陳單丹，吳杰群，劉文

紅霉素是一類廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有良好的抗革蘭氏陽性菌活性和較低的腸胃道毒副作用[1]。自 1952年首次從紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea (最初命名為紅霉素鏈霉菌 Streptomyces erythreus)[2]中分離獲得后，紅霉素的使用率一直位于全球抗生素類藥物的前列。從化學結(jié)構(gòu)上看，紅霉素由紅霉內(nèi)酯 (Erythronolid)、L-碳霉糖 (L-mycarose) 和D-脫氧糖胺 (D-desosamine) 3部分以O(shè)-糖苷鍵連接而成。紅霉素A作為活性最好的天然組分，區(qū)別于紅霉素B、C、D的特征在于大環(huán)骨架的羥化和糖基單元的甲基化程度不同[3](圖1)。以紅霉素A為代表的第一代紅霉素在酸性條件下容易脫水縮合形成螺縮酮，繼而喪失生物活性[4]。此外，隨著紅霉素在臨床上的大量使用，越來越多的耐藥性問題也引起了人們的關(guān)注[5]。通過紅霉素A的結(jié)構(gòu)修飾，不僅能夠提高化合物對酸的穩(wěn)定性，克服細菌耐藥性的問題，甚至對抗菌譜也有較大的擴展[6]。以阿齊霉素(Azithromycin)[7]、克拉霉素 (Clarithromycin)[8]、羅紅霉素 (Roxithromycin)[9]為代表的第二代紅霉素，和以泰利霉素 (Telithromycin)[10]、賽紅霉素 (Cethromycin)[11]為代表的第三代紅霉素都是在紅霉素A的基礎(chǔ)上通過化學結(jié)構(gòu)修飾開發(fā)得到的[12](圖1)，同時也都是當今主流的醫(yī)用抗生素。由此可見，針對紅霉素A的產(chǎn)量提高研究具有重要的經(jīng)濟價值，而對其進行結(jié)構(gòu)改造更具有巨大的新藥開發(fā)潛力。由于紅霉素 A的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，采用化學方法進行合成和修飾的能力比較有限[13]。在掌握生物合成機制的前提下，人們可以特異性地從遺傳水平上操縱紅霉素產(chǎn)生菌種的代謝途徑，構(gòu)建基因重組菌株用于大量發(fā)酵最為有效的組分紅霉素 A；或者利用組合生物合成 (Combinatorial biosynthesis)技術(shù)對紅霉素A的生物合成途徑進行改造，獲得結(jié)構(gòu)復(fù)雜的紅霉素類似物庫用于篩選和發(fā)展具有應(yīng)用前景的藥物[14]。

圖1 紅霉素類抗生素的代表性藥物[3,7-11]Fig. 1 Representative erythromycins[3,7-11].

近年來，人們對于紅霉素A的生物合成機制已經(jīng)有了全面的研究和深刻的認識。除了紅色糖多孢菌以外，紅霉素的產(chǎn)生菌種主要是土壤微生物，包括紅霉素氣微菌 Aeromicrobium erythreum[15]和巴西諾卡菌 Nocardia brasiliensis[16]?；诋a(chǎn)生菌種的基因組測序[17]，紅霉素生物合成基因簇的信息不斷獲得豐富[18]，包括關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)功能鑒定、催化機制推導(dǎo)[19-22]以及生物合成途徑的闡明[23]等。值得一提的是，近期在中性嗜鹽的紅色放線多孢菌 Actinopolyspora erythraea 中也報道了紅霉素和新型紅霉內(nèi)酯的產(chǎn)生[24]。本實驗室通過對這株嗜鹽菌的全基因組測序，定位得到全新的紅霉素生物合成基因簇；結(jié)合化學型-基因型關(guān)聯(lián)分析，推導(dǎo)了其中紅霉素類化合物的生物合成機制[25]。本文綜述了近年來基于紅霉素A生物合成機制展開的以產(chǎn)量提高和結(jié)構(gòu)改造為目標的相關(guān)研究進展。

1 紅霉素A的生物合成機制

紅霉素A的生物合成可以分為大環(huán)內(nèi)酯骨架6-脫氧紅霉內(nèi)酯B (6-deoxyerythronolide B，6-dEB) 的形成和后修飾兩大步驟[23]。

