牙庫(kù)甫江·阿西木，阿斯古麗·伊斯馬伊力，王韻婧，劉玉樂(lè)

病毒是重要的植物病原，至今發(fā)現(xiàn)的致病性植物病毒約有450種[1]。它們通過(guò)多種傳播途徑感染農(nóng)作物。植物病毒病被稱作植物的“癌癥”，一旦流行就可能造成較大的農(nóng)作物損失，嚴(yán)重時(shí)甚至造成絕產(chǎn)。長(zhǎng)期以來(lái)人們利用多種防治策略來(lái)控制病毒，例如培育抗病毒品種、使用化學(xué)殺菌劑、切斷病毒的感染途徑、組織脫毒、傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)防治等，但都無(wú)法從根本上防治病毒病的危害。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展完善，20世紀(jì)80年代初人們提出了利用基因工程手段提高植物抗病毒的設(shè)想。自Abel等[2]成功地將煙草花葉病毒 (Tobacco mosaic virus，TMV) 的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化到煙草植物中獲得穩(wěn)定遺傳的抗病毒煙草植株以來(lái)，植物基因工程技術(shù)已經(jīng)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。本文綜述了植物抗病毒機(jī)制及目前比較常用的植物抗病毒基因工程策略。

1 植物先天抗病毒機(jī)制

病毒在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下可以成功侵染植物，而植物也對(duì)病毒的侵染有防御反應(yīng)；如果病毒能夠戰(zhàn)勝植物防御機(jī)制，就會(huì)引發(fā)植物病毒病。植物主要通過(guò)兩種方式響應(yīng)具體病原體[3-6]，一種是主要利用植物葉片表面的角質(zhì)層、蠟質(zhì)層、植物細(xì)胞壁、酶抑制劑以及部分抗微生物化合物等阻止病原體的侵入；另一種是主要通過(guò)激活寄主植物免疫反應(yīng)抑制病原的侵染。那么寄主植物如何與病毒之間進(jìn)行相互作用從而激活對(duì)病毒的抗性呢？一般來(lái)說(shuō)，植物的抗病毒功能是通過(guò)植物先天免疫系統(tǒng)和植物體內(nèi)的基因沉默兩套機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

1.1 植物先天免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制

與動(dòng)物等多細(xì)胞生物一樣，植物也有先天免疫系統(tǒng)，它通過(guò)植物細(xì)胞生產(chǎn)特定物質(zhì)來(lái)應(yīng)答病原的侵入[7]。根據(jù)從植物與細(xì)菌、真菌相互作用獲得的知識(shí)，植物先天免疫可分為兩個(gè)層次。一是通過(guò)細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(Pattern-recognition receptors，PRRs) 識(shí)別病原體相關(guān)分子模式 (Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs) 產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，稱為病原體相關(guān)分子激發(fā)的免疫反應(yīng) (PAMP-triggered immunity，PTI)[8]。盡管目前對(duì)于植物是否存在針對(duì)病毒的 PTI一直存在爭(zhēng)議，但病毒學(xué)家通常認(rèn)為RNA沉默是植物針對(duì)病毒的PTI。另一種是指植物通過(guò)自身的抗性基因 (Resistance gene，R基因) 特異地識(shí)別病原物效應(yīng)因子所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，也稱為效應(yīng)因子激發(fā)的免疫反應(yīng) (Effector-triggered immunity，ETI)[9-10]。所謂的效應(yīng)因子 (Effectors) 是指病原體為了克服植物PTI而產(chǎn)生的物質(zhì)，被植物R基因識(shí)別后可誘發(fā)植物抗病反應(yīng)。

在與病原體相互作用的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物逐漸產(chǎn)生了抗病基因 (Resistance genes，R基因) 系統(tǒng)，使植物對(duì)病原體的侵染表現(xiàn)出了一系列的防御反應(yīng)。上個(gè)世紀(jì)初 Biffen[11]開(kāi)始關(guān)注單基因?qū)χ参锟共⌒缘挠绊懀?971年Flor[12]首次報(bào)道植物具有顯性 R基因，提出植物的抗性取決于病原體的無(wú)毒基因 (Avirulence gene,Avr基因) 和植物相應(yīng)的R基因之間的親和性。植物的R基因編碼的蛋白 (R蛋白) 直接或者間接地識(shí)別病原物編碼的無(wú)毒蛋白效應(yīng)子 (Avr)，激活下游級(jí)聯(lián)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一系列抗性反應(yīng)，并最終限制病原在入侵寄主上的擴(kuò)散和不同寄主間的傳播[13-14]。R蛋白稱為受體，而相應(yīng)的Avr蛋白稱為激發(fā)子[15-16]。當(dāng)avr基因丟失或突變后，R蛋白無(wú)法識(shí)別Avr蛋白，二者無(wú)法互作，下游網(wǎng)絡(luò)信號(hào)無(wú)法激活，植物也因此不能產(chǎn)生有效的防御反應(yīng)，導(dǎo)致植物病害發(fā)生。

