黎高翔

自1970年開始，在酶制劑工業(yè)的基礎(chǔ)上，我國酶工程研究只局限于當(dāng)時興起的固定化酶及細(xì)胞、生物傳感器、生物反應(yīng)器以及天然酶誘變育種的酶制劑工業(yè)。在1988年召開的全國固定化生物催化劑會議上，已有大量成果問世，為中國酶工程的發(fā)展打下了堅實的基礎(chǔ)。

但是，早在1971年美國工程基金會就已組織了第一屆國際酶工程會議，事隔10年，直至1981年在日本召開的第六屆國際酶工程會議上，才以張樹政院士為代表的我國科研人員首次參會。當(dāng)時，我國酶工程領(lǐng)域研究大大落后于國際水平。

為了適應(yīng)國際酶工程的迅猛發(fā)展，加強國內(nèi)外同行的學(xué)術(shù)交流與合作，在鄒承魯院士、張樹政院士和國內(nèi)著名專家倡議下，中國微生物學(xué)會于 1989年 7月成立了酶工程專業(yè)委員會，當(dāng)年就立即組織了12人代表團(tuán)赴日本參加第十屆國際酶工程會議，并與日方商約好每兩年召開一次中、日酶工程會議。直至2004年韓國要求加入形成了中、日、韓三方的酶工程會議。至現(xiàn)在，25年中連續(xù)成功舉辦了十四屆中、日、韓酶工程會議，已形成了亞洲酶工程的軸心。

1997年，經(jīng)國際酶工程組委會批準(zhǔn)，由我國酶工程專業(yè)委員會在北京主辦了第十四屆國際酶工程會議[1]，會議由南開大學(xué)俞耀庭教授和國際酶工程組織委員會委員黎高翔研究員任大會主席。會上，鄒承魯院士、張樹政院士、田波院士、王志珍院士等我國8位酶學(xué)專家作了特邀報告。顯示了中國酶工程研究的初步成果，獲得國際上的一致好評。此次大會云集了國際上很著名的酶工程專家教授，如美國Arnold F H教授、Klibanov A M教授、Blanch H B教授、Dordick J S教授、Russell A J教授、Clark D S教授、瑞典Mosbach K教授、德國Wandrey C教授、Scheller F教授、日本Tanaka A教授、Karube I教授、Shimizu S教授和以色列Katchalski-Katzir E教授等，是一次國際上高水平的酶工程盛會，與會者充分領(lǐng)略了國際酶工程的新領(lǐng)域、新思想、新技術(shù)。

這之后的 1989–2014年，我國共舉辦了 9屆全國酶工程會議，酶工程的研究和應(yīng)用在國內(nèi)得到廣泛重視，科研工作者們?nèi)翰呷毫?，擴展了酶工程研發(fā)的很多新領(lǐng)域，歷經(jīng)25年的奮斗拼搏，在我國各科研院校形成了許多優(yōu)秀的科研隊伍，建立了許多酶工程研發(fā)的技術(shù)平臺和中心，學(xué)術(shù)水平迅速提高，在酶工程的主要領(lǐng)域，已趕上或有些已超越了國際先進(jìn)水平，有些獲得國家科學(xué)技術(shù)發(fā)明和進(jìn)步獎，為國家酶工程產(chǎn)業(yè)化作出了重要貢獻(xiàn)。

1 酶的基因工程與蛋白質(zhì)工程

工業(yè)生物催化在20世紀(jì) 90年代興起，與蛋白質(zhì)定向進(jìn)化、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展有關(guān)。工業(yè)生物催化的核心是酶的應(yīng)用，與傳統(tǒng)的化學(xué)催化相比較，生物催化有位點專一性和立體專一性的優(yōu)勢，人們可以按人類的意愿進(jìn)行“再進(jìn)化”手段，而不需要了解酶的結(jié)構(gòu)，可以采取基因克隆、隨機突變或雜交、定點突變，用易錯PCR方法構(gòu)建突變庫，結(jié)合高通量篩選策略來提高酶的活性、穩(wěn)定性、立體選擇性及非水反應(yīng)性能。

我國在過去25年中 (至2014年)，共9屆的全國酶工程會議上，發(fā)表論文總數(shù)為978篇，其中酶基因工程與蛋白質(zhì)工程論文達(dá)到356篇，占總論文數(shù)36.4% (表1)。是一次很大的飛躍和崛起[2-10]?！渡锕こ虒W(xué)報》曾于2009年與2012年結(jié)合酶工程會議出版了“酶工程”系列?？痆11-12]。

木聚糖酶是半纖維素降解的關(guān)鍵酶，我國用橄欖綠鏈霉菌基因轉(zhuǎn)到畢赤酵母 Pichia pastoris獲得高效表達(dá)。酶活性為1 200 U/mL，比活性為2 869 U/mg。具非常好的抗蛋白酶降解能力[3]。嗜酸真菌Biospora sp. MEY-1四個基因成功克隆到畢赤酵母異源表達(dá)，重組酵母XYL11酶比活力為1 8831 U/mg，90 10℃ min仍保留87%以上活力。降解燕麥木聚糖主要產(chǎn)木糖和木二糖，具有很好抗蛋白酶降解的能力[8]。用黑曲IME-216產(chǎn)木聚糖基因克隆到釀酒酵母中表達(dá)，活力提高到 90 000 U/mL[8]，其余 30多篇木聚糖酶基因在Escherichia coli等中表達(dá)的論文不再一一詳述。

飼料用酶已成為世界工業(yè)酶產(chǎn)業(yè)中增長最快、實力最強的酶工業(yè)。植酸酶是飼料中植酸降解為無機磷酸和肌醇的飼料添加劑，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所將黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶基因重組到畢赤酵母中得到高效表達(dá)，酶活力達(dá) 8×105IU/mL，比原黑曲霉產(chǎn)量提高了3 000倍以上，大大高于國外報道的工程菌[4,11]，國內(nèi)已建立了多家生產(chǎn)企業(yè)。

纖維素酶是多酶的復(fù)合酶系，非理性設(shè)計是目前纖維素酶定向進(jìn)化的方法，木霉纖維素外切酶和纖維素內(nèi)切酶已在噬菌體展示功能。目前已經(jīng)克隆表達(dá)一批中堿性纖維素酶的基因，可用于紡織和洗滌劑，造紙工業(yè)用途的中性內(nèi)切纖維素酶工程菌優(yōu)化培養(yǎng)，酶活可達(dá)32 529 U/mL[10]，提高了原株的7.8倍。將福壽螺 Ampullaia crossean多功能纖維素酶基因在E. coli中表達(dá)，得到高比活力纖維素酶系，對木聚糖、對硝基酚纖維二糖苷、羧甲基纖維素有很好的水解活性[5]?？寺M康木霉S38 Swollenin基因可能是破壞氫鍵，是真菌降解纖維素酶系的組成部分[6]。此外，我國還開展了黃翅大白蟻木質(zhì)纖維素降解酶系的研究[10]。

脂肪酶是生物合成中一個重要酶類。目前我國已建立了通過理性設(shè)計成熟的 3個脂肪酶基因改造、生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)平臺。用基因改組技術(shù)將抗展青霉 Penicillium expansum FS 8486酶活力提高了317%[7]。對脂肪酶“蓋子”結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定點突變，獲得開蓋型脂肪酶，酶比活力提高5.7倍，兩相催化效率提高1.8倍[8]。我國還構(gòu)建了表面展示工程菌、E. coli工程菌、畢赤酵母工程菌、高密度培養(yǎng)的技術(shù)平臺，假絲酵母 Candida sp. 99–125脂肪酶活力達(dá)到15 000 U/mL以上[9]?？寺∶缀诟?R. miehei脂肪酶在兩個畢赤酵母成功表達(dá)，最高酶活力達(dá)到18 000 U/mL。4 6℃?zhèn)€月酶活力不下降，12 h生物柴油產(chǎn)率超過95%[9]。華根霉Rhizopus chinensis脂肪酶基因克隆到畢赤酵母中成功表達(dá)，兩種共表達(dá)的伴侶蛋白可使酶活力提高30%，酶活力達(dá)16 200 U/mL[10-11]。同時，亦開展了對有機溶劑耐受性、熱穩(wěn)定性好的細(xì)胞結(jié)合脂肪酶的研究。

