田冬冬, 苑曉燕, 周維, 賈栗, 何俊, 張利軍, 王以美, 趙君, 彭雙清1,,*

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071

?

納米碳黑與重金屬對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的聯(lián)合毒性作用模式評(píng)價(jià)

田冬冬1, 2, 苑曉燕2, 周維2, 賈栗2, 何俊2, 張利軍2, 王以美2, 趙君2, 彭雙清1,2,*

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071

通過(guò)研究空氣顆粒物的代表性組分納米碳黑(nano particle carbon black, NPCB)與重金屬(Pb/Cr/Cd)聯(lián)合染毒對(duì)BEAS-2B細(xì)胞存活率和LDH漏出率的影響，旨在闡明NPCB與重金屬對(duì)細(xì)胞毒性的聯(lián)合作用模式。檢測(cè) NPCB 與重金屬(Pb/Cr/Cd)聯(lián)合染毒24 h后BEAS-2B細(xì)胞存活率(CCK-8法)和LDH漏出率(LDH活性比色法)的變化，采用析因方差分析判斷其是否存在聯(lián)合毒性作用及聯(lián)合作用模式。NPCB與重金屬(Pb/Cr/Cd)聯(lián)合染毒在細(xì)胞存活率和LDH漏出方面存在聯(lián)合作用；與對(duì)照組和單獨(dú)染毒組相比，低劑量Pb(125 μmol·L-1)與NPCB聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)交互作用，對(duì)LDH漏出表現(xiàn)為拮抗作用；高劑量Pb(1 000 μmol ·L-1) 與NPCB聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞存活率表現(xiàn)為協(xié)同作用，對(duì)LDH漏出無(wú)交互作用；Cr和Cd與NPCB聯(lián)合染毒在細(xì)胞存活率方面均表現(xiàn)為協(xié)同作用；低劑量Cr和Cd與NPCB聯(lián)合染毒在LDH漏出方面無(wú)交互作用，高劑量時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用。NPCB與重金屬存在聯(lián)合作用，金屬不同、劑量不同以及評(píng)價(jià)指標(biāo)不同，其聯(lián)合作用模式不盡相同。

納米碳黑；重金屬；鉛；鉻；鎘；聯(lián)合作用；細(xì)胞毒性

空氣顆粒物(particulate matter, PM)是危害我國(guó)居民健康的主要環(huán)境因素之一，其健康效應(yīng)及潛在毒性機(jī)制越來(lái)越受到人們關(guān)注。PM由粒徑不同的顆粒狀物質(zhì)和其吸附的多種化學(xué)物質(zhì)組成[1]，它對(duì)機(jī)體的損害作用一方面是物理刺激作用(如碳顆粒的刺激作用)，另一方面是化學(xué)損害作用(如重金屬、有機(jī)物的毒性作用等)[2]。現(xiàn)有研究表明，不同地區(qū)、不同季節(jié)PM的組分差異較大[3]，因此，往往造成毒理學(xué)研究結(jié)果的可比性較低，難以充分了解PM的毒性效應(yīng)及潛在機(jī)制[4]。而且目前對(duì)于PM毒性效應(yīng)的研究多是針對(duì)PM整體或針對(duì)其單一組分(如金屬或有機(jī)成分等)[1]，很少考慮其主要組分的聯(lián)合毒性作用，選擇 PM中代表性組分進(jìn)行聯(lián)合毒性的研究，對(duì)于闡明PM顆粒物毒性作用機(jī)制和比較不同來(lái)源顆粒物的毒性差異具有重要的理論意義，對(duì)開(kāi)展PM健康危害評(píng)估具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

PM中常見(jiàn)的顆粒狀物質(zhì)包括碳顆粒、飛灰顆粒和礦物顆粒[5]等，其中碳顆粒作為PM的惰性吸附核，具有較大的比表面積以及很強(qiáng)的吸附能力，更易載帶吸附重金屬、酸性氧化物、有機(jī)污染物、細(xì)菌、病毒等有害成分[6]。為此，我們選擇納米碳黑(nano Particle Carbon Black, NPCB)模擬大氣細(xì)顆粒物的惰性核，選擇鉛(Pb)、鉻(Cr)、鎘(Cd)作為顆粒物中重金屬的代表[7]，進(jìn)行NPCB與重金屬的聯(lián)合毒性研究，旨在闡明PM主成分的聯(lián)合作用模式，為PM的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

