郭 剛，王久存，史 穎，楚海燕，劉慶梅

組織纖維化可以累及人體幾乎所有的器官和系統(tǒng)，據美國相關統(tǒng)計資料證明，致死性疾病中有近45%可歸于組織纖維增生疾?。?］。而近年來肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢。PF是以肺泡持續(xù)性損傷、成纖維細胞(fibroblast，FB)增殖及大量細胞外基質沉積而導致肺組織反復破壞、修復，最終造成肺組織中大量膠原沉積為病理特點的一類疾病［2-4］。目前針對PF的治療仍是世界性難題，西藥治療效果差或不良反應嚴重，肺移植是目前唯一有效的治療手段。而近年來中醫(yī)對PF已有較深刻的認識。諸醫(yī)家將本病歸屬中醫(yī)“肺痹”及“肺痿”范疇，認為肺腎虧虛、痰瘀阻絡、肺失宣降為其基本病機［5-6］。而參麥開肺散是河北醫(yī)科大學附屬以嶺醫(yī)院根據中醫(yī)辨證論治研發(fā)的治療PF的純中藥制劑，由丹參、西洋參、麥冬等組成，具有益氣養(yǎng)陰、化痰祛瘀通絡、宣肺理氣等功效，本方在臨床應用能明顯緩解PF患者的癥狀，是治療PF的有效方劑。然而，參麥開肺散對FB增殖、膠原合成的影響等與纖維化相關的研究尚待進行。β型轉化生長因子(transforming growth factorβ，TGF-β)是重要的纖維化因子，在纖維化發(fā)生中起著極其重要的作用［7-10］。因而，本研究將利用外源性TGF-β處理NIH/3T3 FB以誘導細胞纖維化反應，探討參麥開肺散對FB中膠原及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)相關基因、膠原蛋白表達水平以及對分泌到細胞上清中膠原蛋白含量的影響，為其進一步在臨床中應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株:NIH/3T3 FB購自中國科學院上海細胞所。

1.1.2 藥物:參麥開肺散，由西洋參、麥冬、丹參、絞股藍、半枝蓮等組成，每包5 g，由河北醫(yī)科大學附屬以嶺醫(yī)院提供，是院內制劑。

1.1.3 主要試劑:DMEM基本培養(yǎng)液(Invitrogen);胎 牛 血 清 (FBS， Gibco);Recombinant TGF-β(R＆D);TRIzol(Invitrogen);High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems);SYBR Premix ExTaq(Takara);RIPA(碧云天);PMSF(碧云天);BCA protein assay kit(碧云天);鼠源Ⅰ型膠原(COLⅠ)抗體(Millipore);鼠源GAPDH抗體(Cell Signaling Technology);辣根過氧化物酶(HRP)標記的-羊抗兔二抗(碧云天);HRP-羊抗鼠二抗(碧云天);蛋白分子量標準(Fermentas);Sircol assay試劑盒(Biocolor)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):依據慢凍速融的原則，細胞從液氮罐中取出后迅速放入37℃的水浴鍋中。待完全融化后，將細胞液從凍存管中轉入15 ml離心管中離心，1200 r/min離心5 min。棄上清，加入含10%FBS的細胞培養(yǎng)液進行吹打。將細胞分散后，轉入直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，添加新鮮培養(yǎng)液至總體積為10 ml。鏡檢后，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定之后，即可用于細胞鋪板。

1.2.2 藥物濃度的確定及分組:選用Roche公司的xCELLigence System，其操作原理是:電子傳感器通過位于16孔電子微量滴定板底部的電極檢測細胞阻抗，細胞越多，阻抗越大。檢測到的電極阻抗用細胞指數(cell index，CI)表示。CI表示隨著時間的變化，一個細胞群體與傳感電極接觸所產生的微量電極阻抗的變化。向16孔電子微量滴定板中每孔加入50μl不含細胞的完全培養(yǎng)液，設好檢測程序，將滴定板放入儀器中，使用細胞計數儀對事先準備好的NIH/3T3 FB進行計數，向微量滴定板中每孔加入50μl細胞液，使每孔最終細胞數為5000個;再將滴定板放入儀器中，程序繼續(xù)運行，直到生長曲線的CI值接近1.0時，取下滴定板，將細胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將參麥開肺散用完全細胞培養(yǎng)液稀釋成不同的濃度梯度:0、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0、15.0 mg/ml，向各孔中加入100μl含不同濃度參麥開肺散的細胞培養(yǎng)液，放入儀器中進行檢測;參麥開肺散濃度的選擇標準是對細胞毒性小、細胞增殖不受明顯抑制的最大濃度。實驗結果用RTCA software(Roche)進行分析。

