崔靜, 楊生森, 魯植艷, 楊維財， 田建英,*

1. 寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，銀川 750004 2. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院骨科，銀川 750004 3. 武漢大學中南醫(yī)院放射科，武漢 430072

?

α7nAChR在氯化甲基汞神經(jīng)毒性中的作用

崔靜1, 楊生森2, 魯植艷3, 楊維財1， 田建英1,*

1. 寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，銀川 750004 2. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院骨科，銀川 750004 3. 武漢大學中南醫(yī)院放射科，武漢 430072

為探討環(huán)境染污染物氯化甲基汞(methylmercury chloride，MeHgCl)的神經(jīng)毒性作用機制，采用MTT、免疫細胞熒光、dot Blot、qRT-PCR等實驗技術(shù)檢測MeHgCl對PC12細胞活性及其α7亞型煙堿型膽堿能受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)蛋白和mRNA表達水平的影響。結(jié)果顯示MeHgCl抑制PC12細胞活性，顯著降低α7nAChR的蛋白和mRNA的表達水平，呈濃度依賴性。上述結(jié)果表明,MeHgCl對神經(jīng)細胞毒性作用可能與抑制α7nAChR表達有關(guān)。

氯化甲基汞；α7nAChR；記憶；神經(jīng)毒性

汞是繼砷和鉛之后排名第三的環(huán)境毒物。一般人群汞暴露主要源于淡水魚和深海魚、牙科用汞合金材料和含硫柳汞的疫苗等。甲基汞是汞的毒性最強的形式，吸收后分布于人體所有器官和組織，包括腦和胎盤。體內(nèi)外研究表明，汞具有顯著的神經(jīng)毒性，可以引起神經(jīng)元丟失，破壞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能完整性，造成記憶和認知功能障礙[1]，但其神經(jīng)細胞毒性機制尚不清楚。

煙堿型膽堿能受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) 廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，α7 nAChR是其中較為特殊的亞型，能激活神經(jīng)元上的α7nAChR可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)釋放[2]、改變突觸可塑性[3]、幫助神經(jīng)元抵御內(nèi)外因素的損傷，維持正常的生理功能狀態(tài)，對維持記憶和認知功能的十分重要。研究表明，α7 nAChR對改善阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)和精神分裂癥患者的認知障礙有顯著作用[4]。本研究擬探討α7nAChR在汞的神經(jīng)毒性作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12細胞(上海神經(jīng)科學研究所), 噻唑藍 (MTT)、二甲基亞砜 (DMSO) (Sigma公司)，MeHgCl (Dr. Ehrenstorfer公司，純度97%)α7nAchR兔多克隆抗體 (Santa Cruz公司)，胰蛋白酶、PBS、DMEM/F12、青霉素/鏈霉素(Hyclone公司)，新生牛血清(四季青公司)，TRITC(中杉金橋)，Hoechst 33342(碧云天公司)。全蛋白提取試劑盒和BSA蛋白定量試劑盒(南京凱基公司)，總RNA提取試劑盒(Omega公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher公司)，熒光定量試劑盒(Takara公司)。

iMark酶標儀(BIO-RAD，美國)、NanoDrop 2000c 分光光度計(Thermo Fisher，美國)、CFX96實時定量PCR儀(BIO-RAD，美國)，BX51熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組

觀察MeHgCl對PC12細胞活性的影響，隨機分為對照組(0 μmol·L-1)MeHgCl組，1～4 μmol·L-1MeHgCl組，并觀察MeHgCl處理后對PC12細胞分子水平改變。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

PC12細胞于含15%新生牛血清、1%青霉素/鏈霉素的 DMEM/F12 1:1中培養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行孵育。取對數(shù)生長期細胞分別接種于 96 孔板和24孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.3 MTT法檢測PC12細胞活性

上述各組細胞在96孔板培養(yǎng)24 h后，移除培養(yǎng)基，每孔加入90 mL DMEM/F12培養(yǎng)基和10 μL MTT (5 mg·mL-1)，繼續(xù)孵育4 h, 加入 150 μL的DMSO，振搖10 min，于酶標儀讀取OD值,檢測波長490 nm, 分析。

1.2.4 免疫細胞熒光法檢測α7nAchR亞單位蛋白水平

取各組細胞以 4%的多聚甲醛固定, PBS振洗, 10%山羊血清室溫封閉1 h, 加一抗 (1∶100稀釋)，4 ℃孵育48 h; 移除一抗，加TRITC二抗, 37 ℃、1 h, 加Hoechst 33342，37 ℃、10 min。PBS洗3次，每次5 min，抗淬滅封片劑封片。