1. 1. 1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株：

人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B (本實(shí)驗(yàn)室保存)，置于37 ℃、5% CO2(v/v)和飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.1. 2 實(shí)驗(yàn)試劑：

納米碳黑(NPCB, ≤50 nm)、醋酸鉛(PbAc)、氯化鎘(CdCl2)、重鉻酸鉀(K2Cr2O4)購(gòu)自Sigma公司(純度≥99.99%)； DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，4℃保存；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，56 ℃水浴30 min滅活后使用；胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)購(gòu)自Sigma公司，4℃保存；細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(cell counting kit- 8, CCK-8)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；乳酸脫氫酶試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)購(gòu)自杭州碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：

MCo-15AIC CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Sanyo公司；馬爾文激光粒度分析儀購(gòu)自德國(guó)Malvern公司；H-7650透射電子顯微鏡購(gòu)自日本HITACHI公司；MULTISKAN MK3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自CORNING公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 細(xì)胞培養(yǎng)：

將BEAS-2B細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含有10% (v/v)胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2(v/v)和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3 d按1∶3比例傳代1次。

1.2.2 對(duì)NPCB染毒液的表征：

本實(shí)驗(yàn)選用含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基作為NPCB的分散介質(zhì)，將配制好的NPCB染毒液超聲處理30 min使其均勻分布，用馬爾文粒度分析儀測(cè)定NPCB染毒液的粒徑分布和Zeta電位，每個(gè)樣品重復(fù)三次。取10 μL超聲處理后的NPCB染毒液滴加到銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干后電鏡觀察NPCB顆粒的形態(tài)特征。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及劑量選擇：

按照2×2析因設(shè)計(jì)設(shè)立空白對(duì)照組、NPCB單獨(dú)染毒組、重金屬單獨(dú)染毒組及聯(lián)合染毒組，每組設(shè)置3個(gè)平行孔和這3個(gè)給藥本底對(duì)照孔。觀察NPCB和重金屬(Pb/Cd/Cr)單獨(dú)染毒24h后的細(xì)胞存活率，根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果，選擇無(wú)毒性作用劑量作為聯(lián)合作用研究中NPCB的劑量，與無(wú)明顯毒性作用劑量或具有一定毒性作用劑量的重金屬(Pb/Cd/Cr)進(jìn)行聯(lián)合染毒。

1.2. 4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率：

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以細(xì)胞濃度5×104個(gè)·mL-1、每孔100 μL接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h進(jìn)行染毒。染毒24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(OD)值。細(xì)胞活力(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD本底對(duì)照)/(OD對(duì)照組-OD本底對(duì)照)×100%。

1.2.5 LDH漏出率檢測(cè)：

按乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)提供的步驟進(jìn)行。細(xì)胞外活性孔吸光度檢測(cè)：至預(yù)定時(shí)間后，將96孔板用多孔板離心機(jī)400 g離心5 min，分別取各孔的上清液60 μL加入另一新的96孔板中，分別加入30 μL LDH檢測(cè)工作液，混勻后室溫避光孵育30 min，然后在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD胞外值。細(xì)胞內(nèi)活性孔吸光度：盡量吸除剩余96孔板中的上清，加入150 μL用PBS稀釋了10倍的LDH釋放試劑，振蕩混勻，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400 g離心5 min，分別取各孔的上清液60 μL，加入到新的96孔板中，隨即在490 nm波長(zhǎng)處

