李　程　陳　波　胡鐵漢　陳　磊(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院，貴州　貴陽(yáng)　550025)

毫針針刺對(duì)腧穴筋膜結(jié)締組織細(xì)胞整合素β1、β3亞基和PCNA表達(dá)的影響

李程1陳波胡鐵漢陳磊
(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025)

〔摘要〕目的探討毫針針刺對(duì)SD大鼠腧穴穴區(qū)筋膜結(jié)締組織細(xì)胞2種整合素β亞基和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)的影響。方法將32只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、細(xì)針刺激組、中針刺激組(中等粗細(xì)毫針刺激組)和粗針刺激組，每組8只，除空白組外，針刺各組在大鼠中脘穴沿任脈循行方向平刺施以捻轉(zhuǎn)平補(bǔ)平瀉刺激，治療1次/d，治療3 d后，切取穴區(qū)筋膜結(jié)締組織，采用免疫組化染色法，鏡下觀察腧穴穴區(qū)筋膜結(jié)締組織整合素β1亞基(integrinβ1)、integrinβ3及PCNA蛋白表達(dá)。結(jié)果毫針針刺作用后，腧穴筋膜結(jié)締組織integrinβ亞基的表達(dá)變化情況不同:細(xì)針刺激組和中針刺激組筋膜結(jié)締組織中integrinβ1的表達(dá)比空白對(duì)照組均有增強(qiáng)，其中細(xì)針刺激組integrinβ1的表達(dá)統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著差異(P=0.314)，中針刺激組integrinβ1的表達(dá)有極顯著差異(P = 0.000)，然而，粗針刺激組integrinβ1的表達(dá)較空白組明顯下降，呈翻轉(zhuǎn)趨勢(shì)，差異顯著(P = 0.001) ; integrinβ3除部分大小血管可見少量表達(dá)外，在腧穴筋膜結(jié)締組織中始終為陰性表達(dá);筋膜結(jié)締組織中PCNA蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P = 0.002，0.005，0.039)，其中細(xì)針刺激組最強(qiáng)。結(jié)論毫針針刺能夠激發(fā)受治腧穴穴區(qū)細(xì)胞活性變化，其中β1類integrin是腧穴筋膜結(jié)締組織中主要的力學(xué)信號(hào)蛋白，β3類integrin不是腧穴筋膜結(jié)締組織中主要的力學(xué)信號(hào)蛋白，這可能進(jìn)一步揭示了腧穴感受針刺治療信號(hào)的非神經(jīng)生物學(xué)細(xì)胞力學(xué)基本原理之一。

〔關(guān)鍵詞〕毫針針刺;筋膜結(jié)締組織;力感受分子;整合素β亞基;增殖細(xì)胞核抗原

1貴州省第二人民醫(yī)院康復(fù)科

第一作者:李程(1988-)，女，住院醫(yī)師，主要從事針灸推拿的基礎(chǔ)與康復(fù)運(yùn)用研究。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，毫針針刺實(shí)質(zhì)上是一種復(fù)合機(jī)械刺激〔1〕，機(jī)械力刺激貫穿毫針針刺的整個(gè)過(guò)程。課題組前期引入離體細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了腧穴或經(jīng)絡(luò)區(qū)域筋膜結(jié)締組織中未分化的潛能細(xì)胞——成纖維細(xì)胞〔2〕，能將力學(xué)刺激進(jìn)行生物轉(zhuǎn)換，合成和釋放多種生化活性物質(zhì)。本課題繼續(xù)以腧穴筋膜結(jié)締組織為研究對(duì)象，以免疫組化技術(shù)探討針刺基本力學(xué)作用于腧穴力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)通路中力感受器分子整合素(integrin)β1亞基和integrinβ3亞基的表達(dá)變化，以及受力穴區(qū)細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)情況的影響，為毫針針刺治療作用的現(xiàn)代生物學(xué)原理提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組體重為180～220 g的雄性SD大鼠(SPF清潔級(jí)) 32只，購(gòu)自湖南省長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(湘) 2009-0012。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、細(xì)針刺激組(36號(hào)毫針)、中針刺激組(30號(hào)毫針)、粗針刺激組(26號(hào)毫針)，每組8只。