植物R蛋白具有抵抗真菌、細(xì)菌、病毒以及線蟲等病原體的功能[17]。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，植物R蛋白可分為兩大類：一是NBS-LRRs結(jié)構(gòu)型蛋白，二是非 NBS-LRRs結(jié)構(gòu)型蛋白。R蛋白中絕大多數(shù)是屬于 NBS-LRRs結(jié)構(gòu)型蛋白，主要負(fù)責(zé)識(shí)別胞內(nèi)的信號(hào)。NBS-LRRs結(jié)構(gòu)型蛋白由 3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即含有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 NBS (Nucleotide-Binding site)、亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域LRRs (Leucine-rich repeats) 以及N末端的卷曲螺旋CC (Coiled-coil) 結(jié)構(gòu)或Toll和白介素1受體結(jié)構(gòu)域TIR (Toll and interleukin-1 receptor)[7]。非NBS-LRRs結(jié)構(gòu)型蛋白包括胞內(nèi)激酶類R蛋白、含有LRRs的受體激酶類R蛋白、跨膜并具有胞外 LRRs結(jié)構(gòu)域的R蛋白、跨膜但僅有胞內(nèi)CC結(jié)構(gòu)域的R蛋白。這種R蛋白主要負(fù)責(zé)識(shí)別胞外的信號(hào)[18-21]。至今在植物體內(nèi)已經(jīng)克隆獲得了100多種R基因[22]，其中具有病毒抗性的R基因約有40多種 (表1)。

R基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程：當(dāng)無(wú)毒因子存在時(shí)，無(wú)毒因子可以通過(guò)某種機(jī)制活化原本處于失活狀態(tài)的R蛋白，有活性的R蛋白再通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程激活各種抗病反應(yīng)，抵御病原物的侵害。R 基因介導(dǎo)的植物抗性常表現(xiàn)為超敏反應(yīng)(Hypersensitive response，HR) 和系統(tǒng)性抗性(Systemic resistance，SR)。HR是植物抵抗病原物入侵的一種主動(dòng)、快速的應(yīng)答反應(yīng)，以程序性細(xì)胞死亡形式表現(xiàn)。最初病毒侵染位點(diǎn)周圍的細(xì)胞由于快速誘導(dǎo)的細(xì)胞程序化死亡形成了肉眼可見(jiàn)的局部壞死斑，病毒通常會(huì)被局限在損害的局部而不能擴(kuò)散到周圍健康的組織。發(fā)生HR的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生信號(hào)分子，傳遞給周圍的細(xì)胞，然后通過(guò)植物韌皮部擴(kuò)散到整個(gè)植株，使植物能夠產(chǎn)生對(duì)更多種類的病原物的抗性[24]，即誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。

表1 已克隆的植物R基因[23]Table 1 Plant R genes conferring resistance to viruses[23]

1.2 基因沉默介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制

RNA 沉默 (RNA silencing) 或基因沉默(Gene silencing) 是植物抵抗外來(lái)核酸 (轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)基因或病毒) 入侵并保護(hù)自身基因組完整性的一種防御機(jī)制，它最顯著的特征就是能產(chǎn)生具有序列特異性調(diào)控功能的小 RNA。小RNA(Small RNA，sRNA) 是長(zhǎng)度為21?24 nt的非編碼蛋白的小RNA分子，在真核生物中參與生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控、染色體修飾、抗病毒以及保護(hù)宿主細(xì)胞基因組穩(wěn)定性等多種生物學(xué)過(guò)程[25]。有一類 sRNA稱為小干擾 RNA (Small interfering RNA，siRNA)，是由雙鏈 RNA(Double-stranded RNA，dsRNA) 產(chǎn)生的片段。siRNA一般來(lái)源于基因組上的重復(fù)序列(Repeated sequences)、反向重復(fù)序列 (Inverted repeats)、轉(zhuǎn)座子 (Transposons) 或反轉(zhuǎn)錄子(Retroelements)[26-27]。除此之外，siRNA還可以由病毒和含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的外源性基因產(chǎn)生[28]。siRNA主要通過(guò)指導(dǎo)與其互補(bǔ)的mRNA或病毒RNA的降解、翻譯抑制或組蛋白修飾等過(guò)程抑制靶基因的表達(dá)或翻譯。RNA沉默在植物抗病毒機(jī)制中都具有重要意義。

RNA沉默介導(dǎo)的植物抗病毒反應(yīng)是植物抵抗病毒侵染的有效手段。大多數(shù)植物病毒是RNA病毒，在病毒成功入侵植物后，病毒RNA復(fù)制成雙鏈RNA (dsRNA)。dsRNA會(huì)被植物體內(nèi)的Dicer (一種RNA酶) 降解成21?25 nt的小的干擾 siRNA。這些 siRNA再與植物體內(nèi)的AGO蛋白結(jié)合，形成具 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，與外源 RNA特異結(jié)合后，在結(jié)合部位切割RNA，從而降解外源RNA[29-31]，抵抗病毒的侵入。病毒在與植物漫長(zhǎng)的競(jìng)賽中進(jìn)化出 RNA 沉默抑制子抑制宿主RNA沉默系統(tǒng)，從而逃避植物的防御，增強(qiáng)致病能力。