6-dEB 的生物合成由 I型聚酮合酶(Polyketide synthase，PKS) 復(fù)合酶系催化。該復(fù)合酶系含有 3個酶蛋白亞基：DEBS1、DEBS2和DEBS3，總共包括1個起始模塊 (Module) 和6個延伸模塊，涉及3個基本功能域 (Domain)：β-酮基硫酯合成酶 (Ketosynthase，KS)、?；D(zhuǎn)移酶 (Acyltransferase，AT)、?；d體蛋白(Acyl carrier protein，ACP)[26]。起始模塊中的AT特異性識別丙酰輔酶A (Coenzyme A，CoA)，將其轉(zhuǎn)移到ACP上作為起始單元。起始單元隨后被轉(zhuǎn)移到第一個延伸模塊的KS上，同時第一個延伸模塊中的 AT特異識別甲基丙二酰 CoA并將其轉(zhuǎn)移到第一個延伸模塊的 ACP上，KS催化起始單元丙酰基與延伸單元甲基丙二?；s合形成 β-酮完成第一輪延伸。其他 5個延伸模塊采用類似的機理依次線性完成縮合，連接在PKS上的聚酮鏈在每一輪延伸后都會增加兩碳單元。此外，延伸模塊還選擇性含有 β-酮基還 原 酶 (β-ketoreductase， KR)、 脫 水 酶(Dehydratase， DH)、 烯 醇 還 原 酶(Enoylreductase，ER) 功能域，分別特異性地將延伸聚酮鏈的 β-羰基還原至羥基、反式烯基或完全飽和的狀態(tài)，最終形成一個十四碳的聚酮鏈。在末端硫酯酶 (Thioesterase，TE) 的催化下，該聚酮中間體從PKS上解離下來，環(huán)化形成 6-dEB[27](圖 2)。

大環(huán)內(nèi)酯骨架 6-dEB在形成之后，還需要經(jīng)歷一系列后修飾反應(yīng)才能獲得成熟的終產(chǎn)物紅霉素A，以及包括紅霉素B、C、D在內(nèi)的中間產(chǎn)物。首先，細胞色素P450氧化酶EryF在6-dEB的 C6位進行羥化，形成紅霉內(nèi)酯 B(Erythronolide B，EB)[28]。然后，糖基轉(zhuǎn)移酶EryBV在EB的C3位羥基上連接L-碳霉糖，形成 3-O-碳霉糖基紅霉內(nèi)酯 B (3-α-mycarosyl erythronolide B，MEB)。緊接著，另一個糖基轉(zhuǎn)移酶 EryCⅢ在MEB的 C5位羥基上連接D-脫氧糖胺，形成首個具有生物活性的中間體——紅霉素D[29]。紅霉素D在細胞色素P450氧化酶EryK的催化下完成C12位的羥化，合成紅霉素C；再在 S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosyl methionine，SAM) 依賴的甲基化酶 EryG作用下完成碳霉糖單元 C3’’位的羥甲基化，合成最終產(chǎn)物紅霉素A。此外，紅霉素D也可以以較低的效率先在EryG的作用下完成碳霉糖單元的羥甲基化，得到紅霉素B；再通過EryK的作用，合成紅霉素A[30](圖2)。作為后修飾不完全的中間體，紅霉素B、C、D等組分在原始產(chǎn)生菌種的發(fā)酵液中廣泛存在、難以去除，被視為副產(chǎn)物。

2 以生物合成為基礎(chǔ)的紅霉素A的產(chǎn)量提高研究

由于紅霉素A的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，采用化學合成工藝累積步驟繁瑣、成本較高，因此，生產(chǎn)上主要采用微生物發(fā)酵的方法獲得。紅霉素發(fā)酵產(chǎn)業(yè)所面臨的主要問題是發(fā)酵單位不高、組分比例不佳，這也使我國紅霉素A原料藥的競爭力受到了很大的限制。

圖2 紅霉素A的生物合成途徑[23]Fig. 2 Biosynthetic pathway of erythromycin A[23].