1.2.5 BCA蛋白檢測法進行蛋白定量

全蛋白提取試劑盒制備蛋白樣品，取不同濃度BSA蛋白標準品及待測樣品分別加入96孔板，37 ℃溫箱孵育30 min，于酶標儀570 nm檢測波長下測量OD值。根據(jù)標準品OD值繪制標準曲線，計算蛋白樣品含量。

1.2.6 Dot-Blot檢測α7nAChR蛋白水平

取定量后的等量蛋白樣品點膜。TBST洗膜，脫脂奶粉封閉，將膜浸入一抗(1：200), 4 ℃孵育48 h，洗膜3次，加入HRP標記的二抗，DAB顯色10 min，自然晾干，掃描后進行灰度分析。

1.2.7 qRT-PCR檢測α7nAChR mRNA水平

總RNA提取試劑盒提取總mRNA，測A值計算RNA純度。逆轉(zhuǎn)錄后，取cDNA做qPCR，qPCR所用引物(見表1)，由上海生工生物技術(shù)有限公司設計并合成。反應條件為：qPCR反應條件為預變性95 ℃ 30 sec，95 ℃ 5 sec, 60 ℃ 30 sec，39個循環(huán)。每組設3個復孔，以GAPDH基因為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCt的形式表達，Ct為循環(huán)閾值。

表1 基因引物設計

1.2.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 MTT法檢測MeHgCl對PC12細胞活性的影響

MTT分析結(jié)果表明，與對照組比較，MeHgCl處理組PC12細胞活性隨濃度遞增而降低，在MeHgCl 1 μmol·L-1組(0.4927±0.0204) PC12細胞活性與對照組相比變化不明顯94.33%(P>0.05)，在2～4 μmol·L-1組細胞活性明顯降低，細胞活性分別為對照組的87.57% (P<0.01) 和66.72% 、25.71% (P<0.001)(見圖1)。

2.2 免疫熒光細胞化學法測定MeHgCl對PC12細胞α7 nAchR蛋白表達的影響

對照組細胞細胞輪廓清楚，胞體呈梭形，突起細長；MeHgCl處理組隨MeHgCl濃度增高，α7 nAchR的陽性細胞數(shù)目逐漸減少，細胞突起縮短，高濃度組甚至斷裂或消失，胞體變圓，細胞輪廓不清。MeHgCl組α7 nAchR陽性細胞熒光強度明顯減弱，平均光密度(average optical density, AOD)減小(P<0.05)(見表2，圖2)。

圖1 不同濃度MeHgCl對PC12細胞活性的影響Fig. 1 Effect of MeHgCl on cell viability(n=5,**P<0.01,***P<0.001vs control group)

圖2 不同濃度MeHgCl對PC12細胞α7nAChR 陽性表達的影響注：A. 對照組(0 μmol·L-1)、B. MeHgCl 1 μmol·L-1組、C. MeHgCl 2 μmol·L-1、D. MeHgCl3μmol·L-1組，標尺：50 μmFig. 2 Effect of MeHgCl on positive expression of α7nAChR in PC12 cellsNote: A. control group (0 μmol·L-1), B. MeHgCl 1 μmol·L-1, C. MeHgCl 2 μmol·L-1, D. MeHgCl3μmol·L-1, bar: 50 μm

表2 不同濃度MeHgCl對PC12細胞α7nAChR 陽性表達的影響

Table 2 Effect of MeHgCl on positive expression of α7nAChR(n=4,x±s)

表2 不同濃度MeHgCl對PC12細胞α7nAChR 陽性表達的影響

MeHgCl/(μmol·L-1)AOD(IOD/area)00．04173±0．0040410．03998±0．0007420．03614±0．00319?30．03380±0．00521?

注：*P<0.05與對照組(0 μmol·L-1)比較，IOD是積分光密度。

Note:*P<0.05vscontrol group (0 μmol·L-1), IOD is integration of optical density.

2.3 Dot-Blot測定MeHgCl對PC12細胞α7 nAchR蛋白水平的影響

Dot-Blot斑點試驗觀察各組PC12細胞α7 nAchR蛋白的變化。結(jié)果表明，與對照組比較， MeHgCl不同濃度組PC12細胞α7 nAchR蛋白水平均有明顯下降，并呈濃度依賴性遞減(見表3，圖3)。

表3 不同濃度MeHgCl對PC12細胞α7nAChR蛋白水平的影響

MeHgCl/(μmol·L-1) α7nAChR00．2228±0．018210．1652±0．0066???20．1217±0．0035???30．1060±0．0071???

