黃愛(ài)霞

(監(jiān)利縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 監(jiān)利 433300)

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湖北地區(qū)漢族人群ALDH2*504Lys基因多態(tài)性分析

黃愛(ài)霞

(監(jiān)利縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 監(jiān)利 433300)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.041

乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)*2等位基因由常染色體顯性遺傳，位于人類第12號(hào)染色體上。ALDH2基因存在G1510A多態(tài)性，導(dǎo)致氨基酸序列第504位上的谷氨酸(Glu)被賴氨酸(Lys)所替換(Glu504Lys)，其中具有催化活性的野生型稱為G等位基因(ALDH2*1)，而催化能力失活的變異型稱為A等位基因(ALDH2*2)。Glu504 GG型(ALDH2*1/1)可以編碼正常催化活性的蛋白代謝酒精，有100%的酒精代謝活性；Glu504/Lys504 GA型(ALDH2*1/2)只有GG型的10%～45%酒精代謝活性；Lys504(ALDH2*2/2)AA型幾乎不能編碼具有代謝酒精能力的活性蛋白，大約只有GG型的6%酒精代謝活性[1]，因此這個(gè)基因被認(rèn)為是用來(lái)防止酒精中毒的保護(hù)因子。ALDH2的等位基因型與飲酒者對(duì)酒精的酒后臉紅反應(yīng)，酒精中毒密切聯(lián)系并且罹患酒精肝、阿爾茨海默病、結(jié)直腸癌、食管癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高[2]。目前已有很多研究報(bào)道該等位基因頻率及其與酒精相關(guān)疾病的聯(lián)系。本研究采用Sanger測(cè)序法對(duì)湖北地區(qū)人群ALDH2基因突變的頻率進(jìn)行檢測(cè)和分析比較，并闡述該等位基因型別檢測(cè)的臨床應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集采集96例無(wú)血緣關(guān)系的湖北地區(qū)健康漢族人靜脈血2 mL(二乙胺四乙酸二鉀抗凝)，用酚-氯仿法提取外周血中有核細(xì)胞的DNA。上述患者依據(jù)飲酒調(diào)查情況分為臉紅組和不臉紅組。

1.2引物設(shè)計(jì)、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增以及ALDH2 Glu504Lys基因多態(tài)性測(cè)序PCR引物以及測(cè)序引物設(shè)計(jì)[3]正向引物:5′-TGCTATGATGTGTTTGGAGCC-3′；反向引物:5′-GGCTCCGAGCCACCA-3′。PCR反應(yīng)總體系為25 μL，100 ng基因組DNA、引物終濃度為0.25 mol/L、MgCl2終濃度為50 mmol/L、0.2 mmol/L的脫氧核苷三磷酸和1 U的Taq酶(Takara)。程序選擇：95 ℃預(yù)變性5 min、變性94 ℃ 30 s、退火62 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s PCR 35個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃ 10 min 然后4 ℃保存(PCR儀：veriti Applied Biosystems)。取10 μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，DNA Marker(Takara)標(biāo)記分子量大小。另外,取5 μL PCR產(chǎn)物加入1 U Exonclease Ⅰ和2 U shrimp alkaline phosphatase(Takara)37 ℃ 1 h，80 ℃ 15 min,取1 μL Exon Ⅰ/SAP消化產(chǎn)物作為模板進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)然后對(duì)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化，最后加入10 μL的Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems) 95 ℃ 5 min變性后AB 3130測(cè)序儀(Applied Biosystems)進(jìn)行ALDH2 12外顯子測(cè)序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ALDH2第12外顯子測(cè)序結(jié)果

2.1.1ALDH2*1/1基因型第12外顯子測(cè)序結(jié)果采用Sequence Analysis軟件分析ALDH2第12外顯子Sanger測(cè)序結(jié)果，其中ALDH2第12外顯子504密碼子(G1510G)未發(fā)生突變，檢測(cè)基因型為ALDH2*1/1，見(jiàn)圖1。

圖1　ALDH2*1/1基因型第12外顯子測(cè)序結(jié)果

2.1.2ALDH2*1/2基因型第12外顯子測(cè)序結(jié)果采用Sequence Analysis軟件分析ALDH2第12外顯子Sanger測(cè)序結(jié)果，其中ALDH2第12外顯子504密碼子(1510G>G/A)發(fā)生突變，突變頻率為50%，GAA(Glu)突變?yōu)锳AA(Lys)。檢測(cè)基因型ALDH2*1/2，見(jiàn)圖2。