測(cè)定OD胞內(nèi)值。計(jì)算細(xì)胞LDH漏出率，即細(xì)胞LDH漏出率(%)=(OD胞外-OD對(duì)照)/[(OD胞內(nèi)-OD對(duì)照)+(OD胞外-OD對(duì)照)]×100%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)組間的顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異；用析因設(shè)計(jì)的方差分析[8]進(jìn)行比較，采以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，α<0.05表示存在交互作用，判斷聯(lián)合作用類(lèi)型時(shí)，應(yīng)根據(jù)方差分析結(jié)果，若存在交互作用則通過(guò)二者交互作用的均值圖判斷其聯(lián)合作用的類(lèi)型；交互作用的均值圖法是指：若曲線(xiàn)相互平行，則表示不存在交互作用；若曲線(xiàn)隨著染毒劑量的增大而相互遠(yuǎn)離，可判定聯(lián)合作用為協(xié)同作用；若曲線(xiàn)隨劑量增大而相互靠近，則判定為拮抗[9]。

2 結(jié)果(Results)

2.1 NPCB染毒液的粒度分布、Zeta電位及電鏡下形態(tài)特征：

粒徑檢測(cè)結(jié)果顯示，在5%FBS的DMEM中NPCB粒徑分布在100 nm以下，峰形及分布范圍狹窄，表明NPCB在該體系中分散性較好；Zeta電位結(jié)果表明， NPCB帶有負(fù)電荷，其電位值為-8.55 mV。用電子顯微鏡觀察NPCB顆粒的形態(tài)特征，可見(jiàn)NPCB顆粒呈不規(guī)則顆粒狀，分散較為均勻，其粒徑范圍多在在20～50 nm，僅有少量聚集情況，與激光粒度分析儀檢測(cè)結(jié)果基本吻合。所以本研究選用含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基作為NPCB顆粒的分散介質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 NPCB在含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基中粒徑分布與電鏡下形態(tài)Fig. 1 Particle size distribution and morphology by the TEM of NPCB in DMEM medium containing 5% FBS

2.2 NPCB和重金屬(Pb/Cd/Cr)單獨(dú)染毒24 h后的細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果

為了選擇合適的NPCB與重金屬的劑量進(jìn)行聯(lián)合作用研究，采用CCK-8法對(duì)NPCB、PbAc、CdCl2、K2Cr2O4單獨(dú)染毒24 h的細(xì)胞存活率進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NPCB和三種重金屬的細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)出明顯的劑量—反應(yīng)關(guān)系，隨著染毒劑量的增加，存活率逐漸降低(圖2)。與空白對(duì)照相比，NPCB在32 μg·cm-2時(shí)產(chǎn)生毒性(P<0.05)，PbAc在1 000 μmol·L-1時(shí)產(chǎn)生毒性(P<0.05)，CdCl2在15 μmol·L-1時(shí)產(chǎn)生毒性(P<0.05)，K2Cr2O4在2 μmol·L-1時(shí)產(chǎn)生毒性(P<0.05)。根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果，選擇NPCB: 8 μg·cm-2(無(wú)毒性作用劑量)， PbAc:125 μmol·L-1或1 000 μmol·L-1，CdCl2:10 μmol·L-1或20 μmol·L-1，K2Cr2O4:0.5 μmol·L-1或2 μmol·L-1(即Cr:1 μmol·L-1或4 μmol·L-1) 進(jìn)行聯(lián)合染毒。

2.3 NPCB和重金屬(Pb/Cd/Cr)聯(lián)合染毒24h后的細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組和PbAc單獨(dú)染毒組相比，125 μmol·L-1的PbAc與NPCB聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(P >0.05)(圖3A)；1 000 μmol·L-1PbAc與NPCB聯(lián)合染毒明顯降低了細(xì)胞存活率(P<0.05)(圖3C)。與對(duì)照組和金屬單獨(dú)染毒組相比，K2Cr2O4或CdCl2與NPCB聯(lián)合染毒明顯降低了細(xì)胞存活率(P <0.05)(圖4A、圖4C、圖5A、圖5C)。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，低劑量Pb與NPCB聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)交互作用；高劑量Pb與NPCB存在聯(lián)合作用，由二者交互作用的均值圖可以看出，高劑量Pb與NPCB聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞存活率表現(xiàn)為協(xié)同作用(圖3B、圖3D)；低劑量和高劑量的Cd或Cr與NPCB聯(lián)合染毒在細(xì)胞存活率方面均存在交互作用，其聯(lián)合作用模式均為協(xié)同作用(圖4B、圖4D、圖5B、圖5D)。