淀粉酶是非常重要的工業(yè)用酶，占酶制劑市場 25%。目前工業(yè)主要是高溫酶，來自深海液口嗜熱厭氧古細(xì)菌熱球菌屬Thermococcus產(chǎn)胞外耐熱高溫酶，最適溫度95 ℃，100 ℃仍有60%活力，用PCR法克隆此酶基因，并在E. coli中得到表達(dá)[7]。又從云南騰沖分離兩株耐熱生淀粉生產(chǎn)的Geobacillus細(xì)菌，經(jīng)純化后，比活力分別為1 320和890 U/mg[7]。用PCR法克隆了嗜堿芽胞桿菌Bacillus alcalophilus基因，其中枯草芽胞桿菌異源表達(dá)，活性為450 U/mL[9]。中溫酸性α-淀粉酶，對淀粉加工有節(jié)能降耗作用，Bacillus sp. α-淀粉酶基因與B. amyliquefaciens α-淀粉酶基因有98%的同源性[7]。

甘露聚糖酶屬于半纖維素酶，適用于甘露寡糖制備。肇東市日成酶制劑公司用黑曲霉工程菌酸性β-甘露聚糖酶表達(dá)活力達(dá)20 000 U/mL，為目前生產(chǎn)菌株水平的25倍，處于真菌基因工程菌領(lǐng)先地位[10]。利用DNA shuffling定點突變獲得耐高溫耐酸的A. tabescens MAN 47 β-甘露聚糖酶突變體，高溫80 ℃、pH 4.0酶活力為野生型的10倍。定向引入N-糖基化位點，實現(xiàn)了野生型和突變型在畢赤酵母中的表達(dá)，熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性、蛋白酶抗性均得到改善。也獲得了比野生型甘露聚糖酶活性高 3–5倍的 3個突變體[10-11]。從嗜熱網(wǎng)球菌中克隆獲得熱穩(wěn)定的β-1,4-甘露聚糖酶，在80 ℃高溫低滲油井中、對羥基瓜爾膠有最高活力。該酶半衰期為46 h[10]。

漆酶為含銅多酚氧化酶，為木質(zhì)素分解酶，亦可催化合成酚類、芳香胺的低聚物。擔(dān)子菌漆酶酶基因克隆到畢赤酵母中表達(dá)活力為9.03 U/mL，為原始菌株的3倍[5]。野生革耳Panus rudis漆酶轉(zhuǎn)化到畢赤酵母分泌表達(dá)，通過定點突變及隨機突變后，酶比活力為16.17 U/mg，提高了4.4倍[7]。新型海洋細(xì)菌漆酶經(jīng)氨基酸定點突變，突變體半衰期延長3倍，可溶性蛋白較優(yōu)化前提高244%。發(fā)酵產(chǎn)率為野生型的 7.9倍[10]。熱帶白腐真菌菌株漆酶酶活力達(dá)11 400 U/L (愈創(chuàng)木酚法)[7]。

普魯蘭酶又稱茁霉多糖酶，屬解枝酶，分解α-1,6-葡萄糖苷鍵。嗜熱古菌Thermococcus sp.HJ21產(chǎn)胞外高溫普魯蘭酶，最適溫度95 ℃，酶活力在100 ℃、2 h仍有50%以上活力[7]。通過PCR技術(shù)克隆了此酶基因。溫泉中厭氧芽胞桿菌屬Anoxy bacillus sp. p28克隆到普魯蘭酶基因序列，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化到E. coli中，產(chǎn)物為單一麥芽三糖，為Ⅰ型普魯蘭酶。從騰沖熱泉中分離出耐熱厭氧芽胞桿菌普魯蘭酶基因?qū)肟莶菅堪麠U菌中得到表達(dá)。60 ℃、48 h仍保留 50%以上活力，胞外酶活力 42 U/mL，表達(dá)活力提高了40倍[10]。南京百斯杰生物工程公司通過基因敲除及重組技術(shù)，改造野生芽胞桿菌普魯蘭酶基因，與葡萄糖淀粉酶制成復(fù)合酶，可制備出DE值超過96.5的葡萄糖，商品名為High DEX系列，滿足了葡萄糖生產(chǎn)，達(dá)到國際水平[10]。

青霉素?；甘?β-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)的關(guān)鍵酶。我國已成功進(jìn)入酶合成抗生素工業(yè)，青霉素?；竿ㄟ^誘變獲得突變株活力為 820 U/mL[2]?？寺【薮笱堪麠U菌青霉素?；富蛟诳莶輻U菌中表達(dá)活力為30 U/mL[4]。青霉素?；冈诳莶菅堪麠U菌中分泌表達(dá)，表達(dá)量為864 U/L，是野生型類產(chǎn)桿菌A. faecalis產(chǎn)量的144倍[5]。糞產(chǎn)桿菌的青霉素?；冈贓. coli中分泌表達(dá)，改進(jìn)培養(yǎng)的工程菌酶活力＞2 000 U/L。7-氨基頭孢烷酸?；?(GL-7-ACA酰化酶) 可轉(zhuǎn)化頭孢菌素C，在E. coli中表達(dá)，最高酶活力達(dá)266 U/L[5]，用Eupergitc載體固定化巨大芽孢桿菌青霉素?；福B續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)30批次，活力未見下降[6]。

D-氨基酸氧化酶可催化D-氨基酸生成相應(yīng)的酮酸和氨，此酶與 7-氨基頭孢烷酸?；?7-ACA?；? 兩步法生產(chǎn)頭孢菌素重要原料7-氨基頭孢烷酸 (7-ACA)。用甲醇酵母表達(dá)的D-氨基酸氧化酶，構(gòu)建了高表達(dá)的畢赤酵母重組菌。14 L罐發(fā)酵活力達(dá)8 000–1 2000 U/L[5]。構(gòu)建了畢赤酵母融合表達(dá)的 D-氨基酸氧化酶活力為1 700 U/L[5]，還構(gòu)建了兩種重組GL-7-ACA?；?，組成型菌株達(dá)到1 500 U/L，誘導(dǎo)型菌株達(dá)900 U/L，固定化酶轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%[5]。三角酵母D-氨基酸氧化酶基因轉(zhuǎn)到E. coli中，表達(dá)活力為23.3 U/mL[5]，D-氨基酸氧化酶固定化在 Amberzyme環(huán)氧樹脂上轉(zhuǎn)化 14批次，活力未見下降[6]。對羥基苯甘氨酸是半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的重要中間體，可通過海因酶和 D-氨甲酰水解酶兩步催化制備，通過對D-氨甲酰水解酶隨機突變，在E. coli中可溶性提高了6倍[6]，重組表達(dá)E. coli的D-海因酶可溶性差，共表達(dá)分子伴侶可將可溶性表達(dá)量提高約3倍[7]。