2 植物抗病毒基因工程策略

1984年首次報(bào)道將細(xì)菌抗抗生素基因通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入到煙草體內(nèi)并表達(dá)成功[32]，開(kāi)創(chuàng)了植物轉(zhuǎn)基因之路，為植物抗病毒基因工程領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。1986年，Abel等[2]通過(guò)植物基因工程技術(shù)首次將煙草花葉病毒 (TMV) 外殼蛋白基因轉(zhuǎn)人煙草，培育出能穩(wěn)定遺傳的抗病毒工程植株，由此開(kāi)啟了抗病毒植物基因工程這一新的領(lǐng)域。自此以后，人們利用不同的策略來(lái)獲得抗病毒工程植株。

2.1 病毒來(lái)源的抗性

2.1.1 病毒外殼蛋白介導(dǎo)的策略

1985年Sanford和Johnston[33]首次提出通過(guò)病毒來(lái)源的抗性 (Pathogen derived resistance，PDR) 抑制病毒的設(shè)想，即把病毒的某一個(gè)基因或基因組的一部分序列導(dǎo)入宿主植物來(lái)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性從而抑制病毒。1986年Abel等[2]將TMV的外殼蛋白 (Coat protein, CP) 基因轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行表達(dá)而使煙草獲得一定程度的對(duì)TMV的抗性，證明了病毒蛋白可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)相應(yīng)病毒的抗性。自此之后，對(duì)PDR方法的研究一直成為抗病毒的研究熱點(diǎn)。

外殼蛋白是形成病毒顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白，其功能是包被并保護(hù)病毒基因組核酸，參與病毒的長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)?。外殼蛋白介?dǎo)的抗性是研究最早，也是到目前為止比較成功的抗病毒手段。外殼蛋白介導(dǎo)的抗性 (Coat protein mediated resistance，CPMR) 策略是將病毒的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞內(nèi)，從而使得轉(zhuǎn)基因植物獲得抗病毒的能力[34]。此種方法產(chǎn)生的病毒抗性有些是廣泛的，有些是比較局限的[35]，抗性范圍可能因病毒種類不同而不同，如轉(zhuǎn)馬鈴薯花葉病毒 (Potato mosaic virus，PMV) CP基因的馬鈴薯對(duì)PMV和其他的同組病毒均有抗性[36]，但是轉(zhuǎn)化木瓜環(huán)斑病毒 (Papaya ringspot virus，PRSV) HA株系CP基因的木瓜只能對(duì)PRSV HA株系產(chǎn)生抗性[37]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，株系專一的抗性常是由于RNA沉默導(dǎo)致的。至今通過(guò)CPMR策略獲得抗約35種病毒的轉(zhuǎn)基因植物，如有轉(zhuǎn)番茄花葉病毒 (Tomato mosaic virus, ToMV)，黃化葉病毒 (Yellow mosaic virus)，黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV) 以及番茄黃化曲葉病毒 (Tomato yellow leaf curling virus,TYLCV) 外殼蛋白基因的番茄[38]，其中抗CMV的番茄等經(jīng)濟(jì)作物已經(jīng)通過(guò)認(rèn)證商業(yè)化[39]。此外，劉小紅等還將玉米矮花葉病毒 (Maize dwarf mosaic virus, MDMV) 外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入玉米，獲得了對(duì)MDMV有抗性的玉米[40]。

2.1.2 病毒復(fù)制酶介導(dǎo)的策略

除了病毒外殼蛋白提供有效的植物病毒抗性外，用其他病毒蛋白，如復(fù)制酶和運(yùn)動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)基因也可獲得病毒抗性[41-44]。復(fù)制酶是指由病毒編碼的能特異合成病毒正、負(fù)鏈 RNA的RNA聚合酶。1990年Golemboski等[45]報(bào)道將TMV復(fù)制酶的一段核酸序列轉(zhuǎn)入煙草后產(chǎn)生對(duì)TMV的抗性。隨后的研究顯示轉(zhuǎn)病毒復(fù)制酶基因的部分，全長(zhǎng)以及突變序列的植物均有病毒抗性，但是抗性的程度和范圍不盡相同[46]。研究顯示不同病毒復(fù)制酶轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的抗性機(jī)制不同，一些在蛋白質(zhì)水平上介導(dǎo)抗性，但許多是RNA介導(dǎo)的病毒抗性[47]。在蛋白水平上，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的復(fù)制酶在病毒的侵染過(guò)程中作為一種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮功能，從而打破了病毒復(fù)制的平衡，或者是干擾了催化產(chǎn)生復(fù)制酶的酶活性的反饋抑制途徑[48]。復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性對(duì)于植物病毒的種類具有很高的特異性，因此其應(yīng)用范圍可能會(huì)受到一定的限制。李華平等利用番木瓜環(huán)斑病毒 (Papaya ringspot virus，PRSV) 的復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)化番木瓜獲得抗 PRSV的轉(zhuǎn)基因植株，并且此種抗病番木瓜已經(jīng)獲得生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書[49]。

