可判斷AVPP 可以有效降低模型鼠的氧化損傷程度，保護(hù)機(jī)體免受自由棊損傷.同時(shí)，由試驗(yàn)結(jié)果還可發(fā)現(xiàn)，AVPP的中劑量組的綜合指標(biāo)明顯優(yōu)于低、高劑量組，因此，推斷AVPP在200 mg/kg·wb的劑量下可發(fā)揮良好的抗氧化功效.

4結(jié)論

綜上所述，通過小鼠長期攝入低濃度酒精造成小鼠的氧化損傷，可達(dá)到酒精造模的目的.從鮑內(nèi)臟提取的AVPP可有效地清除自由基，保護(hù)機(jī)體內(nèi)氧化-抗氧化平衡狀態(tài)；降低MDA和PCO含量，提高T-SOD、T-AOC、GSH和GSH-PX活力，減少機(jī)體的細(xì)胞損傷，具有一定的抗氧化能力.

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Antioxidant Activity of Abalone Viscera Polypeptide

Wu Jingna1,2

(1. Fisheries Reasearch Instiute of Fujian, Key Laboratory of Cultivation and High-value

Utilization of Marine Organisms in Fujian Province, Xiamen 361013，China;

2. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361013,China)

Abstract：In the report, an alcohol-induced oxidative stress mice model was established, and the mice were divided into model group and control group, which are administrated with AVPP, and the changes of malonic dialdehyde (MDA), protein carbonyl content (PCO), total superoxide dismutase (T-SOD), total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione (GSH), glutathion peroxidase (GSH-Px)in plasma and liver were detected to determine the antioxidant activity of abalone viscera polypeptide. The results indicated that the MDA in plasma and PCO in liver of model were significantly higher than that in the control group (P<0.05), the activity of T-AOC in plasma and the activity of SOD both in plasma and in liver of model were lower than that in the control group (P<0.05), which suggested that the oxidative stress model could be established by lower concentration of alcohol for a long time; the MDA in plasma and PCO in liver of AVPP group were significantly reduced (P<0.05), the activity of T-AOC in plasma and the activity of SOD, GSH, GSH-PX both in plasma and in liver of AVPP group were decreased (P<0.05), which suggested that the AVPP has significant antioxidant activityinvivo.

Keywords：alcohol; mice; Abalone viscera polypeptide; antioxidant

中圖分類號：TS 254.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2015.0028

文章編號：1004-1729(2015)02-0152-06

收稿日期：------------------------ 2015-01-19基金項(xiàng)目： 國家海洋公益性科研專項(xiàng)(201405016); 福建省科技重大專項(xiàng)(2014NZ0001-1);廈門市海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展專項(xiàng)(14CZP041HJ15)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(2013)

作者簡介：吳靖娜(1984-)，女，福建南安，碩士，助理研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與綜合利用研究, E-mail: 31301863@qq.com.