羰基還原酶不對稱還原羰基化合物廣泛用于制備手性醇。天藍(lán)色鏈霉菌羰基還原酶制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。其重組菌E. coli BL21制備了 (S)-4-氯-3-4-苯基丁酸乙酯和 (S)-鄰氯扁桃酸甲酯，轉(zhuǎn)化率和ee值均高達(dá)99%以上[9]。面包酵母羰基還原酶基因同源表達(dá)產(chǎn)物對映體ee值和產(chǎn)率均有提高。近平滑假絲酵母基因組中克隆出新型 (S)-型羰基還原酶，重組菌E. coli BL 21能制備 (S)-苯基乙二醇，光學(xué)純達(dá)99.1%，產(chǎn)率為89.6%[8,11]。

β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系的重要組分，可將纖維二糖、可溶性纖維寡糖水解成葡萄糖及相應(yīng)配基，水解β-糖苷鍵及合成新的糖衍生物。瑞士木霉β-葡萄糖苷酶，通過基因敲除、氨基酸突變，突變體酶活力比野生型提高了 143倍[9]。新鞘氨醇桿菌β-葡萄糖苷酶基因在E. coli成功表達(dá)，可轉(zhuǎn)化異黃酮糖苷生成相對應(yīng)的苷元[10]。臺灣乳白蟻腸道中的 β-葡萄糖苷酶，用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)，突變酶較野生型酶活力提高了2.6倍。亦提高了葡萄糖耐受性及熱穩(wěn)定性[10]。斜臥青霉 β-葡萄糖苷酶進(jìn)行基因改造，通過轉(zhuǎn)化獲得 3個表達(dá)菌株，酶活力比原始菌株提高3.4–3.7倍[10]，從非解朊棲熱菌分離到耐熱β-葡萄糖苷酶基因在E. coli中克隆表達(dá)，酶活力提高17倍[4]。從海洋宏基因組篩選到葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶克隆到E. coli高效表達(dá)，葡萄糖濃度低于400 mmol/L，對酶有促進(jìn)作用，達(dá)到 1 000 mmol/L葡萄糖濃度，酶活性為50%[8,11]。利用 DNA改組和定點突變提高 β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性，4個突變體與野生型相比，61 ℃熱失活半衰期提高了14.16、68和44倍。耐熱性有明顯提高[8]。

半乳糖苷酶，又名乳糖酶，能將乳糖分解成葡萄糖和半乳糖基，可以合成低聚糖。通過宏基因組法從海底泥中獲得高效轉(zhuǎn)糖基的 β-半乳糖苷酶，在E. coli中可溶性表達(dá)，對有機溶劑有耐受性，合成低聚半乳糖產(chǎn)量可達(dá)51.6%[9]。曲霉α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵，酶活力達(dá)305 IU/g[6]。硫磺礦硫化葉菌Sulfolobus solfataricus P2的 β-半乳糖苷酶進(jìn)行分子改造構(gòu)建了突變體，突變酶F441Y生產(chǎn)低聚半乳糖，產(chǎn)率達(dá)61%，較野生型高10%左右[9]。

腈水合酶在酰胺、羧酸及其衍生物合成中有重要應(yīng)用價值，催化丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺，諾卡氏菌Nocardia sp. YS-2002發(fā)酵活力最高達(dá)6 000國際單位，在E. coli及畢赤酵母中得到表達(dá)[5]。

菊粉酶是水解菊粉的 β-2,1-D-果聚糖果糖苷鍵的水解酶，產(chǎn)低聚果糖，分內(nèi)切酶和外切酶兩種。將黑曲霉菊粉內(nèi)切酶基因克隆到畢赤酵母得到高效表達(dá)，重組酶活力達(dá)128 U/mL，達(dá)到國際水平[9]。

海藻糖合成酶，海藻糖在食品、醫(yī)學(xué)、輕工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，可用單酶法從麥芽糖生產(chǎn)海藻糖，通過酶分子的理性設(shè)計和DNA shuffling技術(shù)從兩個 GRAS菌種和兩個嗜熱菌中克隆到海藻糖合成酶基因并成功進(jìn)行了高效表達(dá)，已實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[5]。

中性蛋白酶廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)，枯草芽胞桿菌AS1398基因Npr的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B. subtilis AS 1398，獲得多拷貝的重組菌，連續(xù)傳代 30代，重組菌質(zhì)粒穩(wěn)定性保持100%，蛋白酶表達(dá)水平提高1倍以上，達(dá)到24 000–28 000 U/mL[10]。有高效殺線蟲毒力的側(cè)孢短芽胞桿菌株經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)獲得蛋白酶的活力達(dá)12 379 U/mL，比優(yōu)化前提高5倍，應(yīng)用B. subtilis WB600表達(dá)體系，構(gòu)建隨機突變文庫，獲得熱穩(wěn)定的突變體，為生物殺蟲劑提供依據(jù)[8]。人基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，在E. coli中成功克隆表達(dá)了該酶，為研究該酶與腫瘤轉(zhuǎn)移機理和尋找該酶特異抑制劑奠定基礎(chǔ)[5]。

葡聚糖酶屬水解酶，分內(nèi)切酶和外切酶，用于啤酒生產(chǎn)和飼料添加。嗜熱青霉 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入E. coli BL 21誘導(dǎo)表達(dá)，酶活力240 U/mL[8]，鏈霉菌S27內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶基因在E. coli中高效表達(dá)，可水解昆布多糖等，可抑制致病真菌和產(chǎn)毒素真菌[8]。長梗木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍副磉_(dá)，重組菌Ⅲ酶活力達(dá)110 U/mL，優(yōu)化后提高 50%[8]。點突變極耐熱 Thermotoga maritima內(nèi)切葡聚糖酶 Cell-12B，酶最適溫度95 ℃，90 ℃仍保留70%活力[10]。

N-乙酰神經(jīng)氨酸是生物體內(nèi)一種最重要的唾液酸，唾液酸糖鏈參與許多生命過程，CMP-唾液酸能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，對CMP-唾液酸合成酶基因進(jìn)行堿基改造，在E. coli中得到高效表達(dá)，酶表達(dá)量占總蛋白26.5%，酶活力為100 U/L，為出發(fā)菌株的850倍[4]。

黃曲霉毒素解毒酶為一種加氧酶，用重組技術(shù)構(gòu)建基因在畢赤酵母中高密度發(fā)酵表達(dá)，酶占總蛋白量56%，表達(dá)量達(dá)814.5 mg/L[6]。將酶突變基因重組質(zhì)粒引入E. coli擴增轉(zhuǎn)入釀酒酵母，建立突變文庫，突變體 A1773酶活提高5倍。突變體A1242耐高溫性提高了3.5倍。突變體DS1474酶比活力56 U/mg，突變體DS896酶比活力為44 U/mg[9]，已獲準(zhǔn)在飼料中作為除毒的酶產(chǎn)品。

煙曲霉真菌感染是困擾人類健康的難題，系統(tǒng)研究煙曲霉基因組中50多個糖基化途徑相關(guān)基因，先后從煙曲霉中克隆了幾丁質(zhì)酶、磷酸甘露糖異構(gòu)酶、O-甘露糖轉(zhuǎn)移酶、α-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、α-葡萄糖苷酶I及CMP-唾液酸合成酶等基因、對了解真菌糖基化機制、開發(fā)基因工程藥物、抗真菌感染藥物有意義[6]。

L-天冬酰胺酶有明確治療白血病的效果，通過DNA重組技術(shù)，將L-天冬酰胺酶特異單鏈抗體片段與酶構(gòu)建融合蛋白，提高了酶在體內(nèi)的穩(wěn)定性，重組E. coli AS 1357工程酶活力提高達(dá)228 U/mL，相當(dāng)野生菌的50多倍[4]。

用宏基因組學(xué)法將酯酶基因轉(zhuǎn)入E. coli中，構(gòu)建的工程菌提高了活力，表達(dá)量為200 mg/L，酶活力達(dá)180 U/mg，與野生型比較60 ℃熱穩(wěn)定性提高144倍和196倍，獲得了可降解氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和氟氯氰菊酯的新型聚酯類農(nóng)藥降解突變酯酶[9]。