2.1.3 病毒運(yùn)動(dòng)蛋白介導(dǎo)的策略

植物病毒侵染植物后在體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)方式主要有兩種，一是通過(guò)胞間連絲在細(xì)胞之間的移動(dòng)，二是通過(guò)植物維管組織進(jìn)行的系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。病毒在細(xì)胞間的移動(dòng)是一個(gè)主動(dòng)的過(guò)程，需要病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白 (Movement protein, MP) 的參與。N末端3個(gè)氨基酸缺失導(dǎo)致功能缺陷的TMV MP的基因轉(zhuǎn)入煙草后，TMV的侵染受到抑制，癥狀出現(xiàn)延遲[50]。許多病毒的基因組有 1個(gè)三基因重疊區(qū) (Triple gene block, TGB)，編碼3個(gè)不同的運(yùn)動(dòng)蛋白，白三葉草花葉病毒 (White clover mosaic virus，WCIMV) 為馬鈴薯X病毒屬的病毒，其運(yùn)動(dòng)蛋白 13a中一段序列在所有具有TGB的病毒中保守，在該保守區(qū)將13a蛋白突變獲得的突變體轉(zhuǎn)基因后不僅抗 WCIMV多個(gè)株系，而且抗同病毒屬的馬鈴薯病毒 X(Potato virus X，PVX) 和水仙花葉病毒(Narcissus mosaic virus)，甚至抗香石竹潛病毒組的馬鈴薯病毒S (Potato virus S)[51]。利用MP介導(dǎo)的病毒抗性策略常獲得較廣泛的病毒抗性，目前大多應(yīng)用于馬鈴薯和番茄這兩種作物上。

2.1.4 其他病毒蛋白介導(dǎo)的抗性策略

植物抗病毒基因工程往往需要以病毒外殼蛋白/復(fù)制酶/運(yùn)動(dòng)蛋白及病毒基因組作為靶向[52]。除此之外，人們還利用病毒的其他蛋白轉(zhuǎn)基因獲得病毒抗性。雙生病毒 (Geminiviruses)是DNA病毒，其復(fù)制不同于RNA病毒，主要是以滾環(huán)復(fù)制的方式進(jìn)行復(fù)制[53]。雙生病毒編碼的復(fù)制起始蛋白 (Replication initiation protein, Rep) 具有核酸內(nèi)切酶和連接酶活性，是雙生病毒復(fù)制過(guò)程中的關(guān)鍵因子。研究報(bào)道部分雙生病毒 Rep全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)化的植株對(duì)相應(yīng)的病毒產(chǎn)生抗性，這些病毒包括TYLCV[54]，棉花曲葉病毒 (Cotton leaf curl virus, CLCuV)[55]，臺(tái)灣番茄曲葉病毒 (Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTWV)[56]等。

除了雙生病毒 Rep之外，還有利用煙草脈斑駁病毒 (Tobacco vein mottling virus, TVMV)NIa蛋白酶[57]，馬鈴薯病毒Y (Potato virus Y, PVY)編碼的P1蛋白[58-59]等都能產(chǎn)生病毒抗性。

2.1.5 衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗性策略

某些植物病毒有衛(wèi)星RNA (Satellite RNA，satRNA)。衛(wèi)星 RNA是一類依賴于輔助病毒才能復(fù)制的低分子量RNA，它不能編碼外殼蛋白，只裝配于輔助病毒的外殼蛋白中，其復(fù)制、運(yùn)動(dòng)必須依靠輔助病毒進(jìn)行[60]。satRNA及輔助病毒在同一植物內(nèi)的共同存在導(dǎo)致兩種截然不同的結(jié)果，或加重癥狀，或抑制輔助病毒的復(fù)制。satRNA抑制病毒復(fù)制的功能被用于植物病毒抗性研究中。20世紀(jì)世紀(jì)80年代初，我國(guó)田波院士研究組[61]首次在國(guó)際上開(kāi)展了利用 satRNA防治病毒病害的研究工作，結(jié)果表明黃瓜花葉病毒 (CMV) satRNA作為生物防治因子能有效地防治由強(qiáng)毒株系 CMV引起的嚴(yán)重病害。1986年 Baulcombe等[62]首次成功地將 CMV的satRNA導(dǎo)入煙草，接種 CMV后，植株體內(nèi)satRNA增加，CMV基因組RNA水平大幅下降，植株不表現(xiàn)癥狀。后來(lái)類似抗性在矮牽牛和辣椒中報(bào)道[63-64]。1992年田波院士研究組報(bào)道，將表達(dá)CMV的satRNA和CP嵌合蛋白的序列轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗性效率[65]。

一般認(rèn)為 satRNA介導(dǎo)的病毒抗性的機(jī)理是 satRNA與病毒基因組 RNA 爭(zhēng)奪病毒復(fù)制酶位置，最終以數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)抑制了病毒基因組的復(fù)制。但是最近研究報(bào)道，這種抗性中還會(huì)存在RNA沉默途徑[66-67]。衛(wèi)星 RNA 介導(dǎo)的抗性只需很低的表達(dá)，就能使植株獲得高抗作用，而且這種抗性并不產(chǎn)生特異蛋白，這樣提高了轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性等優(yōu)點(diǎn)。但是也存在一些缺點(diǎn)：含有衛(wèi)星RNA的病毒種類少，應(yīng)用范圍不廣。另外衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)基因植株只在農(nóng)作物生長(zhǎng)的晚期抗病，對(duì)早期的初侵染沒(méi)有抗性。BaMV的衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)基因的煙草和擬南芥也有很強(qiáng)的抗性[68]。