2.4 細(xì)胞LDH漏出率檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組和PbAc單獨(dú)染毒組相比，125 μmol·L-1的PbAc與NPCB聯(lián)合染毒明顯降低了LDH漏出率(P<0.05)(圖6A)；1 000 μmol·L-1PbAc與NPCB聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞LDH漏出率無(wú)明顯影響(P>0.05)(圖6C)。與對(duì)照組和金屬單獨(dú)染毒組相比，CdCl2與NPCB聯(lián)合染毒明顯增加LDH漏出率(P<0.05)(圖7A、圖7C)；0.5 μmol·L-1的K2Cr2O4與NPCB聯(lián)合染毒對(duì)LDH漏出率無(wú)明顯影響(圖8A)，2 μmol·L-1的K2Cr2O4與NPCB聯(lián)合染毒明顯增加了LDH漏出率(P<0.05) (圖8C)。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，低劑量Pb與NPCB聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞LDH漏出率存在交互作用，交互作用均值圖顯示二者表現(xiàn)為拮抗作用(圖6B)；高劑量時(shí)二者無(wú)交互作用(圖6D)；低劑量Cd或Cr與NPCB不存在交互作用，高劑量時(shí)均存在交互作用，其聯(lián)合作用模式表現(xiàn)為協(xié)同作用(圖7B、圖7D、圖8B、圖8D)。

圖2 NPCB與重金屬(Pb/Cd/Cr)單獨(dú)染毒24h單獨(dú)染毒細(xì)胞存活率Fig. 2 Effects of exposure to NPCB and meatals on cell viability Values are shown as mean±SD (n=3). *Different from control, P<0.05.

圖3 Pb與NPCB聯(lián)合染毒存活率與聯(lián)合作用模式圖A: NPCB (8 μg·cm-2)和Pb(125 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞存活率B: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Pb (125 μmol·L-1)的細(xì)胞存活率聯(lián)合作用模式圖C: NPCB (8 μg·cm-2)和Pb (1 000 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞存活率D: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Pb (1 000 μmol·L-1)的細(xì)胞存活率聯(lián)合作用模式圖Fig. 3 Effects of combined exposure to NPCB and Pb on cell viabilityA: Cell viability of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Pb (125 μmol·L-1) and their mixture(125 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h. B: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Pb (125 μmol·L-1) on Cell viability. C: Cell viability of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Pb (1 000 μmol·L-1) and their mixture(1 000 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h. D: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Pb (1 000 μmol·L-1) on Cell viability.Values are shown as mean±SD (n=3).* Different from control, # different from NPCB group, a different from metal group, P<0.05

圖4 Cd與NPCB聯(lián)合染毒存活率與聯(lián)合作用模式圖A: NPCB (8 μg·cm-2)和Cd (10 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞存活率B: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Cd (10 μmol·L-1)的細(xì)胞存活率聯(lián)合作用模式圖C: NPCB (8 μg·cm-2)和Cd (20 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞存活率D: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Cd (20 μmol·L-1)的細(xì)胞存活率聯(lián)合作用模式圖Fig. 4 Effects of combined exposure to NPCB and Cd on cell viabilityA:Cell viability of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Cd (10 μmol·L-1) and their mixture (10 μmol·L-1+8 μg·cm-2)for 24 h. B: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Cd (10 μmol·L-1) on Cell viability. C: Cell viability of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Cd (20 μmol·L-1) and their mixture (20 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24 h. D: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Cd (20 μmol·L-1) on Cell viability.Values are shown as mean±SD (n=3).*Different from control, # different from NPCB group, a different from metal group, P<0.05