注：***P <0.001與對照組(0 μmol·L-1)比較

Note:***P <0.001vscontrol group (0 μmol·L-1)

圖3 不同濃度MeHgCl對PC12細胞α7nAChR蛋白表達的影響(μmol·L-1)Fig. 3 Effect of MeHgCl on protein level of α7nAChR(n=3,***P <0.001vs control group)

2.4 qRT-PCR測定MeHgCl對PC12細胞α7 nAchR mRNA水平的影響(2-ΔΔCt)

qRT-PCR方法，觀察α7 nAchR mRNA水平的變化。結(jié)果顯示，與正常對照組比較，MeHgCl (1～3 μmol·L-1)對PC12細胞α7 nAchR mRNA水平均有顯著抑制作用 (P <0.001) (見圖4)。

圖4 不同濃度MeHgCl對PC12細胞α7nAChR mRNA水平的影響Fig. 4 Effect of MeHgCl on mRNA level of α7nAChR(n=3,***P<0.001vs control group)

3 討論(Discussion)

有機汞在環(huán)境中具有分布廣、生物蓄積性高和神經(jīng)毒性強等特征。

不論是動物，還是人體，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是有機汞毒性最敏感的部位。甲基汞容易跨過血腦屏障，誘導氧化應激和細胞毒性[5]，靶向殺死神經(jīng)系統(tǒng)中視覺皮層、小腦、背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)元。環(huán)境污染水平的甲基汞暴露誘發(fā)海馬區(qū)神經(jīng)干細胞凋亡，造成不可修復的細胞缺陷，導致青春期海馬依賴性功能障礙[1]。定量蛋白質(zhì)組學分析表明汞通過誘導氧化應激，細胞骨架組裝功能障礙和代謝障礙引起神經(jīng)毒性[6]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，pmol·L-1濃度的MeHgCl可致海馬干細胞活性降低，且抑制其向神經(jīng)元分化[7]。本研究MTT的實驗結(jié)果顯示，隨MeHgCl濃度增高，PC12細胞線粒體還原酶活性逐漸下降，細胞存活率降低，存在濃度依賴性，表明甲基汞通過誘導自由基產(chǎn)生、氧化應激，導致神經(jīng)細胞線粒體活性的下降，細胞死亡。神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，是有機汞引起神經(jīng)功能障礙的重要原因。

α7nAChR在海馬和皮層神經(jīng)元中高表達[8]，是膽堿能神經(jīng)元表達nAChR的主要亞型之一。配體門控型離子通道α7nAChR對Ca2+通透性極強，維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性[2]，改變突觸信號傳遞效率[9-10]。α7nAChR的缺損是膽堿能神經(jīng)元退化的關(guān)鍵因素。海馬是人和嚙齒類動物學習和記憶功能形成的基礎(chǔ)。α7nAChR膽堿能神經(jīng)元丟失是AD等神經(jīng)退行性疾病認知功能障礙的重要病理基礎(chǔ)[11]。AD患者皮質(zhì)和海馬α7nAChR表達水平顯著低于一般人群，激活α7nAChR可以保護膽堿能神經(jīng)元，改善記憶和認知[4]。另外，激活α7nAChR抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞和小鼠原代皮層神經(jīng)元的自噬活動，降低Aβ的神經(jīng)毒性[12]。我們前期實驗結(jié)果顯示當歸芍藥散腦脊液通過α7nAChR降低PC12細胞氧化應激損傷和細胞凋亡[13-14]。本實驗結(jié)果表明，低濃度1 μmol·L-1MeHgCl處理24 h無明顯細胞活性變化，但α7nAChR mRNA和蛋白水平已顯著低于正常對照組，顯示α7nAChR在基因和蛋白水平對MeHgCl的毒性均十分敏感，表明α7nAChR生物合成降低先于細胞凋亡。

國際上研究表明α7nAChR亞型在認知功能缺失以及AD的病理過程中有舉足輕重的作用。本研究證實α7nAChR亞型介導MeHgCl誘發(fā)的神經(jīng)細胞毒性作用。鑒于α7nAChR在認知功能、感覺處理、情緒調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護作用中起關(guān)鍵作用。MeHgCl抑制中樞神經(jīng)元α7nAChR的表達可能是其導致記憶和認知功能障礙的病理機制之一。

[1] Sokolowski K, Obiorah M, Robinson K, et al. Neural stem cell apoptosis after low-methylmercury exposures in postnatal hippocampus produce persistent cell loss and adolescent memory deficits [J]. Developmental Neurobiology, 2013, 73(12): 936-949

[2] Komal P, Gudavicius G, Nelson C J, et al. T-cell receptor activation decreases excitability of cortical interneurons by inhibiting α7 nicotinic receptors [J]. The Journal of Neuroscience, 2014, 34(1): 22-35

[3] Nordman J C, Philips W S, Kodama N, et al. Axon targeting of the alpha 7 nicotinic receptor in developing hippocampal neurons by Gprin1 regulates growth [J]. Journal of Neurochemistry, 2014, 129(4): 649-662

[4] Russo P, Del Bufalo A, Frustaci A, et al. Beyond acetylcholinesterase inhibitors for treating Alzheimer's disease: α7-nAChR agonists in human clinical trials [J]. Current Pharmaceutical Design, 2014, 20(38): 6014-6021.