2.1.6 核酶介導(dǎo)抗性策略

20世紀(jì)80年代初，Cech等[69]研究原生動(dòng)物四膜蟲rRNA時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)RNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的Ⅰ型內(nèi)含子剪切和外顯子拼接過(guò)程可在無(wú)任何蛋白質(zhì)存在的情況下發(fā)生，證明了RNA具有催化功能。后來(lái)這種RNA被稱為核酶[70]。核酶是一類具有特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)、能特異性催化切割自身以及其他RNA分子的小分子RNA。

根據(jù)核酶的功能人們預(yù)測(cè)了當(dāng)核酶序列嵌入到病毒RNA互補(bǔ)序列中時(shí)，核酶能夠序列特異性地降解病毒RNA從而抑制病毒。有關(guān)研究報(bào)道，利用核酶能控制病毒，即依據(jù)已知的病毒基因組的特定區(qū)域序列設(shè)計(jì)核酶序列，使它能特異識(shí)別切割病毒的特定區(qū)域，從而切斷病毒基因組，破壞其生物功能。在植物抗病毒方面，Kwon等[71]成功設(shè)計(jì)能切割CMV RNA1和RNA2的核酶后在煙草體內(nèi)表達(dá)獲得對(duì)CMV的抗性。此外，Yang等[72]用能切割馬鈴薯紡綞塊莖類病毒 (Potato spindle tuber viroid，PSTV)的核酶基因，并轉(zhuǎn)化馬鈴薯后成功地控制了PSTV感染。Huttner等[73]報(bào)道，通過(guò)多核酶序列同時(shí)靶向WMV和ZYMV病毒，提供新的方法。核酶基因介導(dǎo)的抗性雖已取得一定的成效，但仍然存在核酶的切割效率低、表達(dá)量不高、穩(wěn)定性差和依賴高濃度的表達(dá)量等問(wèn)題。

2.1.7 RNA沉默介導(dǎo)的策略

正義RNA介導(dǎo)的策略：NaPoli等[74]將與成花色素合成有關(guān)的CHS基因轉(zhuǎn)入矮牽牛，期望獲得花色加深的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果原本開(kāi)紫花的矮牽牛不但花色沒(méi)有加深反而出現(xiàn)了白花。研究表明導(dǎo)入的CHS基因與同源的內(nèi)源CHS基因的mRNA水平同時(shí)降低，稱為共抑制或正義RNA介導(dǎo)的基因沉默。當(dāng)外源基因在植物中高效表達(dá)或受到病毒侵染時(shí)在植物中積累大量病毒RNA并達(dá)到一定閾值時(shí)會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的一種監(jiān)視機(jī)制，用以排除過(guò)量的 RNA[75]。 后來(lái)知道這種監(jiān)視機(jī)制是RNA沉默。通過(guò)表達(dá)病毒正義 RNA片段有時(shí)可以獲得抗病毒植物，如：Dougherty等[76]將 Tobacco etch virus (TEV) 的一段不能編碼病毒外殼蛋白的病毒基因序列轉(zhuǎn)化煙草過(guò)量表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生對(duì)TEV的抗性。最近研究報(bào)道利用類似的方法也能夠得到對(duì)Papaya ringspot virus (PRSV)[77-78]等其他許多病毒抗性的植物。

反義RNA介導(dǎo)的策略：反義RNA是一類與mRNA互補(bǔ)配對(duì)的單鏈RNA，它能通過(guò)與靶向mRNA互補(bǔ)配對(duì)從而產(chǎn)生相應(yīng)的dsRNA或降解目的mRNA來(lái)抑制目的基因表達(dá)。Bird等[79]首次利用這門技術(shù)，成功抑制了番茄類胡蘿卜素合成。從此該技術(shù)開(kāi)始運(yùn)用于植物抗病毒領(lǐng)域，至今已在許多中植物中獲得成功。Day等[80]將TGMV (Tomato golden mosaic virus) 的AL1基因的反義 RNA轉(zhuǎn)入煙草后煙草會(huì)產(chǎn)生對(duì)TGMV的抗性。此后人們通過(guò)這種方法成功地抑制了MYMV (Mungbean yellow mosaic virus)[81]、ACMV (African cassava mosaic virus)[82]、PVY[83]等對(duì)植物的侵染。