重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶，1 t發(fā)酵罐產(chǎn)酶最高達(dá)1 315 U/mL[8]。黑曲霉EIM-6培養(yǎng)優(yōu)化后果膠酶活力可提高至30 231 U/mL[8,11]。

假單胞菌水楊酸羥化酶基因克隆到 E. coli表達(dá)了兩個萘降解酶，可降解水楊酸、乙酰水楊酸、磺基水楊酸、水楊醛、間硝基苯甲醛、5-氯水楊酸、辛醛及鄰硝基苯甲醛等[5]。

有機磷酯類是一類高毒化合物，用于殺蟲劑、除草劑或作為神經(jīng)毒劑?？寺×思賳伟袡C磷酯水解酶，通過氨基酸位點突變，在E. coli中重組表達(dá)，對有機磷酯水解能力提高了約7 000倍[10]。

α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中獲得能分解淀粉和生產(chǎn)酒精的 6株酵母工程菌——JL1082工程菌經(jīng)固定化包埋，葡萄糖淀粉酶活力最高達(dá)170 U/mL，淀粉水解率80%以上，產(chǎn)酒率可達(dá)13.3%，在廣西酒精廠年產(chǎn)5 000 t，工程菌AD (YIP19RGAn) 白酒實驗，酒精度為43%，大米利用率為96.16%[5]。

將合成β-聚羥基丁酸酯 (PHB) 的酶基因，λ-噬菌體裂解細(xì)胞的酶基因及能合成血紅蛋白VHb的酶基因——合成透明顫菌血紅蛋白酶基因Vgb，共同轉(zhuǎn)入E. coli中，發(fā)酵產(chǎn)聚β-羥基丁酯(可降解的高分子) 工程菌PHB產(chǎn)量達(dá)194 g/L，占細(xì)胞干重高達(dá) 90%，同時解決了破壁及高密度培養(yǎng)的生化工程問題，已進(jìn)行投產(chǎn)[5]。

抗體酶，又叫催化抗體，具有抗體高選擇性和酶的高效催化性。谷胱甘肽過氧化物酶(GPX) 可以清除體內(nèi)活性氧 (ROS) 所帶來的細(xì)胞損傷，治療炎癥、糖尿病和心血管病等。根據(jù)Pauling過渡態(tài)理論，設(shè)計了多種含硒的谷胱甘肽過氧化物酶模擬物，通過雜交瘤技術(shù)免疫小鼠，化學(xué)誘變成功制備了分子量小能穿透細(xì)胞膜有治療價值的具GPX活力的單鏈抗體模擬物，為天然兔肝酶活力的8.5倍。用人源基因替換鼠非保守區(qū)，全基因片段在噬菌體展示，構(gòu)建了人源化GPX單鏈抗體酶，還制備了含硒多肽GPX模擬物，活力為68.7 U/mg，為天然酶的80%，最適pH和溫度與天然酶相近。通過鼠表皮細(xì)胞抗氧化實驗，具強抗氧化能力。用化學(xué)修飾將θ型谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶 (GST) 轉(zhuǎn)化為含硒GPX酶，能有效還原H2O2，催化能力為國外臨床試驗的PZ51 (含硒雜環(huán)化合物) 的5 000倍[5]。通過分子印跡技術(shù)，變性卵清蛋白作為印跡分子，除去印跡分子后，印跡分子結(jié)合部位中Ser被Sec取代，該蛋白分子有高的GPX活力，為PZ51的820倍[5]。還合成一系列環(huán)糊精衍生物的有機硒化合物作為GPX模擬物，對膜通透性好，無免疫原，體內(nèi)半衰期長[5]。GPX模擬物6-ImTeCD催化谷胱甘肽還原 H2O2活力為6.8 U/μmol，還原t-BuOOH級CuOOH活力是9.7和 15.2 U/μmol[10]。

核酶 (Ribozyme) 是小分子 RNA，也是一種多功能催化劑，可催化病毒RNA自我切割或斷裂反應(yīng)。我國亦進(jìn)行了[R-]錘頭核酶基因防治馬鈴薯紡錘病毒 (PSTVd) 和[R]錘頭核酶基因防治椰菜花葉病毒 (CaMy) 的工作[1]。

此外，還有利用基因工程菌絲氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn) L-絲氨酸[4]。重組畢赤酵母生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸藥物[5]。重組菌生產(chǎn) 1,3-丙二醇及2,3-丁二醇[8]。構(gòu)建 E. coli工程菌生產(chǎn)色氨酸[8]。芽短梗霉工程菌生產(chǎn)聚蘋果酸[10]。芽胞桿菌突變株Y89D生產(chǎn)環(huán)糊精[8]。重組E. coli合成抗禽流感藥物達(dá)菲前體草莽酸[10]?？莶菅堪麠U菌突變株生產(chǎn)苯丙氨酸。利用菌株基因敲除提高工程菌生產(chǎn)化工產(chǎn)品原料丁二酸產(chǎn)量[10]。大腸桿菌工程菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)α-苯丙酮酸[10]。

酶工程會議還有許多酶基因克隆與表達(dá)的論文，不能一一敘述，如：修復(fù) DNA損傷的O6-甲基鳥嘌呤 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，甜菜堿醛脫氫酶提高抗氧化酶活力，與噬菌體蛋白同源的新核酸酶。甜蛋白基因的表達(dá)，藍(lán)藻蛋白裂合酶，抗蟲膽固醇氧化酶，嘧啶核苷磷酸化酶[4]，乙醇氧化酶，合成 D-氨基酸的 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶[5]，辣根過氧化物酶[7]，煙酸脫氫酶[8]，乳糖酶[7]，甲烷單加氧酶，苯乙烯單加氧酶，右旋糖酐蔗糖酶[8]，脂肪醛去甲酰加氧酶，多聚乙酰合成酶，CO2關(guān)鍵酶與限速酶，耐熱羧酸酯酶，硫氧化還蛋白谷胱甘肽還原酶[10]，煙酸脫氫酶[7]，畢赤酵母SASA冠狀病毒的表達(dá)，癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的人基質(zhì)金屬蛋白酶，重組畢赤酵母表達(dá)人血清白蛋白，耐熱單加氧酶，合成 r-亞麻酸的Δ6-脫氫酶在酵母中表達(dá)，E. coli表達(dá)1,3-丙二醇氧化還原酶生產(chǎn)多聚纖維單體1,3-丙二醇[5]，殼聚糖酶，酰胺酶，甘油脫水酶，轉(zhuǎn)谷氨酰酶，丙烯腈水解酶，嗜熱菌角質(zhì)酶-CBD融合蛋白[11]，人細(xì)胞色素P450酶在E. coli中表達(dá)，耐堿性葡萄糖脫氫酶在E. coli中表達(dá)，丙氨酸消旋酶[8]，果膠內(nèi)切水解酶，手性藥物合成的NADPH酮基還原酶，酪氨酸激酶，糖基合成酶，天冬酰胺合成酶，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，丙酮酸脫氫酶，無機焦磷酸酯酶[6]，E. coli表達(dá)治療肝癌與黑色素瘤的精氨酸脫亞胺酶。制備手性醇的酮還原酶。熱穩(wěn)定制備芳基醇的醇脫氫酶[9]。異源表達(dá)β-1,3-氮乙酰胺基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶制備人乳寡糖，克隆了 5種糖核苷酸合成的關(guān)鍵酶合成相應(yīng)的糖核苷酸，E. coli表達(dá)細(xì)菌脂肪氧合酶用于綠色香料和植物激素合成。E. coli誘導(dǎo)表達(dá)對治療癌癥及高半胱氨酸癥有價值的深海甲硫氨酸r-裂解酶。E. coli表達(dá)Bst DNA聚合酶[9]?？股毓羌芫弁铣傻牡弁€原酶。腫瘤標(biāo)記物環(huán)氧化酶-2的人源單鏈抗體。E. coli表達(dá)雙功能D-乳酸脫氫酶，重組表達(dá)系列瓊膠酶制備瓊膠寡糖。里氏木霉異源表達(dá)木質(zhì)素過氧化物酶[10]，構(gòu)建了 α-乙酰乳酸脫羧酶啤酒酵母工程菌用于啤酒生產(chǎn)[4]。聚酮合酶是最強大的化學(xué)合成酶[10]，正在進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能研究。