針對發(fā)酵單位不高的問題，除了傳統(tǒng)的誘變育種以外，人們也基于紅霉素A的生物合成機制開發(fā)了若干行之有效的高產(chǎn)菌種遺傳改造策略。例如，每分子紅霉素A的生物合成都需要引入1分子的丙酰CoA和6分子的甲基丙二酰 CoA。因此，提高這兩種前體特別是甲基丙二酰CoA的體內(nèi)供給量將極大地提高紅霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。Reeves等[31-32]通過過量表達甲基丙二酰CoA變位酶 (Methylmalonyl-CoA mutase，MCM)，強化了甲基丙二酰 CoA前體的體內(nèi)供給量，獲得了紅霉素的高產(chǎn)菌株。如果把紅色糖多孢菌看成紅霉素生物合成的車間，那么最有效直接的提高生產(chǎn)速度的方法不是改變生產(chǎn)過程中某一個環(huán)節(jié)的工藝，而是重新建設(shè)一條新的生產(chǎn)線。本實驗室在紅色糖多孢菌體內(nèi)倍增了紅霉素的PKS編碼基因，使紅霉素的產(chǎn)量提高了近50%，并使發(fā)酵周期縮短了1/3。此外，由于大腸桿菌 Escherichia coli具有生長代謝快速、基因操作方便、遺傳背景清楚等優(yōu)點，是理想的紅霉素A異源表達宿主。Pfeifer課題組通過導(dǎo)入紅霉素生物合成基因簇中的全部結(jié)構(gòu)基因，實現(xiàn)了紅霉素A在大腸桿菌中的異源表達[33]。他們還通過強化外源蛋白的表達，在大腸桿菌中合理地調(diào)控丙酰CoA和甲基丙二酰CoA前體的生物合成，提高了紅霉素的產(chǎn)量[34]。

針對組分比例不佳的問題，解決方法在于選育紅霉素A的絕對優(yōu)勢菌株。根據(jù)紅霉素A的骨架結(jié)構(gòu)后修飾途徑，控制紅霉素從D組分到A組分的轉(zhuǎn)化需要兩個關(guān)鍵的后修飾蛋白參與：細胞色素P450氧化酶EryK和SAM依賴的甲基化酶 EryG。這兩個酶催化效力的不足直接導(dǎo)致了紅霉素B和C的積累[30]。本實驗室首先通過同源重組的方式把2個拷貝的eryK和1個拷貝的eryG導(dǎo)入到紅色糖多孢菌E3染色體中。當羥化酶基因 eryK與甲基化酶基因 eryG的拷貝數(shù)為3∶2時，雜質(zhì)紅霉素B和C完全消失，紅霉素A的產(chǎn)量也提高了約30%[35]。這是首例采用基因工程的方法從根源上把紅霉素雜質(zhì)組分 B和 C完全除去。為了克服菌種發(fā)酵的不穩(wěn)定性，保證高產(chǎn)菌株在沒有抗性壓力的情況下依然維持穩(wěn)定的基因型和高產(chǎn)表型，本實驗室嘗試采用由放線菌噬菌體ΦC31整合酶介導(dǎo)的位點特異性重組構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的紅霉素A高產(chǎn)菌株。我們在紅色糖多孢菌基因組中一段功能喪失的 PKS區(qū)域?qū)牖讦礐31整合酶整合的基因插入盒，將8個拷貝的ΦC31整合酶特異性識別的細菌插入序列(Bacterial attachment site，attB) 導(dǎo)入上述PKS區(qū)域，以后便可以實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定整合 (圖3)，也為紅霉素A的工業(yè)生產(chǎn)帶來了便利[36]。

3 以生物合成為基礎(chǔ)的紅霉素A的結(jié)構(gòu)改造研究

紅霉素A的生物合成包含兩大步驟，相應(yīng)地，對其進行結(jié)構(gòu)改造的策略也主要從兩方向展開：其一是對編碼6-dEB形成的PKS基因進行遺傳改造，定向改變大環(huán)內(nèi)酯的骨架結(jié)構(gòu)；其二是對紅霉素合成的后修飾途徑進行遺傳改造，特別是定向改變糖基單元的結(jié)構(gòu)。