[5] Olivieri G, Brack C, Müller-Spahn F, et al. Mercury induces cell cytotoxicity and oxidative stress and increases beta-amyloid secretion and tau phosphorylation in SHSY5Y neuroblastoma cells [J]. Journal of Neurochemistry, 2000, 74(1): 231-236

[6] Wang Y, Wang D, Lin L, et al. Quantitative proteomic analysis reveals proteins involved in the neurotoxicity of marine medaka Oryzias melastigma chronically exposed to inorganic mercury [J]. Chemosphere, 2015, 119: 1126-1133

[7] 陳維維, 金國華, 張新華, 等. 枸杞多糖對氯化甲基汞誘導海馬神經(jīng)干細胞損傷的保護作用[J]. 解剖學報, 2012, 43(4): 445-450

[8] Conejero-Goldberg C, Davies P, Ulloa L. Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor: A link between inflammation and neurodegeneration [J]. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 2008, 32(4): 693-706

[9] Cheng Q, Yakel J L. Presynaptic α7 nicotinic acetylcholine receptors enhance hippocampal mossy fiber glutamatergic transmission via PKA activation [J]. The Journal of Neuroscience, 2014, 34(1): 124-133

[10] Zhong C, Talmage D A, Role L W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons [J]. Public Library of Science one, 2013, 8(12): e82719

[11] Tong L M, Fong H, Huang Y. Stem cell therapy for Alzheimer's disease and related disorders: Current status and future perspectives [J]. Experimental and Molecular Medicine, 2015, doi:10.1038

[12] Hung S Y, Huang W P, Liou H C, et al. LC3 overexpression reduces Aβ neurotoxicity through increasing α7nAchR expression and autophagic activity in neurons and mice [J]. Neuropharmacology, 2015, 93C: 243-251

[13] 馬麗君, 馬科, 李霞, 等. 含當歸芍藥散簡方腦脊液對神經(jīng)細胞的保護作用[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012, 18(9): 165-168

[14] 田建英, 馬鋒, 馬偉, 等. 當歸芍藥散神經(jīng)保護作用的實驗研究[J]. 山東醫(yī)藥, 2008, 48(23): 1-3

◆

The Effects of α7nAChR on the Neurotoxicity of Methylmercury Chloride

Cui Jing1, Yang Shengsen2, Lu Zhiyan3, Yang Weicai1and Tian Jianying1,*

1. Ningxia Medical University School of Basic Medical Sciences, Yinchuan 750004, China 2. Department of Orthopedics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China 3. Department of Radiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430072, China

Received 12 January 2015 accepted 29 March 2015

To investigate the neurotoxicity of environmental pollutant, methylmercury chloride (MeHgCl) on the nervous system, the PC 12 cell viability was detected by MTT assay. The gene expression level of α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR, was evaluated by immunofluorescence, Dot-Blot and qRT-PCR both at protein and mRNA levels when PC12 cells were treated with MeHgCl. The results demonstrated that MeHgCl impaired the cell viability and inhibited α7nAChR gene expression both in transcriptional and translational levels in a dose-dependent manner. These results illustrated that the neurotoxicity of MeHgCl might be associated with the inhibition of α7nAChR gene expression.

MeHgCl; α7nAChR; memory; neurotoxicity

國家自然科學基金 (No.81060231,81160338)；寧夏高校重點項目(NGY2011039) ；湖北省自然科學基金(No. 2013CFB277)

崔靜(1987-)，女，碩士研究生，研究方向為環(huán)境因素與老年性癡呆的發(fā)病機制及防治，E-mail: 15109685679@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jianyingt@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897-20150112001

2015-01-12 錄用日期：2015-03-29

1673-5897(2015)3-276-05

X171.5

A

田建英，女，教授，碩士研究生導師，主要研究方向環(huán)境因素與老年性癡呆的發(fā)病機制及防治。

崔靜，楊生森，魯植艷, 等. α7nAChR在氯化甲基汞神經(jīng)毒性中的作用[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(3): 276-280

Cui J, Yang S S, Lu Z Y, et al. The effects of α7nAChR on the neurotoxicity of methylmercury chloride [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 276-280 (in Chinese)