2 酶與微生物細(xì)胞的生物合成與催化

傳統(tǒng)的化學(xué)催化已不能滿足可持續(xù)發(fā)展的需要，高立體選擇性的微生物細(xì)胞或酶已成為手性生物合成的亮點。在這25年中，我國工業(yè)生物催化已成為具有相當(dāng)規(guī)模和技術(shù)水平的產(chǎn)業(yè)，在世界上占有舉足輕重的地位。

在第一至九屆全國酶工程會議的 978篇論文中，基因工程酶方面的有 356篇，生物催化合成論文有 186篇，占第二位。其中脂肪酶催化合成論文占55篇，占生物合成的第一位。

我國在有機相、離子液體、非水溶劑系統(tǒng)已成功利用脂肪酶進(jìn)行了手性 2-辛醇[3,5,7-8]拆分，(R,S) 仲辛醇拆分[3,5-6]，α-苯乙醇拆分[6]，酮洛芬乙烯水解拆分[10]，合成己酸乙酯[3-4,7,11]，合成辛酸乙酯[7]，油酸乙酯[7]，庚酸乙酯[10]，癸酸乙酯[7]，生物柴油[7-9,11]，脂肪酸甲酯[11]，二元酸酯[8]，單甘油酯[4]，油酸油醇酯[3]，香葉醇酯[3]，油酸酯[3]，乙酸乙烯酯[3]，脂肪酸糖脂[9]，(S)-α-氨基-3-苯氧基芐醇[5]，1,3-丙二醇羧酸酯[3]，棕櫚異辛酯[8]，癸酸甘油酯[5]，維生素A棕櫚酸酯[5]，抗壞血酸脂肪酸酯[5]，蔗糖酯[7]，聚羥基丙酸酯[7]，葡萄糖月桂酸單酯[8,11]，果糖月桂酸單酯[8]，及 (+)反式菊酸[4]，以及新聞紙脫墨[7,10]等。

細(xì)胞展示技術(shù)是將外源蛋白錨定在細(xì)胞壁上，酶分子的固定化可提高酶的穩(wěn)定性和對有機溶劑的耐受性，畢赤酵母對外源脂肪酶表面展示系統(tǒng)可催化合成果糖脂、己酸乙酯，葡萄糖酯、生物柴油、月桂酸單糖酯、脂肪酸甲酯[8,11]等。

離子液體體系是新型綠色非水溶劑，酶法微藻藻油生產(chǎn)生物柴油達(dá) 90%轉(zhuǎn)化率。并合成了脂肪酸糖脂[9-10]。

利用酯酶催化合成酒香己酸乙酯[3]，單一性2-辛醇拆分合成抗癌藥物前體 (2S,3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯[10]，固定化合成脂肪族聚酯[10]，菌株不對稱合成L-薄荷醇[7]，拆分1,1,1-三氟-2-辛醇[10]，有機合成壬酸香草醇酯 (辣椒素脂)[8]。

用蛋白酶與化學(xué)法相結(jié)合，在低水有機相中合成了 4種含 Arg-Gly-Asp(RGD) 的細(xì)胞粘附肽 RGDS、RGD(NH2)2、RGE-NH2和RGDS-NH2，有抗腫瘤作用[7]。

目前，已知酶有4 428種 (至2011年)，工業(yè)上用酶大多數(shù)為水解酶，但氧化還原酶在酶中比例卻約占 32%，很多氧化還原酶未能被開發(fā)，因此拓展氧化還原酶是工業(yè)技術(shù)中一項重要內(nèi)容，但需解決輔酶循環(huán)再生的難題。為建立微生物細(xì)胞氧化還原酶催化體系，提高內(nèi)源輔酶利用率，我國已利用E. coli重組菌雙輔酶底物偶聯(lián)固定化面包酵母羰基還原酶合成 (S)-苯基乙二醇手性模塊物[8]。用雙羰基還原酶偶聯(lián)輔酶再生體系合成他汀類藥物手性側(cè)鏈——3R,5S二羥基-6-芐基己酸乙酯[8]。重組菌羰基還原酶合成醫(yī)藥合成用的手性醇 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，(R)-鄰氯扁桃酸甲酯和 (S)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯[9]。用烯酮/烯酯還原酶還原C=C雙鍵合成有商品價值的底物，對甲基馬來酰亞胺、R-香芹酮、衣康酸二甲酯、乙烯酰氧基丙烯酸甲酯、茶香酮、芐烯丙二腈都有較高的轉(zhuǎn)化率[10]。用輔酶再生體系酵母醇脫氫酶不對稱合成醫(yī)藥，農(nóng)藥光學(xué)手性醇中間體 (R)-扁桃體酸甲酯和 (R)，(S)2-辛醇[8]。菌株 D-氨基酸脫氫酶和胺氧化酶合成手性胺 (如 D-丙氨酸、D-苯丙氨酸、D-叔亮氨酸)。已建立了 D-氨基酸合成的酶催化平臺[10]。氧化葡萄糖酸桿菌高選擇性氧化合成工業(yè)上第二位的芳香醛——苯甲醛[8]。嗜熱酮還原酶輔酶再生系統(tǒng)不對稱合成醫(yī)藥中藥中間體S-1-苯基222三氟乙醇[9]。E. coli共表達(dá)全細(xì)胞甲酸脫氫酶催化茴香硫醚不對稱合成手性亞砜——甲基苯基亞砜[9]。金黃桿菌烯醇還原酶催化C=C雙鍵不對稱還原環(huán)狀烯酮產(chǎn)生光學(xué)純烷烴化合物用于手性中間體合成[10]。金黃桿菌短鏈脫氫酶不對稱合成匹瑞匹坦藥物中間體(R)-[3,5-二 (三氟甲基) 苯基]乙醇[10]。芽胞乳桿菌D-乳酸脫氫酶催化谷氨酸合成α-酮戊二酸[10]。高活性全細(xì)胞醇脫氫酶不添加輔酶合成米格列醇[6]，基因敲除提高酶表達(dá)量構(gòu)建甘油脫氫酶合成1,3-二羥基丙酮 (最簡單的多羥基酮糖)[8]。利用天然多脫氫酶體系甲烷氧化細(xì)菌生物催化二氧化碳制甲醇[5]。廈門大學(xué)挖掘了海洋微生物的8種氧化還原酶體系[9]。

國內(nèi)已形成生物催化與微生物轉(zhuǎn)化的科研開發(fā)群體，江南大學(xué)與浙江鑫富生化公司合作，用產(chǎn) D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的串珠鐮孢菌水解拆分得到光學(xué)純的D-泛解酸內(nèi)酯，成功地用于D-泛酸鈣和D-泛醇的生產(chǎn)，D-泛酸鈣產(chǎn)量全球第一[5,10]。此外，還固定化諾卡氏菌水解順式環(huán)氧琥珀酸生產(chǎn) L-酒石酸[7]。微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草酸與香草醛，又名香蘭素 (3-甲氧基-4-羥基苯甲醛) 高檔香料[5]。轉(zhuǎn)化巴豆甜菜堿制L-肉堿[4]，采用雙水相合成用于倍他司汀抗組胺藥物手性中間體-(S)-(4-氯苯基)-(吡喃-2-基) 甲醇[9]。定向進(jìn)化E. coli菌株精氨酸脫亞胺酶為治肝癌藥物[9]。