3.1 大環(huán)內(nèi)酯骨架的結(jié)構(gòu)改造

Ⅰ型PKS的組織結(jié)構(gòu)和催化功能之間存在著一一對應(yīng)的線性邏輯關(guān)系，在蛋白亞基、模塊、功能域水平上的任何改變，都會影響大環(huán)內(nèi)酯合成反應(yīng)中的某一環(huán)節(jié)，從而引起骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的變化。由此產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯大多能夠經(jīng)歷后修飾反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的紅霉素類似物。目前，對紅霉素大環(huán)內(nèi)酯骨架的結(jié)構(gòu)改造研究主要集中在模塊和功能域的改變上，常見的策略包括功能域的替換、失活或插入，以及模塊的替換、重組或改造等[37]。

圖3 紅霉素A高產(chǎn)菌株的構(gòu)建策略和發(fā)酵產(chǎn)物分析[36]Fig. 3 Strategy of constructing high erythromycin A-producing strains and analysis of the fermentation products[36].

3.1.1 Ⅰ型PKS功能域水平上的遺傳操作

在Ⅰ型PKS中，AT功能域負責小分子羧酸底物的識別和上載。將其替換為識別不同底物的AT，可以在聚酮鏈的合成過程中摻入不同的結(jié)構(gòu)單元。在6-dEB的形成過程中，6個延伸模塊的AT都特異識別和上載甲基丙二酰CoA。將特異識別丙二酰CoA的AT分別替換模塊1到模塊6的AT，能夠分別產(chǎn)生在大環(huán)內(nèi)酯C12、C10、C8、C6、C4和 C2位缺少甲基的紅霉內(nèi)酯 1-6[38-41]。類似地，采用來自尼達霉素(Niddamycin) 的PKS模塊7的識別乙基丙二酰CoA的AT替換紅霉素PKS模塊5的AT，則可獲得C6位乙基取代的紅霉內(nèi)酯7[42](圖4)。

Ⅰ型PKS的延伸模塊選擇性含有KR、DH和ER功能域，通過影響延伸中聚酮鏈的β-羰基的還原水平，改變大環(huán)內(nèi)酯的骨架結(jié)構(gòu)。對紅霉素PKS模塊6中的KR和模塊4中的ER進行點突變失活，可以分別得到C3位酮基取代的紅霉內(nèi)酯 8和 C6-C7位不飽和的紅霉內(nèi)酯9[43-44]。此外，直接敲除模塊6中的KR將影響與之相連的AT的底物識別特異性，除產(chǎn)生化合物8外，還意外地產(chǎn)生了化合物10[37](圖5)。而對紅霉素PKS唯一的模塊4中的DH進行點突變失活，將導(dǎo)致DEBS2功能的完全喪失[45]。

圖 4 延伸模塊 AT功能域替換所產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯1-7[38-42]Fig. 4 Novel erythronolides 1-7 produced by substituting the AT domains in the extender modules[38-42].

圖5 延伸模塊KR和ER功能域失活所產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯8-10[37,43-44]Fig. 5 Novel erythronolides 8-10 produced by inactivating the KR and ER domains in the extender modules[37,43-44].

向紅霉素PKS的相關(guān)模塊插入原本不存在的KR、DH和ER功能域，同樣能夠產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)類似物。McDaniel等用雷帕霉素(Rapamycin) PKS模塊4中的DH-KR區(qū)域分別取代紅霉素PKS模塊2和模塊6中的KR，產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯C10-C11位和C2-C3位含有不飽和烯鍵的紅霉內(nèi)酯 11和 12。而用雷帕霉素 PKS模塊 1中的 DH-ER-KR區(qū)域分別取代紅霉素PKS模塊2和模塊5中的KR，則產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯C11位和C5位脫羥基的紅霉內(nèi)酯13和14。然而，用此區(qū)域替換紅霉素PKS模塊6的KR時，并未發(fā)現(xiàn)C3位脫羥基的化合物出現(xiàn)，反而有較多的化合物12和15積累[39]。由此可見，替換后的模塊ER無活性，KR只有部分活性。這點可以反映出插入功能域的活性受到蛋白整體結(jié)構(gòu)的影響。許多由Ⅰ型PKS編碼的聚酮化合物，如泰樂菌素 (Tylosin)[46]、苦霉素 (Pikromycin)[47]、多殺菌素 (Spinosyn)[48]、竹桃霉素(Oleandomycin)[49]等，其起始模塊在AT-ACP區(qū)域的前端含有 β-酮酰基合成酶 (β-ketoacyl synthase，KSQ) 功能域。首先，AT識別丙二酰CoA，將其結(jié)合到ACP上；隨后，KSQ催化丙二酰硫醇脫羧形成乙?；蛔詈?，再轉(zhuǎn)移到第一個延伸模塊的KS上進行后續(xù)的合成。把竹桃霉素起始模塊中的KSQ與雷帕霉素模塊2中識別丙二酰CoA的AT相連，用以替換紅霉素PKS起始模塊中識別丙酰CoA的AT，該雜合的起始模塊最終把乙?；鶄鬟f到紅霉素PKS第一個延伸模塊的 KS上，產(chǎn)生 C13位帶有甲基的紅霉內(nèi)酯 16[50](圖6)。