圖5 Cr與NPCB聯(lián)合染毒存活率與聯(lián)合作用模式A: NPCB (8 μg·cm-2)和Cr(1 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞存活率B: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Cr(1 μmol·L-1)的細(xì)胞存活率聯(lián)合作用模式圖C: NPCB (8 μg·cm-2)和Cr(4 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞存活率D: NPCB (8 μg·cm-2) 和Cr(4 μmol·L-1)的細(xì)胞存活率聯(lián)合作用模式圖Fig. 5 Effects of combined exposure to NPCB and Cr on cell viabilityA:Cell viability of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Cr(1 μmol·L-1) and their mixture(1μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h. B: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Cr(1 μmol·L-1) on Cell viability. C: Cell viability of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Cr(4 μmol·L-1) and their mixture(4 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h.D: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Cr(4 μmol·L-1) on Cell viability.Values are shown as mean ± SD (n=3).*Different from control, # different from NPCB group ,a different from metal group, P<0.05

圖6 Pb與NPCB聯(lián)合染毒LDH漏出率與聯(lián)合作用模式圖A: NPCB (8 μg·cm-2)和Pb(125 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h 細(xì)胞LDH漏出率B: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Pb (125 μmol·L-1)的細(xì)胞LDH漏出率聯(lián)合作用模式圖C: NPCB (8 μg·cm-2)和Pb (1 000 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞LDH漏出率D: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Pb (1 000 μmol·L-1)的細(xì)胞LDH漏出率聯(lián)合作用模式圖Fig. 6 Effects of combined exposure to NPCB and Pb on LDHA: LDH leakage of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Pb (125 μmol·L-1) and their mixture(125 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h. B: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Pb (125 μmol·L-1) on LDH leakage. C: LDH leakage of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Pb (1 000 μmol·L-1) and their mixture (1 000 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h.D: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Pb (1 000 μmol·L-1) on LDH leakage.Values are shown as mean ± SD (n=3).*Different from control, # different from NPCB group, P<0.05

圖7 Cd與NPCB聯(lián)合染毒LDH漏出率與聯(lián)合作用模式圖A: NPCB (8 μg·cm-2)和Cd (10 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞LDH漏出率B: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Cd(10 μmol·L-1)的細(xì)胞LDH漏出率聯(lián)合作用模式圖C: NPCB (8 μg·cm-2)和Cd (20 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞LDH漏出率D: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Cd(20 μmol·L-1)的細(xì)胞LDH漏出率聯(lián)合作用模式圖Fig. 7 Effects of combined exposure to NPCB and Cd on LDHA: LDH leakage of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Cd (10 μmol·L-1) and their mixture (10 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h. B: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Cd (10 μmol·L-1) on LDH leakage. C: LDH leakage of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Cd (20 μmol·L-1) and their mixture (20 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h. D: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Cd (20 μmol·L-1) on LDH leakage.Values are shown as mean ± SD (n=3).*Different from control, # different from NPCB group, a different from metal group, P<0.05

圖8 Cr與NPCB聯(lián)合染毒LDH漏出率與聯(lián)合作用模式圖A: NPCB (8 μg·cm-2)和Cr (1 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞LDH漏出率B: NPCB (8 μg·cm-2) 和 Cr (1 μmol·L-1)的細(xì)胞LDH漏出率聯(lián)合作用模式圖C: NPCB (8 μg·cm-2)和Cr (4 μmol·L-1) 單獨(dú)及聯(lián)合染毒24 h細(xì)胞LDH漏出率D: NPCB (8 μg·cm-2) 和Cr (4 μmol·L-1)的細(xì)胞LDH漏出率聯(lián)合作用模式Fig. 8 EEffects of combined exposure to NPCB and Cr on LDHA: LDH leakage of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Cr (1 μmol·L-1) and their mixture (1μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h. B: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Cr (1 μmol·L-1) on LDH leakage. C: LDH leakage of Beas-2B cells exposed to NPCB (8 μg·cm-2), Cr (4 μmol·L-1) and their mixture (4 μmol·L-1+8 μg·cm-2) for 24h. D: Interaction profile plots of NPCB (8 μg·cm-2) and Cr (4 μmol·L-1) on LDH leakage.Values are shown as mean±SD (n=3).*Different from control, # different from NPCB group ,a different from metal group, P<0.05

表1 NPCB與重金屬(Pb/Cd/Cr)聯(lián)合染毒作用模式

注: “-”表示此毒在此檢測(cè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)無(wú)聯(lián)合作用。

Note: “-”No statistics showed combined effect in this test indicators.