1.2.3 纖維化體外模型的建立及處理:待細胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定之后，將培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中的細胞接種至12孔板，每孔細胞1×105個。待細胞長至融合度為80%之后，將細胞培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。細胞常規(guī)培養(yǎng)后分為正常對照組、模型組和處理組，每組3個復孔。正常對照組加入含1%FBS的細胞培養(yǎng)液500μl，模型組加入使用含1%FBS的細胞培養(yǎng)液配制5 ng/ml的 TGF-β溶液500μl，處理組各孔加入5 ng/ml的 TGF-β+1 mg/ml的參麥開肺散混合溶液500μl，培養(yǎng)24 h。

1.2.4 熒光實時定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR):提取各組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以此為模板，進行PCR擴增。根據Genbank數據庫提供的小鼠基因外顯子序列，應用primer premier 5.0軟件設計Real-time PCR引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。Real-time PCR儀為ABI Prism 7900 Detector System(Applied Biosystems)，PCR 反應條件:50℃、2 min，1個循環(huán);95℃、3 min，1 個循環(huán);95℃、15 s，60℃、40 s，40 個循環(huán);95℃、15 s，60℃、15 s，95℃、15 s。

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測:收集各組細胞總蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，每份蛋白樣本取等量的蛋白加入膠孔中，取3μl蛋白marker加入膠孔中，80 V恒壓30 min，待樣本進入分離膠之后，將電壓調至120 V，恒壓持續(xù)1 h;將蛋白膠取下，與濾紙和PVDF膜一塊放入轉膜夾中，從電源正極到負極依次是濾紙、PVDF膜、蛋白膠、濾紙，夾好之后將轉膜夾放入轉膜槽中，將電壓儀的模式調為恒流模式，電流為300 mA，轉膜2 h;膜經5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，分別與COLⅠ抗體、GAPDH抗體，4℃孵育過夜;TBST清洗，10 min×3次;加入二抗，室溫孵育1 h;TBST清洗，10 min×3次;然后按照 Image Quant TL LAS 4000 mini(General Electric Company)的操作程序進行顯影;最后，使用Image Quant TL Western blot分析軟件(General Electric Company)進行條帶分析。

表1 熒光實時定量聚合酶鏈反應中引物序列

1.2.6 膠原蛋白檢測(Sircol assay):收集各組細胞上清，加入100μl膠原分離與濃縮試劑(collagen isolation＆concentration reagent)，4℃ 過夜，12 000 g離心30 min，棄上清。標準膠原的稀釋:0.5 mg/ml分別稀釋到 0.2、0.1、0.05、0.01、0 mg/ml。各樣本管中加入500μl的Sircol染料，機械混勻30 min。12 000 g離心10 min，棄上清。加入1×Acid-Salt Wash Reagent 750 μl，洗 1 遍，12 000 g 離心 1 min，棄上清。向各管中加入250μl的堿性金屬試劑，渦漩混勻。轉移200μl樣本至96孔板中。在酶標儀下進行檢測，調整波長至555 nm，用水調整吸光值為零，測定空白試劑，標準膠原和檢測樣本-空白試劑的讀數重復試驗的誤差在±10%。重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，采用方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 參麥開肺散抑制FB增殖及最佳濃度 參麥開肺散濃度越大，對FB增殖的抑制作用越大，并且毒性也越大。而參麥開肺散濃度在1.0 mg/ml時，對FB毒性小，且FB增殖不受明顯抑制(圖1)，因此，選擇1.0 mg/ml作為參麥開肺散后續(xù)實驗的濃度。

圖1 不同濃度參麥開肺散處理的NIH/3T3成纖維細胞生長曲線

2.2 參麥開肺散可顯著降低纖維化細胞膠原及其相關基因的表達 經過外源性TGF-β刺激之后，NIH/3T3 FB 系中 COLⅠa1、COLⅢa1、結締組織生長因子(CTGF)、TGF-β的表達水平均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，表現出類似 PB的 FB的表型。而經過參麥開肺散處理之后，上述基因的表達水平均顯著下調(P＜0.05，P＜0.01)，接近于正常水平。見圖2。

2.3 參麥開肺散顯著降低FB COLⅠ蛋白表達 在外源性TGF-β刺激之后，COLⅠ蛋白含量顯著增高(P＜0.05)，而參麥開肺散可明顯抑制COLⅠ蛋白的生成(P＜0.05)。見圖3～4。

2.4 參麥開肺散顯著降低分泌到細胞上清中膠原蛋白的含量 在外源性TGF-β刺激后，細胞上清中的膠原蛋白含量顯著上調，而用參麥開肺散干預后膠原蛋白含量顯著下調(P＜0.05)，接近正常水平。見圖5。