圖6 延伸模塊KR和ER-KR功能域插入所產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯11-16[39,50]Fig. 6 Novel erythronolides 11-16 produced by inserting the KR and ER-KR domains in the extender modules[39,50].

3.1.2 Ⅰ型PKS模塊水平上的遺傳操作

紅霉素和阿維菌素 (Avermectin) PKS的起始模塊均只含有AT-ACP結(jié)構(gòu)域。前者的AT能夠特異性識別丙酰CoA為起始單元，并將其上載到同模塊的ACP上；后者的AT具有較為寬泛的底物選擇性，能夠識別異丁酰CoA或者2-甲基丁酰CoA為起始單元，將其上載到同模塊的ACP上[51]。用阿維菌素PKS的起始模塊替換紅霉素PKS的起始模塊，雜合的PKS能合成大環(huán)內(nèi)酯 C13位上連接異丙基或仲丁基的紅霉內(nèi)酯 17和 18[52](圖 7)。

圖7 起始模塊替換所產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯17-18[52]Fig. 7 Novel erythronolides 17-18 produced by substituting the loading module[52].

紅霉素DEBS3末端的TE功能域負責聚酮鏈的水解，并將其環(huán)化成為十四元環(huán)骨架6-dEB[53]。該TE對聚酮鏈的長度有較高的容忍度，能夠識別和催化不同長短的聚酮鏈形成不同大小的內(nèi)酯環(huán)。將TE連接到DEBS1的末端能夠產(chǎn)生六元環(huán)內(nèi)酯化合物19[54](圖8A)。而將含有紅霉素PKS模塊5和6及TE的DEBS3基因?qū)氲教焖{色鏈霉菌 Streptomyces coelicolor CH999中，在不含起始模塊的情況下，DEBS3仍能識別甲基丙二酰CoA為底物，脫羧形成丙?；^續(xù)往下延伸，最終環(huán)化形成六元環(huán)內(nèi)酯20[55](圖8B)。這與前面所述起始模塊含有KRQ結(jié)構(gòu)域的催化機制十分相似。化合物 19與 20的構(gòu)型不同，原因在于KR催化的立體選擇性：其中，模塊 1的 KR在催化β-酮基還原成羥基時，專一地產(chǎn)生R構(gòu)型產(chǎn)物；而其他模塊的KR則都產(chǎn)生 S構(gòu)型的產(chǎn)物[56-57]。KR屬于短鏈脫氫/還原酶 (Short-chain dehydrogenase/reductase，SDR) 家族[58]，催化產(chǎn)生R構(gòu)型化合物的 KR活性中心一側(cè)含有高度保守的天冬氨酸殘基，催化產(chǎn)生S構(gòu)型化合物的 KR活性中心則缺少此天冬氨酸殘基而在活性中心相反的一側(cè)含有色氨酸殘基。如此細微差異使聚酮化合物在進入KR活性中心時的方向不同，從而導(dǎo)致還原產(chǎn)物形成不同的立體構(gòu)型[44,57]。將TE連接到模塊5的末端能夠產(chǎn)生十二元環(huán)內(nèi)酯21[59](圖8C)。將雷帕霉素PKS模塊2或模塊5插入到紅霉素PKS模塊1之后，能夠產(chǎn)生十六元環(huán)化合物22和23以及在C13位環(huán)化的十四元環(huán)產(chǎn)物 24和 25[60](圖 8D)。