反向重復(fù)序列介導(dǎo)的策略：1998年Waterhouse等[84]首次報(bào)道，將正義和反義的GUS基因序列相互串聯(lián)重組構(gòu)成的反向重復(fù)(Inverted repeat，IR) 序列轉(zhuǎn)入水稻 (轉(zhuǎn)GUS基因的植物) 后產(chǎn)生 dsRNA，使體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的GUS基因沉默。人們也通過(guò)此種方式將病毒蛋白編碼的基因進(jìn)行沉默達(dá)到控制病毒的目的。Tougou等[85]報(bào)道，Soybean dwarf virus (SDV)的外殼蛋白 (CP) 基因通過(guò) IR介導(dǎo) RNA沉默方法對(duì)相應(yīng)的病毒進(jìn)行控制。周雪平研究組將TMV運(yùn)動(dòng)蛋白基因和CMV復(fù)制酶基因片段融合的反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)化煙草獲得對(duì) TMV和CMV抗性[86]。與正義和反義RNA介導(dǎo)的抗性策略相比，IR介導(dǎo)的抗性策略至少具有兩種優(yōu)勢(shì)：一是由于 IR序列的轉(zhuǎn)錄不依賴于 RdRp(RNA dependent RNA polymerase)[87]，抗病毒效率高[88-89]；二是通過(guò)一種重組序列能夠防御多種植物病毒。最近的研究顯示，將來(lái)自于 3種不同的大豆病毒的反向重復(fù)序列重組導(dǎo)入大豆后，這種轉(zhuǎn)基因大豆能夠抗御 AIMV、BPMV和SMV等多種病毒[90]。

miRNA介導(dǎo)的植物病毒策略：miRNA(MicroRNAs) 是最早在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegance[91]中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA，其大小長(zhǎng)約20?25個(gè)核苷酸。miRNA在序列同源性基礎(chǔ)上與相應(yīng)的mRNA特異結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等方面起重要作 用[92-93]。Niu等[94]首次報(bào)道人工改造的miRNA在擬南芥體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)后能夠跟 TYMV (Turnip yellow mosaic virus) 和TuMV病毒的HC-Pro基因轉(zhuǎn)錄的RNA結(jié)合使其沉默，從而抑制病毒產(chǎn)生抗性。Ai等[95]報(bào)道在煙草中利用人工 miRNA可以有效地沉默 PVX病毒的 HcPro基因和 PVY 病毒的TGB1/p25基因從而抑制病毒感染。Zhang等[96]也利用類似的方法有效地抑制 CMV病毒對(duì)番茄的感染。方榮祥和郭惠珊研究組用此方法利用針對(duì)CMV mRNA的人工miRNA在煙草體內(nèi)取得對(duì)CMV的抗性[97-98]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，病毒會(huì)通過(guò)在靶向位點(diǎn)突變來(lái)降低人工miRNA和病毒mRNA的結(jié)合，逃避人工miRNA的降解，從而導(dǎo)致植物病毒抗性喪失[99-100]。所以為了解決這個(gè)問(wèn)題人們靶向病毒基因的不同保守區(qū)構(gòu)建了多種人工miRNA的載體。但這種措施只有對(duì)部分病毒很有效[97]，這可能是由于靶向mRNA的結(jié)構(gòu)不同時(shí)人工miRNA的有效性也不同。

2.2 寄主基因介導(dǎo)的抗性

2.2.1 顯性R基因介導(dǎo)的策略

目前已克隆多個(gè)抗病毒的 R基因，人們利用植物 R基因來(lái)控制病毒。R基因介導(dǎo)的抗性策略中最典型的例子是煙草 N基因轉(zhuǎn)入番茄，轉(zhuǎn)基因的番茄有效抵抗 TMV[101]。此外馬鈴薯Rx抗PVX，轉(zhuǎn)化煙草后仍對(duì)Potexviruses有抗性[102]，番茄 Tm-22基因抗 ToMV和 TMV，轉(zhuǎn)化煙草對(duì)TMV和ToMV也有相同的抗性[103]等。多數(shù) R基因的抗性不僅具有特異性，而且有可能隨著病菌群體組成的變化和快速進(jìn)化而喪失。在植物 R基因的利用上可以從以下幾方面考慮：1) 根據(jù)已有的R基因結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)新的基因；2) 進(jìn)行異源表達(dá)；3) 可以向一株植物中導(dǎo)入多個(gè)R基因。在同一品種中導(dǎo)入多個(gè)R基因或過(guò)表達(dá)一個(gè) R基因可能使植物可以對(duì)抗多種病原且抗性持久。

2.2.2 隱性R基因介導(dǎo)的策略

植物易感基因能夠編碼病毒侵入所必需的蛋白，幫助病毒侵染。但是它的等位基因突變時(shí)不但不能幫助病原體入侵而且會(huì)使宿主形成病毒抗性，即隱性抗性。至今許多隱性抗性基因 (隱性R基因) 已被克隆，大部分編碼與真核翻譯起始復(fù)合體 (Eukaryotic translation initiation complex) 相關(guān)的蛋白。真核翻譯起始因子 (Eukaryotic translation initiation factors,eIFs)，尤其eIF4E和eIF4G蛋白家族是部分RNA病毒 (例如potyviruses) 侵染的決定因子[104-106]。通過(guò)表達(dá)突變的與病毒蛋白不能互作的植物蛋白可以使植物抗病毒，如：辣椒 pvr12基因(eIF4E基因的等位基因) 在馬鈴薯過(guò)量表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株能夠抵抗多種PVY病毒[107]。