融合酶是利用融合蛋白將幾種功能蛋白集成于一體的嵌合體。構(gòu)建肝素酶的雙重融合蛋白體系，如麥芽糖結(jié)合蛋白融合或熒光蛋白融合，促進(jìn)了肝素酶的可溶性表達(dá)，用于生產(chǎn)低分子量抗栓藥物——肝素[6-7,9,12]。雙親短肽融合環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的N末端構(gòu)建6種融合酶合成克服Vc氧化的2-氧-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗壞血酸[10]。固定化自組裝短肽18A與腈水解酶融合表達(dá)生產(chǎn)扁桃腈[10]。用嗜熱子囊菌角質(zhì)酶-CBD融合蛋白精煉棉織物[8]。

大孔樹脂吸附法具有吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、時間短、物理化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點,但其也有一定的局限性。樹脂經(jīng)過反復(fù)使用后,樹脂的表面及內(nèi)部會殘留許多非吸附性成分或者是雜質(zhì)使柱的顏色變深,柱效也會降低,而且經(jīng)多次使用有時柱床擠壓過緊還會導(dǎo)致樹脂顆粒破碎,使用壽命較短。此外由于即使是同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的同一型號樹脂,各批之間的比表面積和功能基團(tuán)的含量差別也較大,導(dǎo)致實驗的重現(xiàn)性較差,影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

我國在 20世紀(jì)90年代就已開發(fā)利用過氧化物酶在有機相或反相膠束中催化酚類和芳香胺的聚合反應(yīng)，如合成聚對羥聯(lián)苯，并研究了聚合物的光電性能。在非水介質(zhì)中催化去除苯酚達(dá)84.9%。在水乙醇中前列腺素合成酶催化合成前列腺素 E1[3]。青霉菌轉(zhuǎn)化順丙烯磷酸一步環(huán)氧化為磷霉素[4]。環(huán)氧化物水解酶合成藥物手性中間體手性鄰二醇[7]。浙江大學(xué)與海正藥業(yè)公司合作克隆表達(dá) R-酰胺酶和水合酶合成西司他汀手性中心 (S)2,2-二甲基環(huán)丙甲酰胺[8]。利用休止細(xì)胞甘油脫水酶生產(chǎn)聚酯、聚醚、聚氨酯合成的單體1,3丙二醇[5]。構(gòu)建E. coli基因工程菌轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)3-羥基丙醛[8]。利用羥腈酶合成可制備β-氨基醇的羥腈化合物[4]。利用嘧啶核苷磷酸化酶合成抗腫瘤藥物中間體-5-氟尿苷[4]。用反膠束單寧酶催化合成抗氧化劑沒食子酸戊酯[5]。成都生物所用固定化粘紅酵母苯丙氨酸解氨酶/肉桂酸途徑生產(chǎn)苯丙氨酸[7]。腈轉(zhuǎn)化酶是繼酯酶和脂肪酶之后，又一制備手性化合物的工具酶，包括腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶。產(chǎn)業(yè)化實例有腈水合酶/酰胺酶雙酶偶聯(lián)生產(chǎn)西司他汀鈉關(guān)鍵手性中間體-(S)-(+)2,2-二甲基丙烷甲酰胺[8]。腈水解酶制備除草劑-(L)-單銨膦及農(nóng)藥甘膦中間體——亞氨基二乙酸[10]。用固定化細(xì)胞腈水解酶制備醫(yī)藥中間體-(R)扁桃酸[8]。非水相α-胰凝乳蛋白酶催化合成具有強抗氧化的類肌肽4-(5)-丙氨酰胺5 (4)-羧酸咪唑[8]?；蚬こ叹D(zhuǎn)化制備脫氧核苷三磷酸[8]。定向突變菌株環(huán)氧化物水解酶制備降壓藥普萘洛爾中間體鄰位二醇[10]。甾體激素僅次于抗生素，用青霉菌轉(zhuǎn)化 6種甾體生成 1,2-二氫睪內(nèi)酯[10]。手性胺或非天然氨基酸是重要藥物合成的手性模塊，用 ω-轉(zhuǎn)氨酶獲得光學(xué)純的 (R)手性胺 (R)-α-苯乙胺，(R)-1-苯丙胺，(R)-4-苯基-2-丁胺，(R)-α-四氫萘胺[10]。E.coli表達(dá)細(xì)胞 L-氨基酸脫氨酶催化合成 α-苯丙酮酸[10]。固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化精氨酸為瓜氨酸，通過細(xì)胞谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化谷氨酸制備 α-酮戊二酸[10]。固定化含精氨酸脫亞氨酶的細(xì)胞拆分DL-精氨酸[9,12]。用內(nèi)切型肝素酶制備抗平滑肌細(xì)胞增生的肝素寡糖 (0–8 K)[8]。突變菌株環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶合成6個葡萄糖的α-環(huán)糊精[8]。用4種酶法合成新生兒益生糖——氮乙酰氨基葡萄糖-1,3-乳糖[9]。嗜熱β-葡萄糖苷酶在兩相中合成非離子表面活性劑——辛基葡萄糖苷[9]。瓊膠酶降解瓊膠生成2、4、6、8和10糖[10]。右旋糖酐酶水解葡聚糖生成麥芽糖，異麥芽三糖和葡萄糖[10]。

新發(fā)現(xiàn)的人參皂苷糖苷酶，從人參二醇類皂苷酶轉(zhuǎn)化法獲得稀有皂苷Rh2，其得率比紅參中提取提高了 500–700倍，在大連已產(chǎn)業(yè)化，年產(chǎn)Rh2皂苷300 kg，證明酶轉(zhuǎn)化法可以生產(chǎn)中草藥的有效成分[5,11]。β-糖苷酶水解人參二醇皂苷Rb1和Rb2的糖基生成抗癌人參皂苷Compound K。可提高免疫力，增加白血球等藥效[10]。

硅基磁性納米材料 Fe3O4SiO2 (Hb) 肌紅蛋白具有過氧化物酶活性[9]。重組菌不對稱催化合成手性環(huán)氧化物和手性鄰位二醇產(chǎn)物 R-對氯苯二醇和R-對氯苯乙二醇[10]。聚酮合酶是自然界最小，但功能最強大的合成工廠，催化合成抗生素次級產(chǎn)物，正在進(jìn)行結(jié)構(gòu)域研究[5,10]。

長鏈二元酸是10個以上碳原子的脂肪族二羧酸，是化工合成高性能尼龍、麝香香料、潤滑油、油漆、粘合劑、新型醫(yī)藥和農(nóng)藥的精細(xì)化工原料，長鏈二元酸的生物合成是中國獨有的原創(chuàng)性新菌種、新工藝專利技術(shù)，已經(jīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，只有中國能應(yīng)用這種技術(shù)生物合成生產(chǎn)一系列長鏈二元酸，并壟斷了西方所沒有的 7種長鏈二元酸，每年產(chǎn)值有十幾億人民幣，榮獲多項國家重大成果獎[4]。