近年來對 DEBS的蛋白晶體學研究日益深入，基于對蛋白立體結(jié)構(gòu)和蛋白亞基相互作用的分析，可以人為地對PKS模塊進行定向改造。研究發(fā)現(xiàn)，ACP功能域的結(jié)構(gòu)對延伸中的聚酮鏈在模塊內(nèi)和模塊間的傳遞都至關(guān)重要[61]。通過改造紅霉素PKS模塊3中的ACP，將其部分替換成模塊2的ACP，可以實現(xiàn)整個模塊3的重復(fù)使用，形成四酮產(chǎn)物26[62](圖9)。

3.2 后修飾途徑中糖基單元的結(jié)構(gòu)改造

圖8 重組模塊的結(jié)構(gòu)與其催化合成的產(chǎn)物[54-55,59-60] (A：TE功能域與起始模塊、延伸模塊1-2組合所產(chǎn)生的新型六元內(nèi)酯19；B：TE功能域與延伸模塊5-6組合所產(chǎn)生的新型六元內(nèi)酯20；C：TE功能域與起始模塊、延伸模塊1-5組合所產(chǎn)生的新型十二元內(nèi)酯21；D：雷帕霉素延伸模塊2或5插入所產(chǎn)生的新型十六元內(nèi)酯22和23、新型十四元內(nèi)酯24和25)Fig. 8 Domain organization of hybrid PKSs and their products[54-55,59-60]. (A) A novel six-membered erythronolide 19 produced by coupling the TE domain with the loading module and the extender modules 1-2. (B) A novel six-membered erythronolide 20 produced by coupling the TE domain with the loading module and the extender modules 5-6. (C) A

紅霉素 A生物合成的后修飾過程包括在6-dEB上的兩步羥基化、兩步糖基化以及在糖基上的一步甲基化。由于糖基單元能夠直接參與天然產(chǎn)物與靶點之間的相互作用，或者參與靶細胞的識別[63]，因此，在紅霉素A后修飾途徑研究中最有價值的部分是大環(huán)內(nèi)酯骨架的糖基化。C5位的D-脫氧糖胺幾乎存在于所有的十四元大環(huán)內(nèi)酯類活性天然產(chǎn)物中，被認為是紅霉素A與核糖體結(jié)合從而抑制細菌生長的一個關(guān)鍵因素[37,64]。而C3位L-碳霉糖的存在似乎對于紅霉素A的抗菌活性貢獻不大，去除以后的紅霉素衍生物反而能夠克服一些已經(jīng)出現(xiàn)的細菌耐藥性問題[65]。由此提示，對于紅霉素A糖基novel twelve-membered erythronolide 21 produced by coupling the TE domain with the loading module and the extender modules 1-5. (D) Novel sixteen-membered erythronolides 22 and 23 and fourteen-membered erythronolides 24 and 25 produced by inserting the extender module 2 or 5 of rapamycin.單元的結(jié)構(gòu)改造著眼點應(yīng)該放在由糖基轉(zhuǎn)移酶EryBV催化紅霉素內(nèi)酯環(huán) C3位羥基的糖基化上。體外測活實驗證實，EryBV對糖基單元具有比較寬泛的底物選擇性，能夠識別一系列的糖基作為底物以較低的催化效率合成紅霉素類似物 27?37[66]。

圖9 改造ACP功能域使模塊3重復(fù)催化鏈延伸[62]Fig. 9 Engineered module 3 with the chimeric ACP domain exhibits iterative chain elongation[62].

圖10 EryBV底物寬泛性所產(chǎn)生的紅霉素中間體[66]Fig. 10 Erythromycin intermediates based on the substrate promiscuity of EryBV[66].

圖 11 EryCⅢ底物寬泛性所產(chǎn)生的紅霉素類似物[68-69]Fig. 11 Erythromycin analogues based on the substrate promiscuity of EryCⅢ[68-69].