圖2　ALDH2*1/2基因型第12外顯子測(cè)序結(jié)果

2.2ALDH2基因型和基因頻率檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果檢驗(yàn)樣本的基因型符合H-W平衡(P>0.05)，樣本具有代表性。ALDH2*1 和ALDH2*2兩種等位基因的頻率分別為89.1%和10.9%。ALDH2*1/1、ALDH2*1/2和ALDH2*2/2三種基因型頻率分別為78.1%、21.9%和0%，見(jiàn)表1。

表1　ALDH2基因型和基因頻率檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3酒精臉紅反應(yīng)者與ALDH2基因型的關(guān)系統(tǒng)計(jì)結(jié)果飲酒情況調(diào)查結(jié)果為臉紅組35例，不臉紅組61例。兩組GA與GG基因型構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.367，P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2　兩組ALDH2基因型的關(guān)系統(tǒng)計(jì)結(jié)果　[例(%)]

3討論

ALDH2第12外顯子的基因多態(tài)性存在明顯的種族差異，亞洲人群中，ALDH2*1/2基因型頻率為30%～50%，中國(guó)漢族人的突變率為20%～30%；日本人則具有更高的突變率，最高可以占到人群總數(shù)的34.1%；白種人該基因突變率很低[4]。但是同一種族不同地域的人群ALDH2基因多態(tài)性分布也不一致，洛陽(yáng)人ALDH2*1/1、ALDH2*1/2、ALDH2*2/2的基因型頻率分別為71.43%、27.62%、0.95%[5]；上海人的ALDH2*1/1、ALDH2*1/2、ALDH2*2/2的基因型頻率分別為54.29%、40.95%、4.76%[6]。本研究等位基因頻率與洛陽(yáng)地區(qū)漢族人群該等位基因頻率基本一致，尚未檢測(cè)到ALDH2*2/2基因型，分析原因可能是樣本量不足，但是本研究對(duì)湖北地區(qū)漢族人群ALDH2*504Lys等位基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果也有一定的代表性。

部分亞洲人群在飲用酒精飲料后，由于酒精在肝代謝成為乙醛，乙醛刺激而引起皮膚發(fā)紅或起疙瘩等一系列反應(yīng)稱為酒精臉紅反應(yīng)。本研究中酒精臉紅反應(yīng)的人群ALDH2*504Lys基因型頻率高達(dá)51.4%。文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于酗酒的人來(lái)說(shuō)ALDH2 Glu/Lys雜合子的人可能罹患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)較無(wú)這種基因缺陷的人高[7]，并且此類人群罹患結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死等疾病風(fēng)險(xiǎn)更高[8]。臨床醫(yī)師可以通過(guò)詢問(wèn)患者是否有酒精臉紅反應(yīng)大致判斷他們是否存在ALDH2缺陷，通過(guò)臨床分子診斷來(lái)準(zhǔn)確判斷ALDH2等位基因型，若是患者為ALDH2*1/2基因型應(yīng)該勸告其少喝酒并增加食管癌方面的檢查。普通人群也可以在平時(shí)喝酒的過(guò)程中注意是否有酒精臉紅反應(yīng)，若有酒后反應(yīng)建議做ALDH2的等位基因型的篩查，減少飲酒，增加防護(hù)意識(shí)，有助于降低罹患酒精相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

硝酸甘油治療心絞痛和心力衰竭已經(jīng)有百年歷史，近來(lái)，有研究表明線粒體ALDH2對(duì)硝酸甘油療效需要的代謝產(chǎn)物——一氧化氮的合成有關(guān)鍵作用。ALDH2第12個(gè)外顯子504 Glu/Lys的突變型和雜合型會(huì)嚴(yán)重降低ALDH2的酶活性， Glu504蛋白對(duì)硝酸甘油的催化活性(Vmax/Km)大約是Lys504蛋白的10倍[9]。因此，Glu504Lys基因多態(tài)性結(jié)果對(duì)臨床舌下含服硝酸甘油是否有效發(fā)揮很大的指導(dǎo)作用。建議給患者使用硝酸甘油要考慮這一因素，尤其是亞洲人，其30%～50%攜帶造成活性減弱的ALDH2*2突變，通過(guò)對(duì)ALDH2等位基因的檢測(cè)，可能為臨床醫(yī)師是否選用舌下含服硝酸甘油治療心絞痛和心力衰竭的標(biāo)準(zhǔn)之一。

參考文獻(xiàn)

[1]Umulis DM,Gürmen NM,Singh P,etal.A physiologically based model for ethanol and acetaldehyde metabolism in human beings[J].Alcohol， 2005，35(1):3-12.