3 生物傳感器

生物傳感器應(yīng)用于各類重要生化物質(zhì)快速分析，我國已研制成功 101種以上不同種類、臺套的生物傳感器，包括電極型、化學(xué)光敏型、場效應(yīng)晶體管型、等離子體諧振型、光波導(dǎo)型、光纖型、壓電晶體型、微懸臂列陣型、雙分子質(zhì)脂仿生型、橢扁光型、絲網(wǎng)印刷型，大多數(shù)采用酶膜、組織、微生物、受體蛋白、抗原抗體、葉綠體、DNA探針作為探頭，測定物質(zhì)為乳酸、谷氨酸、血糖、尿素氨、尿酸、腎功能、青霉素、次黃嘌呤、谷氨酰胺、維生素C、轉(zhuǎn)氨酶、有機磷、BOD、丙酮酸、黃曲霉毒素、海洛因、酚、苯丙氨酸、膽固醇、細(xì)菌總數(shù)、乙醇、抗原抗體、嗅覺、硫化物、微生物、環(huán)境監(jiān)測、二氧化碳、鉀離子、膽堿、β-羥丁酸、農(nóng)藥、DNA等。十個研究所組成的中國科學(xué)院國家傳感聯(lián)合開放實驗室及全國院校做出了許多成果，微型血糖儀已商品化，山東省科學(xué)院生物研究所制備了一系列 SBA-30乳酸分析儀、SBA-40谷氨酸葡萄糖雙功能分析儀、SBA單電極分析儀、SBA60四電極在線分析儀、SBA70血糖乳酸自動分析儀及可檢測糖化酶、魚蝦鮮度、轉(zhuǎn)氨酶、尿素氨、維生素C的生物傳感器，已經(jīng)形成了商品化，實際應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)和實驗室的實用檢驗。最近，還研制了NADH生物傳感器[6]。

經(jīng)過多年的科研積累，我國酶工程研究已形成了許多有特色的科研隊伍和領(lǐng)路人，建立了許多技術(shù)平臺，中國科學(xué)院在北京、天津、上海建立了酶工程共性的技術(shù)平臺，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院構(gòu)建了飼料酶技術(shù)開發(fā)平臺，北京化工大學(xué)建立了脂肪酶化學(xué)品合成技術(shù)平臺，華東理工大學(xué)建立了脂肪酶工業(yè)應(yīng)用平臺，福州師范大學(xué)構(gòu)建了微生物脂肪酶產(chǎn)業(yè)化技術(shù)平臺，中國藥科大學(xué)建立了氧化還原酶研發(fā)技術(shù)平臺，江南大學(xué)建立了氧化還原催化體系技術(shù)平臺，廈門大學(xué)建立了氧化還原酶檢測平臺，清華大學(xué)建立了生化工程技術(shù)平臺，華南理工大學(xué)構(gòu)建了酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)平臺。山東大學(xué)建立了微生物工業(yè)技術(shù)平臺，合肥學(xué)院建立了生物與環(huán)境技術(shù)平臺，吉林大學(xué)建立了分子酶學(xué)與進(jìn)化技術(shù)平臺。

我國酶工程研究開發(fā)團(tuán)隊做出了許多突出的成果與貢獻(xiàn)，獲得了多項國家獎勵。榮獲國家科學(xué)技術(shù)發(fā)明二等獎的有：姚斌研究員、孫志浩教授、鄭裕國教授、陳堅教授、徐巖教授、楊立榮教授、譚天偉院士、陳國強教授。榮獲國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎的有：黃日波教授、金鳳燮教授、曲音波教授、陳遠(yuǎn)童研究員。此外，高培基教授榮獲教育部科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎。在會議上，榮獲酶工程貢獻(xiàn)獎的有：孫志浩教授、金鳳燮教授、黃日波教授、許建和教授、馮雁教授。曾先后參加過酶工程會議的院士有：鄒承魯院士、張樹政院士、范云六院士、歐陽平凱院士、楊勝利院士、沈寅初院士、趙國屏院士、王志珍院士、田波院士和譚天偉院士。酶工程已成為我國十分重視的現(xiàn)代生物技術(shù)。

4 我國酶制劑工業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀

據(jù)中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會統(tǒng)計，2014年，我國酶制劑商品產(chǎn)量21.9萬t，產(chǎn)值28億元人民幣 (不包括外資企業(yè))。

我國酶制劑工業(yè)起步于 20世紀(jì) 60年代，但真正得到發(fā)展是在 20世紀(jì) 80年代初改革開放后，特別是進(jìn)入新世紀(jì)初，企業(yè)由地方國營改制為股份制或民營企業(yè)。改制后企業(yè)推行 GMP管理，引進(jìn)人才，采用新工藝新設(shè)備，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，并與大專院校、科研院所合作或委托開發(fā)新產(chǎn)品。擴大應(yīng)用領(lǐng)域，使酶制劑工業(yè)快速發(fā)展。

表2 我國酶制劑產(chǎn)量、產(chǎn)值 (不包括外資企業(yè))[13]Table 2 The production and the output value of enzyme preparation production in China (not including foreign capital enterprises)

近10年，在市場激烈競爭中，行業(yè)中一些規(guī)模很小又無特點的企業(yè)逐漸邊緣化，有的被淘汰出局。同時，出現(xiàn)了一些規(guī)模較大具有發(fā)展?jié)摿Φ钠髽I(yè)，引人關(guān)注。如：山東隆大生物工程有限公司[14]，這家企業(yè)目前已擁有發(fā)酵總?cè)莘e3 000 m3，生產(chǎn)高溫α-淀粉酶 (普通、酸性)、中溫 α-淀粉酶、真菌淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶、復(fù)合糖化酶、纖維素酶 (酸性、中性)、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶 (酸性、中性、堿性)、風(fēng)味蛋白酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、果膠酶 (酸性、堿性) 近20種。應(yīng)用于多個行業(yè)，并有較大出口量，是行業(yè)中生產(chǎn)品種最多的企業(yè)。2014年產(chǎn)值5億元人民幣。該企業(yè)2014年還投入專項資金1 000多萬元用于完善治理生產(chǎn)中產(chǎn)生污染環(huán)境的三廢(廢水、廢渣、廢氣)。廣東溢多利生物科技有限公司[14]是行業(yè)中最早生產(chǎn)飼料酶的企業(yè)，除在珠海建有國內(nèi)最大的固體發(fā)酵生產(chǎn)基地，并在內(nèi)蒙托克托建有液體發(fā)酵生產(chǎn)線，生產(chǎn)多種產(chǎn)品。近年來產(chǎn)品應(yīng)用已由飼料延伸至食品、紡織、造紙等領(lǐng)域。2014年產(chǎn)值4億元人民幣。該企業(yè)已成功上市。這兩家企業(yè)，加上湖北新華揚生物股份有限公司、湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司、湖南尤特爾生化有限公司、北京挑戰(zhàn)飼料科技集團(tuán)、山東康地恩生物科技有限公司、北京昕大洋科技發(fā)展有限公司、江蘇博立生物制品有限公司，共9家企業(yè)，2014年總產(chǎn)值24.5億元，占全國酶制劑企業(yè)當(dāng)年產(chǎn)值28億元的87.5%。企業(yè)發(fā)展規(guī)模化已成趨勢。

根據(jù)海關(guān)統(tǒng)計：2014年進(jìn)口酶產(chǎn)品14 578 462 kg，金額為2.327億美元，出口酶產(chǎn)品86 593 934 kg，金額3.369億美元[15]。

上述酶制劑產(chǎn)品進(jìn)出口包括國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)、在我國獨資生產(chǎn)的諾維信、杰能科、帝斯曼、天野等公司、合資企業(yè)蘇州宏達(dá)酶制劑有限公司以及在我國設(shè)辦事處做貿(mào)易的一些國外公司。我國酶制劑生產(chǎn)企業(yè)出口酶制劑金額約占我國酶制劑出口總金額的1/3。