通過(guò)沉默eIFs也可以產(chǎn)生病毒抗性。如：李痘病毒 (Plum pox virus, PPV) 侵入李子Prunus domestica植物需要eIF(iso)4E (eIF4E的異構(gòu)體) 的協(xié)助，用 RNA沉默技術(shù)設(shè)計(jì)靶向eIF(iso)4E時(shí)，李子對(duì)PPV產(chǎn)生抗性，但是eIF4E基因沉默的植株不能產(chǎn)生對(duì)PPV的抗性，說(shuō)明potyvirus侵入宿主時(shí)需要跟eIFs異構(gòu)體的特異性互作[108]。

2.2.3 其他寄主蛋白介導(dǎo)的抗性策略

參與植物防御反應(yīng)的主要有乙烯應(yīng)答元件結(jié)合因子 (Ethylene response factors，ERF)、MYB、WRKY、bZIP (Basic leucine zipper) 家族和 homeodomain蛋白。過(guò)表達(dá)一些含ERF元件的基因可以使植物顯示對(duì)病毒的抗性，如抗煙草花葉病毒組 (Tobamoviruses) 和 PMMoV[109-112]。許多編碼防御反應(yīng)相關(guān)蛋白的基因可以使植物對(duì)病毒產(chǎn)生一定抗性。如來(lái)自黃燈籠辣椒編碼類萌蛋白的基因 (CchGLP) 在煙草體內(nèi)過(guò)量表達(dá)后減輕或延遲 Pepper huasteco yellow vein virus(PHYVV) 和 Pepper golden mosaic virus(PepGMV) 的感染[113]。

植物凝集素基因JAX1在煙草體內(nèi)過(guò)量表達(dá)后特異性地抑制potexviruses[114]；編碼RdRp的基因Ty1、Ty3的番茄通過(guò)超甲基化TYLCV的CP基因啟動(dòng)子區(qū)來(lái)抑制TYLCV[115-116]。水稻基因 STV11編碼磺基轉(zhuǎn)移酶，能夠調(diào)節(jié)水楊酸途徑對(duì)Rice stripe virus (RSV) 產(chǎn)生抗性[117]。后二者轉(zhuǎn)化入敏感植物或其他植物極可能可以抗相應(yīng)的雙生病毒或RSV。

2.3 其他來(lái)源的基因介導(dǎo)的抗性策略

2.3.1 核糖體失活蛋白介導(dǎo)的策略

核糖體失活蛋白 (Ribosome-inactivating proteins, rIPs) 是一種N糖苷酶，能夠特異性地水解28S核糖體RNA在A4324處的腺嘌呤糖苷鍵，從而阻止EF2/GTP復(fù)合物與核糖體60S大亞基的結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成。目前用于植物抗病毒基因工程的植物來(lái)源性RIPs有：美洲商陸抗病毒蛋白 (Pokeweed antiviral protein,PAP) 和天花粉蛋白 (Trichosanthin, TCS)。PAP是從美洲商陸 (Phytolacca americanai L.) 植物中分離出的一種堿性蛋白，分子量約30 kDa，屬于廣譜抗植物病毒蛋白。Lodge等[118]將 pap基因?qū)氲綗煵莺婉R鈴薯后，成功表達(dá)PAP的轉(zhuǎn)基因煙草馬鈴薯都表現(xiàn)出了對(duì)多種病毒的抗性。這種PAP蛋白合成后會(huì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，在正常情況下不會(huì)影響核糖體功能，只是在病毒侵染細(xì)胞后使核糖體失活，從而抑制病毒RNA翻譯。值得注意的是許多植物PAP蛋白是多核苷酸N糖苷酶，不僅能夠水解核糖體上的腺嘌呤糖苷鍵還能夠水解DNA和RNA中的腺嘌呤[119]，在清除病毒基因組方面起到一定作用。據(jù)報(bào)道，C末端缺失的PAP蛋白不能水解宿主細(xì)胞中的核糖體RNA中的腺嘌呤，但是仍能夠抑制病毒感染[120]。

TCS是從藥用植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim.) 塊根中提取出來(lái)的分子量約26 kDa的堿性蛋白。TCS原本作為中草藥天花粉的有效成分應(yīng)用于妊娠引產(chǎn)、治療絨毛膜皮上癌等。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，TCS對(duì)艾滋病毒 (HIV)及乙肝病毒等 7種病毒均有廣譜抗性。Lam等[121]研究發(fā)現(xiàn)，將重組后的TCS轉(zhuǎn)化煙草和菜心，能限制TuMV (Turnip mosaic virus) 侵染煙草后局部壞死斑的形成，并且延遲 TuMV侵染菜心后花葉癥狀的出現(xiàn)。