3 討論(Discussion)

碳黑和重金屬是PM的主要組分，本研究通過(guò)對(duì)NPCB和重金屬聯(lián)合染毒對(duì)BEAS-2B細(xì)胞存活率和LDH漏出率的檢測(cè)及其聯(lián)合作用模式的探討，證實(shí)了NPCB與重金屬(Pb/Cd/Cr)聯(lián)合染毒在細(xì)胞存活率及LDH漏出率方面存在聯(lián)合作用，但聯(lián)合作用模式因重金屬種類(lèi)、染毒劑量和檢測(cè)指標(biāo)的不同表現(xiàn)不同。本研究為進(jìn)一步探討聯(lián)合作用機(jī)制和初步闡明顆粒物的復(fù)合毒性提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究選擇無(wú)細(xì)胞毒性作用劑量的NPCB與不同濃度的重金屬聯(lián)合染毒，研究結(jié)果顯示即使無(wú)毒性劑量的納米顆粒的存在也會(huì)對(duì)重金屬的毒性產(chǎn)生明顯影響。作為環(huán)境顆粒物的模擬形式以及顆粒物其他毒性成分的基準(zhǔn)對(duì)照[10]，NPCB的體內(nèi)、外毒性得到了廣泛研究。很多研究都表明，氧化損傷在NPCB的毒性效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]，無(wú)論在體內(nèi)還是體外，NPCB均可誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS)，引起氧化應(yīng)激損傷[10, 12-14]。例如，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肺上皮細(xì)胞中NPCB通過(guò)誘導(dǎo)ROS水平增加而增加了DNA氧化損傷[15]。另有研究表明，可吸入顆粒物誘導(dǎo)的氧化損傷主要由其吸附的金屬元素介導(dǎo)[16-19]。因此，氧化應(yīng)激損傷可能是重金屬與NPCB聯(lián)合作用的靶點(diǎn)。此外，納米顆粒不但具有吸附特性，還具有親細(xì)胞特性[20]，我們推測(cè)，NPCB可能通過(guò)吸附重金屬，并增加其與細(xì)胞的相互作用而增強(qiáng)重金屬的毒性，但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)染毒劑量對(duì)聯(lián)合作用模式具有重要影響。低劑量的Pb與NPCB在存活率上無(wú)聯(lián)合作用，高劑量聯(lián)合表現(xiàn)為協(xié)同作用；在LDH漏出率上，低劑量聯(lián)合表現(xiàn)為拮抗作用，高劑量無(wú)聯(lián)合作用。低劑量的Cd或Cr與NPCB在LDH漏出率上無(wú)聯(lián)合作用，高劑量聯(lián)合表現(xiàn)為協(xié)同作用。由此可見(jiàn)，劑量不同，聯(lián)合作用模式不同，聯(lián)合作用模式的表征非常復(fù)雜，僅用單一劑量去表征兩種物質(zhì)之間的聯(lián)合作用是不夠的[21]，我們?cè)谧雎?lián)合作用模式分析時(shí)要充分考慮不同劑量配比對(duì)結(jié)果的影響。