酶制劑出口產(chǎn)品中，國內(nèi)企業(yè)出口的品種依次為：糖化酶、植酸酶、堿性蛋白酶、堿性脂肪酶、高溫α-淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶等。糖化酶數(shù)量最多，年出口約3.0萬t，其次為植酸酶，年出口約1.0萬t。

植酸酶：植酸酶研發(fā)項目 (包括禽類、魚類、豬等專用植酸酶)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所姚斌研究員負(fù)責(zé)的課題組承擔(dān)[13]，列入國家“863”計劃，于1998年取得重大突破，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，是用基因工程菌畢赤酵母生產(chǎn)。2005年研究又取得重大進(jìn)展，開發(fā)出新一代高比活植酸酶，處于國際領(lǐng)先地位。2010年，該產(chǎn)品生產(chǎn)銷售超過15 000 t，產(chǎn)值超過3億元人民幣，占據(jù)國內(nèi)植酸酶市場 90%以上。據(jù)我國飼料行業(yè)統(tǒng)計，由于飼料中添加了植酸酶，年節(jié)約飼料原料磷酸氫鈣20萬t以上，節(jié)約飼料成本約9億元，并使動物糞便中排出的可污染環(huán)境的磷減少了約30萬t，創(chuàng)造了較大的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。主要生產(chǎn)企業(yè)：北京挑戰(zhàn)飼料科技集團(tuán)、湖北新華揚、廣東溢多利、四川禾本生物等。

纖維素酶：主要生產(chǎn)企業(yè)為湖南尤特爾生化有限公司、山東隆大生物工程有限公司、湖南利爾康生物科技有限公司等。酸性纖維素酶是用基因工程菌里氏木霉生產(chǎn)，由畢業(yè)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)的留美李新良博士研制，2001年實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品的性價比居國內(nèi)領(lǐng)先地位。

高溫 α-淀粉酶 (普通、酸性)：主要生產(chǎn)企業(yè)為山東隆大生物工程有限公司、江蘇博立生物制品有限公司。

普魯蘭酶：該產(chǎn)品可水解液化淀粉中的α-1,6-D糖苷鍵產(chǎn)生 α-1,4-D直鏈多聚糖，用于與糖化酶配合生產(chǎn)高含量葡萄糖，與 β-淀粉酶配合生產(chǎn)麥芽糖含量高于 70%的麥芽糖漿主要生產(chǎn)企業(yè)：山東隆大生物工程有限公司。

α-乙酰乳酸脫羧酶：該產(chǎn)品可降解雙乙酰的前驅(qū)物 α-乙酰乳酸，減少雙乙酰的生成，確保啤酒中低水平雙乙酰含量，對提高啤酒質(zhì)量有重要作用。該產(chǎn)品研發(fā)項目由廣西大學(xué)生物技術(shù)有限試驗中心研究[13]，課題負(fù)責(zé)人為留英歸國黃日波博士，項目列入國家“863”計劃，通過基因工程菌重組構(gòu)建，發(fā)酵工藝優(yōu)化，酶的提取分離純化等技術(shù)攻關(guān)，1999年取得突破，實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。主要生產(chǎn)企業(yè)：南寧邦爾克生物技術(shù)有限公司。邦爾克生產(chǎn)的該產(chǎn)品2014年占據(jù)國內(nèi)市場50%以上，并出口歐美和亞洲。

啤酒復(fù)合酶：主要生產(chǎn)企業(yè)為寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司[16]，該產(chǎn)品于2000年研究成功，投入生產(chǎn)。該產(chǎn)品含有β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠酶、細(xì)菌中性蛋白酶、淀粉酶等。糖化時添加，用量為麥芽干重的0.03%–0.05%?？山档望溨扯?，提高過濾速度，澄清麥汁，增加收率，提高氨基氮含量，有利酵母生長。

脂肪酶：主要生產(chǎn)企業(yè)為深圳市綠微康生物工程有限公司，生產(chǎn)菌種擴展青霉，由福建師范大學(xué)生物工程學(xué)院吳松剛教授提供。北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司，菌種假絲酵母，由北京化工大學(xué)譚天偉院士提供。此外還有百圣龍生物工程有限公司，四川禾本生物技術(shù)有限公司和山東隆大生物工程有限公司 (國外引進(jìn)，菌種黑曲酶)。

截至2014年，我國酶制劑行業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品已有 20多個原酶品種 (糖化酶、植酸酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、β-淀粉酶、真菌淀粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、乳糖酶、凝乳酶、角質(zhì)酶等)。五大酶種占酶制劑總產(chǎn)量82%，其中糖化酶為30%、植酸酶為22%、淀粉酶為 14%、蛋白酶為 7%，纖維素酶為6%[17]。產(chǎn)品應(yīng)用于淀粉糖工業(yè)、紡織工業(yè)、飼料工業(yè)、酒精工業(yè)、啤酒工業(yè)、果汁果酒工業(yè)、面食制品加工、皮革工業(yè)、造紙工業(yè)等多個領(lǐng)域。

行業(yè)存在的主要問題：酶的品種還比較單一，由不同原酶組成具有不同用途的復(fù)合酶制劑發(fā)展滯后，不能滿足市場的需要；一些產(chǎn)品的性價比不高，發(fā)酵酶活力較低，有些產(chǎn)品提取工藝和裝備水平落后，產(chǎn)品還是粗制品，缺乏市場競爭力；酶制劑生產(chǎn)過程存在三廢對環(huán)境的污染問題，比如生產(chǎn)1 t液體糖化酶 (100 000 U/mL)可產(chǎn)生COD (化學(xué)需氧量) 高達(dá)5 000 mg/L以上的廢水10 t。酶制劑生產(chǎn)企業(yè)必須推行國家清潔生產(chǎn)政策，投入專業(yè)資金，做好自身的環(huán)境控制。重視這些問題的解決，將推動我國酶制劑工業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

致謝：感謝中國食品科技學(xué)會酶制劑分會侯炳炎先生提供我國酶制劑工業(yè)發(fā)展?fàn)顩r數(shù)據(jù)。

[1] Enzyme 2. Engineering XIV 1997, Beijing.

[2] 全國首次酶工程學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編,1991, 威海.

[3] 吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報, 特刊, 第二次全國酶工程學(xué)術(shù)討論會論文集, 1993, 長春.

[4] 第三次全國酶工程學(xué)術(shù)討論會論文摘要集,2000, 成都.

[5] 第四屆中國酶工程學(xué)術(shù)交流討論會論文集,2003, 無錫.

[6] 第五屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會論文集, 2005,?？?

[7] 第六屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會論文集, 2007,昆明.

[8] 第七屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會論文摘要集,2009, 合肥.

[9] 第八屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會論文集, 2011,廣州.

[10] 第九屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會論文摘要集,2013, 南寧.

[11] 生物工程學(xué)報, 酶工程?？? 2009.

[12] 生物工程學(xué)報, 酶工程專刊, 2012.

[13] 孟廣震. 中國生物工程學(xué)會組織. 新中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展史略. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2013: 47–50.

[14] 侯炳炎. 結(jié)緣酶制劑工業(yè)四十年. 第四屆全國酶制劑研究開發(fā)應(yīng)用技術(shù)研討會論文集. 無錫,2014, 10: 13–14.

[15] 中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會主辦. 發(fā)酵工業(yè), 2015,2: 42–44.

[16] 段鋼, 姜錫瑞, 周紅偉. 酶制劑應(yīng)用技術(shù)問答.北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2008: 163.

[17] 石維忱. 持續(xù)推進(jìn)我國酶制劑工業(yè)健康發(fā)展.無錫第四屆全國酶制劑研究開發(fā)應(yīng)用技術(shù)研討會論文集, 2014, 10: 1–2.