[2]Brooks PJ,Enoch MA,Goldman D,etal.The alcohol flushing response:an unrecognized risk factor for esophageal cancer from alcohol consumption[J].PLoS Med，2009,6(3)：e1000050.

[3]Itoga S,Nanmoku T,Uchimoto T,etal.Comparative analyses of four different methods of genotyping ALDH2[J].Alcohol Clin Exp Res，2004,28(8):117-122.

[4]Li H,Borinskaya S,Yoshimura K,etal.Refined geographic distribution of the oriental ALDH2*504Lys(nee 487Lys)variant[J].Ann Hum Genet,2009,73(3)：335-345.

[5]張竹梅,劉茶珍,邊建超.洛陽(yáng)市漢族群體ADH2和ALDH2的基因多態(tài)性研究[J].遺傳,2002,24(5):532-536.

[6]Muramatsu T,Wang ZC,Fang YR，etal.Alcohol and aldehyde dehydrogenase genotypes and drinking behavior of Chinese living in Shanghai[J].Hum Genet,1995,96(2):151-154.

[7]Ding J,Li S,Cao H,etal.Polymorphisms of alcohol dehydrogenase-2 and aldehyde dehydrogenase-2 and esophageal cancer risk in Southeast Chinese males[J].World J Gastroenterol,2009,15(19):2395-2400.

[8]Zhang GH,Mai RQ,Huang B,etal.Meta-analysis of ADH1B and ALDH2 polymorphisms and esophageal cancer risk in China[J].World J Gastroenterol, 2010,16(47):6020-6025.

[9]Li Y,Zhang D,Jin W,etal.Mitochondrial aldehyde dehydrogenase-2(ALDH2) Glu504Lys polymorphism contributes to the variation in efficacy of sublingual nitroglycerin[J].J Clin Inves,2006,116(2):506-511.

摘要：目的調(diào)查湖北地區(qū)漢族人群乙醛脫氫酶2(ALDH2)第12外顯子Glu504Lys基因多態(tài)性。方法采集96例無(wú)血緣關(guān)系漢族人的外周血，運(yùn)用Sanger測(cè)序法檢測(cè)ALDH2第12外顯子單核苷酸多態(tài)性(SNP)的情況。結(jié)果ALDH2*1和ALDH2*2等位基因的突變頻率分別為89.1%和10.9%。ALDH2*1/1和ALDH2*1/2兩種基因型頻率分別為78.1%和21.9%，尚未檢測(cè)到ALDH2*2/2純合突變。飲酒有酒精臉紅反應(yīng)組ALDH2*504Lys基因頻率顯著高于不臉紅組(P<0.01)。結(jié)論湖北地區(qū)的居民對(duì)酒精的耐受程度比上海人強(qiáng)，與洛陽(yáng)人耐受酒精能力一致。

關(guān)鍵詞：乙醛脫氫酶2；基因多態(tài)性；等位基因頻率

Analysis on the Genetic Polymorphism of ALDH2*504Lys among the Han Population in HubeiHUANGAi-xia.(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofJianliCounty,Jianli433300,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate allele frequency of the twelfth exon of aldehyde dehydrogenase 2(ALDH2*504Lys) among the Han Population in Hubei.MethodsPeripheral blood samples of 96 Hans without blood relationship were collected,and the single nucleotide polymorphism(SNP) of the twelfth exon of ALDH2 was analyzed by Sanger sequencing.ResultsThe allele mutation rates of ALDH2*1 and ALDH2*2 were 89.1% and 10.9% respectively.Genotype frequencies of ALDH2*1/1 and ALDH2*1/2 were 78.1% and 21.9%.And no homozygous mutant of ALDH2*2/2 was found.Gene frequency of ALDH2*504Lys was significantly higher in people with flushing response after alcohol intake than in those without such response(P<0.01). ConclusionResidents in Hubei province are more tolerant of alcohol than Shanghai residents,and are tolerant of alcohol at the same level as Luoyang residents.

Key words：Aldehyde dehydrogenase 2; Single nucleotide polymorphism; Allele frequency

收稿日期：2014-03-17修回日期:2014-08-29編輯：伊姍

中圖分類號(hào)：Q347

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)05-0877-03