相對于EryBV，糖基轉(zhuǎn)移酶EryCⅢ對糖基單元具有較高的底物特異性[67]。有報道顯示，EryCⅢ能夠把 D-麥氨糖 (D-mycaminose) 轉(zhuǎn)移到大環(huán)內(nèi)酯C5位的羥基上，從而形成新的紅霉素類似物紅霉素M[68]。當缺乏D-脫氧糖胺時，EryCⅢ也可能識別 L-碳霉糖，催化形成化合物38[69]。

許多糖基轉(zhuǎn)移酶對底物的容忍性都比較高，可能將不同的糖基轉(zhuǎn)移至紅霉素大環(huán)內(nèi)酯骨架。例如，來自泛溫鏈霉菌 Streptomyces eurythermus的 AngMⅡ是泰樂菌素生物合成中糖基轉(zhuǎn)移酶。以泰樂酮 (Tylactone) 作為天然底物，將 D-麥氨糖轉(zhuǎn)移到 C5位的羥基上，產(chǎn)生化合物 39。研究發(fā)現(xiàn)，AngMⅡ同樣能夠識別EB 作為底物，糖基化產(chǎn)生化合物 40[69]，并且糖基化的位置是C5位的羥基，而不是C3位的羥基。又如，苦霉素生物合成中負責C5位羥基糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶對底物的容忍性也較高，能夠識別一系列 6-dEB類似物，可以合成超過20種以上的新化合物[70]。

圖 12 糖基轉(zhuǎn)移酶 AngMⅡ催化產(chǎn)生的新型紅霉素40[69]Fig. 12 Novel erythromycin 40 generated by the glycosyltransferase AngMⅡ[69].

4 總結(jié)

作為紅霉素最為有效的天然組分和化學修飾獲得第二代、第三代紅霉素藥物的底物，紅霉素A的產(chǎn)量提高和結(jié)構(gòu)改造具有非常重要的意義和價值?；谏锖铣蓹C制，可以明確與紅霉素A生物合成直接相關(guān)的關(guān)鍵因素，包括PKS前體、催化蛋白等。在高產(chǎn)菌株遺傳改造方面，傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)目標不明確，結(jié)果不穩(wěn)定，弊端顯而易見。通過對生物合成中的限速步驟的預(yù)測，可以對高產(chǎn)菌株的遺傳改造進行良好的指導(dǎo)。例如，在紅霉素A產(chǎn)生菌的體內(nèi)增加催化蛋白和PKS前體的濃度，可以提高紅霉素的發(fā)酵產(chǎn)量[31-32]；對后修飾途徑中的關(guān)鍵基因進行表達強化，則可以特異性提高紅霉素A的組分比例[35-36]。在化合物結(jié)構(gòu)改造方面，采用化學合成或修飾的方法所能進行的結(jié)構(gòu)衍生也非常有限。通過對關(guān)鍵催化蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的分析，則可以更好地利用組合生物合成技術(shù)獲得大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜的紅霉素 A類似物。目前的研究重點主要集中在 6-dEB大環(huán)內(nèi)酯骨架結(jié)構(gòu)的改造和后修飾步驟中的糖基化反應(yīng)。我們相信，充分利用生物合成的基本原理進行菌種的遺傳改造，可以彌補化學合成和修飾的不足，降低紅霉素A的生產(chǎn)成本，促進新藥的研發(fā)。

值得一提的是，以對天然產(chǎn)物生物合成機制的理性認識指導(dǎo)微生物菌種遺傳改造的這種“師從于自然”的理念對于大量具有高附加值的抗生素類藥物同樣適用。本實驗室長期致力于采用化學思想和生物學技術(shù)解決在大宗微生物藥物發(fā)酵工業(yè)中的實際問題，在阿維菌素(Avemectin)[71]、硫鏈絲菌素 (Thiostrepton)[72-73]、他克莫司 (Tacrolimus)[74]、林可霉素(Lincomycin)[75]的產(chǎn)生菌種改造方面做出了大量基礎(chǔ)型和應(yīng)用型的研究工作。在改造菌種的發(fā)酵產(chǎn)品中，有效組分的產(chǎn)量提高、比例優(yōu)化，可以大幅度地提高生產(chǎn)效益，簡化后續(xù)工藝，增強企業(yè)競爭力，同時促進微生物藥物的更新升級。

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