圖2 參麥開肺散對體外纖維化細胞模型中膠原及其相關基因表達水平的影響COLⅠ為Ⅰ型膠原，COLⅢ為Ⅲ型膠原，CTGF為結締組織生長因子，TGF-β為β型轉化生長因子;與正常對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01;與模型組比較，c P＜0.05，d P＜0.01

圖3 參麥開肺散對成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白表達的影響COLⅠ為Ⅰ型膠原

圖4 參麥開肺散對體外纖維化細胞模型中Ⅰ型膠原蛋白含量的影響與正常對照組比較，a P＜0.05;與模型組比較，c P＜0.05

圖5 參麥開肺散對細胞上清中膠原蛋白含量的影響與正常對照組比較，a P＜0.05;與模型組比較，c P＜0.05

3 討論

抗纖維化是治療纖維化疾病的主要方法，能夠抑制FB活性和膠原合成是抗纖維化藥物的重要特征［11-12］。TGF-β在調控FB增殖及膠原蛋白的合成與降解中起著重要作用，是目前最有效的促纖維化因子之一［13-14］。已有研究表明，上皮細胞TGF-β信號缺失時PF即終止［15］，說明其在PF形成和發(fā)展過程中起關鍵性作用。CTGF為一種富含半胱氨酸的分泌性小分子蛋白，具有調節(jié)FB增殖、遷移以及促進TGF-β 誘導的 ECM 合成功能［16］，是 TGF-β 下游重要的效應基因。有研究發(fā)現，CTGF在系統(tǒng)性硬化癥伴PF患者肺組織內表達升高，在博萊霉素誘導的PF小鼠模型體內同樣升高［17］。因此，CTGF在纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮促進作用。Lasky等［18］通過體外培養(yǎng)發(fā)現外源性TGF-β能夠特異性地誘導CTGF表達增加2倍以上，證明在PF中CTGF的增高與 TGF-β相關。本實驗表明，外源性TGF-β 可以誘導 NIH/3T3 FB中 TGF-β、CTGF基因表達水平增高，而用參麥開肺散處理后，可明顯抑制其表達。說明參麥開肺散可能通過直接抑制TGF-β而防止纖維化，或通過抑制TGF-β下游效應基因CTGF表達而發(fā)揮抗纖維化作用。

眾所周知，纖維化就是組織內ECM異常增多和過度沉積的病理過程，而ECM中最主要的成分就是膠原蛋白［19］。PF發(fā)生時肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量顯著增加，有研究提示，Ⅲ型膠原可作為判定PF早期或活動期的指標［20］。據報道，大鼠肺FB受到刺激因素作用后能夠活躍合成Ⅰ、Ⅲ型膠原，增加ECM沉積，引起大鼠PF［21］。本實驗結果提示，外源性TGF-β可以誘導NIH/3T3 FB中膠原及ECM相關基因表達、膠原蛋白合成，以及分泌到細胞上清中的膠原蛋白含量增高，類似于PF時狀態(tài)。而用參麥開肺散處理NIH/3T3 FB，發(fā)現參麥開肺散不但可抑制其增殖，還可以明顯抑制外源性TGF-β誘導的NIH/3T3 FB中膠原及ECM相關基因表達、膠原蛋白合成，以及分泌到細胞上清中的膠原蛋白含量。提示參麥開肺散發(fā)揮抗纖維化作用可能與其抑制FB增殖及膠原合成相關。

中藥治療PF，除了藥性溫和，另外一個優(yōu)勢就是成分眾多，能夠發(fā)揮多途徑和多靶點的綜合作用。參麥開肺散由丹參、西洋參、麥冬、絞股藍、半枝蓮等組成，具有益氣養(yǎng)陰、化痰祛瘀通絡及宣肺理氣功效?，F代藥理研究表明，丹參可通過抗炎、抑制膠原合成、抗氧化等抑制PF的發(fā)生［22］。Th1/Th2失衡在PF中也發(fā)揮了重要作用［23］，而西洋參、麥冬和絞股藍都具有免疫調節(jié)作用［24-26］。參麥開肺散能否糾正PF中Th1/Th2失衡，還有待進一步探索。近年來大量證據表明，氧化/抗氧化失衡在PF的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［27］，而參麥開肺散組方中西洋參、麥冬、丹參、半枝蓮均有抗氧化作用［28-31］。提示參麥開肺散也可能通過糾正氧化/抗氧化失衡和Th1/Th2失衡發(fā)揮抗PF作用。我們將通過體內外實驗進一步明確參麥開肺散治療PF的作用機制，為更好地應用于臨床及新藥的研發(fā)奠定基礎。

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