本研究中，我們采用了評(píng)價(jià)基本細(xì)胞毒性的CCK-8法和LDH活性檢測(cè)法[22]評(píng)價(jià)了重金屬與NPCB的聯(lián)合作用，針對(duì)不同檢測(cè)指標(biāo)，NPCB與重金屬聯(lián)合作用方式有所不同。低劑量Cd或Cr與NPCB聯(lián)合染毒在LDH漏出率上無(wú)聯(lián)合作用，而在存活率上表現(xiàn)為協(xié)同作用。兩種指標(biāo)反映的聯(lián)合作用模式不同，可能與兩種檢測(cè)方法檢測(cè)的生物學(xué)終點(diǎn)不同有關(guān)，我們推測(cè)，以線(xiàn)粒體脫氫酶活性作為檢測(cè)靶點(diǎn)的CCK-8法較細(xì)胞死亡或胞膜受損為靶點(diǎn)的LDH檢測(cè)法更為敏感[22]。

通過(guò)本研究證實(shí)了NPCB與重金屬的聯(lián)合作用模式十分復(fù)雜，提示在今后的聯(lián)合毒性研究中，要考慮染毒劑量和檢測(cè)指標(biāo)對(duì)聯(lián)合作用模式的影響。

[1] Van B D, Hullmann M, Schins R P F. Toxicology of ambient particulate matter [J]. Particle Research, 2012, 101: 165-217

[2] Akhtar U S, Rastogi N, Mcwhinney R D, et al. The combined effects of physicochemical properties of size-fractionated ambient particulate matter on in vitro toxicity in human A549 lung epithelial cells [J]. Toxicology Reports, 2014, 1(1): 145-156

[3] Leung P Y, Wan H T, Billah M B, et al. Chemical and biological characterization of air particulate matter 2.5, collected from five cities in China [J]. Environmental Pollution, 2014, 194(7): 188-195

[4] 劉芳盈, 丁明玉, 王菲菲, 等. 燃煤PM2.5不同組分對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性[J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2011, 24(6): 684-690

[5] Qiu H, Tian L W, Pun V C, et al. Coarse particulate matter associated with increased risk of emergency hospital admissions for pneumonia in Hong Kong [J]. Thorax, 2014, 69(11): 1027-1033

[6] Cao J, Shen Z X, Chow Z C, et al. Winter and summer PM2.5chemical compositions in fourteen Chinese cities [J]. Journal of the Air & Waste Management Association, 2012, 62(10): 1214-1226

[7] Gray D L, Wallace L A, Brinkman M C, et al. Respiratory and cardiovascular effects of metals in ambient particulate matter: A critical review [J]. Reviews of Environmental Contamination & Toxicology, 2015, 234: 135-203

[8] 顧兵, 王心如. 聯(lián)合作用特征的評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2000, 13(1): 55-58

[9] 張蕾, 徐鏡波, 楊麗. 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)在環(huán)境污染物聯(lián)合毒性研究中的應(yīng)用[J]. 干旱環(huán)境監(jiān)測(cè), 2004, 18(1): 20-22

[10] Janssen N A H, Hoek G, Simic-Lawson M, et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10and PM2.5[J]. Environmental Health Perspectives, 2011, 119(12): 1691-1699

[11] Mroz R M, Schins R P, Li H, et al. Nanoparticle-driven DNA damage mimics irradiation-related carcinogenesis pathways [J]. European Respiratory Journal, 2008, 31(2): 241-251

[12] Sayes C M, Reed K L, Warheit D B. Assessing toxicity of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles [J]. Toxicological Sciences, 2007, 97(1): 163-180

[13] Koike E, Kobayashi T. Chemical and biological oxidative effects of carbon black nanoparticles [J]. Chemosphere, 2006, 65(6): 946-951

[14] Valavanidis A, Vlachogianni T, Fiotakis K, et al. Pulmonary oxidative stress, inflammation and cancer: Respirable particulate matter, fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms [J]. International Journal of Environmental Research & Public Health, 2013, 10(9): 3886-3907

[15] Borgie M, Ledoux F, Verdin A, et al. Genotoxic and epigenotoxic effects of fine particulate matter from rural and urban sites in Lebanon on human bronchial epithelial cells [J]. Environmental Research, 2015, 136: 352-362

[16] Flora S J S, Megha M, Ashish M. Heavy metal induced oxidative stress & its possible reversal by chelation therapy [J]. Indian Journal of Medical Research, 2008, 128(4): 501-523