2.3.2 植物抗體介導(dǎo)的抗性策略

1989年Hiatt等[122]獲得了能夠表達(dá)完整抗體的轉(zhuǎn)基因煙草，這種植物表達(dá)出來(lái)的抗體具有與抗原結(jié)合的活性，開(kāi)創(chuàng)了植物抗體的先河。隨后研究證明，植物能產(chǎn)生從小分子抗體到全抗體等各種工程抗體?？共《镜鞍椎目贵w基因在植物中的表達(dá)，有可能使植物抗病毒。Tavladoraki等[123]在煙草中表達(dá)抗菊芋花斑皺葉病毒 (Artichoke mottled crinkle virus，AMCV)外殼蛋白的單鏈抗體的可變區(qū)片段 (Singlechain variable fragment, scFv)，使轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生了對(duì)AMCV的抗性。在這種抗性策略中，scFv表達(dá)水平和穩(wěn)定性不太理想，轉(zhuǎn)基因植物不能產(chǎn)生較強(qiáng)的抗性，只能延遲病毒感染時(shí)間及降低感染水平，因此當(dāng)時(shí)這種策略不太受歡迎。后來(lái)的研究取得了scFv的穩(wěn)定性表達(dá)[124]，也拓寬了對(duì)靶向蛋白的選擇，除病毒外殼蛋白之外還增加了病毒復(fù)制蛋白[125]和一些非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白[126-127]等作為靶向蛋白。

2.3.3 核酸酶介導(dǎo)的抗性策略

動(dòng)植物細(xì)胞都有識(shí)別PAMPs的能力，并且通過(guò)結(jié)合PRRs激發(fā)免疫反應(yīng)。2′-5′寡聚腺苷酸合成酶 (2′-5′ Oligoadenylates synthesis, OAS)是在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白，在機(jī)體的抗病毒免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到病毒侵染后，機(jī)體產(chǎn)生干擾素，干擾素刺激細(xì)胞產(chǎn)生OAS。OAS只有在dsRNA存在下才具有活性，病毒基因組的dsRNA、RNA病毒復(fù)制、DNA病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程中產(chǎn)生的短暫存在的dsRNA都能夠激活OAS[128]。在被dsRNA激活后，OAS家族中的蛋白將ATP聚合成 pppA(2′p5′A)n (n=1 或 n>1) 寡聚體，進(jìn)而激活潛在的核糖核酸酶 L (RNaseL)，被激活的RNaseL使病毒的mRNA降解，起到抗病毒的作用[129]。

雖然在植物中未發(fā)現(xiàn)OAS/RNase L系統(tǒng)，但是通過(guò)轉(zhuǎn)基因在煙草體內(nèi)引入OAS系統(tǒng)后，轉(zhuǎn)基因煙草在病毒感染后產(chǎn)生類似于 HR的反應(yīng)，植物表現(xiàn)較廣泛的病毒抗性[130-131]。此外，在轉(zhuǎn)基因的煙草中還發(fā)現(xiàn)，TMV感染后 OAS系統(tǒng)能夠激活 SAR[132]。單獨(dú)轉(zhuǎn) OAS基因的轉(zhuǎn)基因植物沒(méi)有表現(xiàn)出病毒抗性，只有與RNase L基因同時(shí)轉(zhuǎn)基因時(shí)才能產(chǎn)生病毒抗性。李大偉研究組[133]將大腸桿菌中編碼特異識(shí)別 dsRNA的核糖核酸內(nèi)切酶基因轉(zhuǎn)化玉米后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)RBSDV (Rice black-streaked dwarf virus)產(chǎn)生抗性。

2.3.4 其他抗性策略

除了上述抗病毒策略之外，人們還發(fā)展其他抗性策略。如：項(xiàng)瑜等[134]構(gòu)建了PVY Nib基因和解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens的 RNase基因 (Barnase) 的融合基因，該融合基因的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)PVY侵染表現(xiàn)局部抗性。其原理是該融合基因編碼的融合蛋白沒(méi)有Barnase活性，但在 PVY侵染后，融合蛋白被病毒蛋白酶加工，有活性的 Barnase被釋放出來(lái)，殺死被病毒侵染的細(xì)胞，使病毒不能進(jìn)一步擴(kuò)散[134]。此外王志華等將來(lái)源于苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒的 p35基因轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)對(duì)TMV產(chǎn)生抗性[135]。

3 展望

基因工程是植物抗病育種工作中十分有效和有用的手段。自1986年人們首次獲得抗病毒工程植株以來(lái)，經(jīng)過(guò)近30年的探索和完善，植物抗病毒基因工程研究不論在深度上還是廣度上都已經(jīng)得到了很大的發(fā)展，相關(guān)技術(shù)和方法不斷發(fā)展和更新?；蚬こ碳夹g(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是可以將人們所感興趣的外源目的基因特異性地導(dǎo)入植物體內(nèi)，使其產(chǎn)生人們需要的表型和特征。一些病毒來(lái)源的抗性策略，尤其是小RNA介導(dǎo)的策略已經(jīng)能使植物產(chǎn)生免疫的抗性[137]，該策略也適用于控制多種植物病毒；植物和其他來(lái)源的基因也可產(chǎn)生強(qiáng)且安全的病毒抗性。此外，一些抗病毒轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)廣泛種植并證明了很好的效果，可以相信抗病毒轉(zhuǎn)基因作物會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。

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