[17] Hong Y C, Hwang S S, Kim J H, et al. Metals in particulate pollutants affect peak expiratory flow of schoolchildren [J]. Environmental Health Perspectives, 2007, 115(3): 430-434

[18] Hartwig A, Schwerdtle T. Interactions by carcinogenic metal compounds with DNA repair processes: toxicological implications [J]. Toxicology Letters, 2002, 127(1-3): 47-54

[19] Sr W J, Wise S S, Little J E. The cytotoxicity and genotoxicity of particulate and soluble hexavalent chromium in human lung cells [J]. Mutation Research/fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2002, 517(1-2): 221-229

[20] Xia T, Li N, Ae N. Potential health impact of nanoparticles [J]. Annual Review of Public Health, 2009, 30: 135-70

[21] Meek M E, Boobis A R, Crofton K M, et al. Risk assessment of combined exposure to multiple chemicals: A WHO/IPCS framework [J]. Regulatory Toxicology & Pharmacology, 2011, 60(2): S1-S14

[22] W?rle-Knirsch J M, Pulskamp K, Krug H F. Oops they did it again! carbon nanotubes hoax scientists in viability assays [J]. Nano Letters, 2006, 6(6): 1261-1268

◆

Evaluation of Combined Effects of NPCB and Heavy Metals on BEAS-2B Cells

Tian Dongdong1,2, Yuan Xiaoyan2, Zhou Wei2, Jia Li2, He Jun2, Zhang Lijun2, Wang Yimei2, Zhao Jun2, Peng Shuangqing1,2,*

1. Guangxi Medical University, Nanning 530021, China 2. Evaluation and Research Center for Toxicology, Institute of Disease Control and Prevention, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Received 13 February 2015 accepted 12 May 2015

NPCB and heavy metals are representative components of airborne particulate matter. In the present study, we investigated the combined effects of NPCB with Pb/Cr/Cd on the viability and LDH leakage of BEAS-2B Cells. After co-exposure to NPCB and heavy metals (Pb/Cr/Cd) for 24 h, cell viability and LDH leakage were detected by Cell Counting Kit-8(CCK-8) and LDH Cytotoxicity Assay Kit, respectively. The types of combined effects were determined by factorial design analysis of combined effects on cell viability and LDH leakage. Compared to theNPCB and heavy metals (Pb/Cr/Cd) had control group /NPCB group and the Pb group, co-exposure to low dose of Pb (125 μmol·L-1) and NPCB had no interaction on cell viability, but showed antagonistic joint action on LDH leakage; co-exposure to high dose of Pb (1 000 μmol·L-1) and NPCB showed a synergistic effect on cell viability, but had no interaction on LDH leakage. Co-exposure to Cr/Cd and NPCB showed a synergistic effect on cell viability; whereas co-exposure to low dose of Cr/Cd and NPCB showed no interaction on LDH leakage, and co-exposure to high dose of Cr/Cd and NPCB showed a synergistic effect on LDH leakage. NPCB and heavy metals had combined effects on cytotoxicity. The modes of combined effects were different to different metals, different doses and different toxic endpoints.

NPCB; heavy metals; Pb; Cd; Cr; combined toxicity effects; cytotoxicity

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2011CB503803)；毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2014開(kāi)放課題 (2014HJDL01)

田冬冬(1988-)，女，碩士，研究方向：環(huán)境毒理學(xué)，E-mail: tddwinter_1988@126.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: pengsq@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897-20150213001

2015-02-13 錄用日期：2015-05-12

1673-5897(2015)3-288-10

X171.5

A

彭雙清(1962-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)與毒理學(xué)。

田冬冬, 苑曉燕, 周維，等. 納米碳黑與重金屬對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的聯(lián)合毒性作用模式評(píng)價(jià)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(3): 288-297

Tian D D, Yuan X Y, Zhou W, et al. Evaluation of combined effects of NPCB and heavy metals on BEAS-2B cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 288-297 (in Chinese)