1.2主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑1寸毫針(蘇州針灸用品有限公司)、半自動(dòng)脫水機(jī)(Leica，德國(guó))、全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)(Leica，德國(guó))、全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))、顯微鏡(Nikon，日本)、數(shù)碼相機(jī)(Nikon，日本)、IGTB1(瑞博奧，中國(guó)北京，批號(hào): 130705w)、IGTB3(Epitomics，美國(guó)，YI121306DS)、PCNA一抗(Abcam，英國(guó)，批號(hào): YJ020304cs)、EnVision抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(Dako，丹麥)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法(1)刺激方法:針刺組大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉固定后，在大鼠腹部中脘穴處(參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》〔3〕附錄四，大鼠中脘穴定位臍上約20 mm)備皮，消毒沿任脈循行方向平刺刺入0.5 cm，按照平補(bǔ)平瀉手法捻轉(zhuǎn)5 min，捻轉(zhuǎn)針體頻率60 r/min(誤差控制±2 r/min)，捻轉(zhuǎn)幅度180°～360°，留針10 min，再捻轉(zhuǎn)5 min，捻轉(zhuǎn)完畢后以針尾為參照物順時(shí)針捻轉(zhuǎn)針體5圈，滯針10 min，10 min后逆時(shí)針回轉(zhuǎn)針體5圈，出針，以消毒干棉球按壓5～10 s。治療1次/d，共治療3 d。相同刺激參數(shù)下，各刺激組用相應(yīng)型號(hào)的毫針，空白組做相同的麻醉、抓取、固定。(2)動(dòng)物手術(shù)和取材方法:末次刺激后，將大鼠仰臥位固定，腹部中脘穴區(qū)進(jìn)一步備皮、消毒，連皮取以大鼠的穴點(diǎn)為中心，邊長(zhǎng)約為2 cm正方形的皮下筋膜組織塊，用生理鹽水沖洗并立即放入10％中性緩沖甲醛溶液中固定，組織和固定液的比例為1∶10～1∶20。

1.3.2組織石蠟塊制作組織塊固定2～3 h，取出修剪組織成厚度在2 mm左右，邊長(zhǎng)＜7 mm的小塊后，進(jìn)一步經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后制成組織石蠟塊，并作后期實(shí)驗(yàn)備用。

1.3.3指標(biāo)檢測(cè)腧穴筋膜結(jié)締組織細(xì)胞integrinβ1、integrinβ3、PCNA表達(dá)測(cè)定，均采用免疫組化法，均按試劑盒要求操作。

1.3.4結(jié)果觀察及處理免疫組化實(shí)驗(yàn)圖片應(yīng)用軟件Image pro plus6.0進(jìn)行分析，在同等參數(shù)設(shè)置下測(cè)定integrinβ1、integrinβ3、PCNA的積分光密度值(IOD)和陽(yáng)性區(qū)域面積(area)，通過(guò)計(jì)算平均光密度(MD)反映目標(biāo)物質(zhì)的單位面積含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1腧穴筋膜結(jié)締組織細(xì)胞integrinβ1表達(dá)檢測(cè)細(xì)針刺激組和中針刺激組筋膜結(jié)締組織中integrinβ1表達(dá)(0.010 288±0.004 779 8，0.016 088±0.003 415 3)較空白對(duì)照組(0.008 550±0.003 228 0)均有增強(qiáng)，其中細(xì)針刺激組integrinβ1的表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(P = 0.314)，中針刺激組integrinβ1的表達(dá)與空白對(duì)照組有極顯著差異(P= 0.000)。相反，粗針刺激組integrinβ1的表達(dá)(0.002 000±0.001 043 3)明顯下降，呈翻轉(zhuǎn)趨勢(shì)，與空白對(duì)照組有極顯著性差異(P = 0.001)。見圖1。

圖1　各組“中脘”穴區(qū)筋膜組織細(xì)胞integrinβ1免疫組化的表達(dá)(×400)

2.2腧穴筋膜結(jié)締組織細(xì)胞integrinβ3表達(dá)檢測(cè)腧穴筋膜結(jié)締組織中integrinβ3的表達(dá)呈陰性結(jié)果，部分大小血管有少量表達(dá)。見圖2。

圖2　各組“中脘”穴區(qū)筋膜結(jié)締組織integrinβ3免疫組化的表達(dá)(×200)

2.3腧穴筋膜結(jié)締組織細(xì)胞PCNA表達(dá)檢測(cè)針刺治療組腧穴筋膜組織中PCNA的釋放均比較空白對(duì)照組(0.001 525± 0.000 399 1)明顯增強(qiáng)，其中細(xì)針刺激組(0.006 800± 0.004 639 6)和中針刺激組(0.006 288±0.002 610 1) PCNA的表達(dá)有極顯著差異(P= 0.002，0.005)，粗針刺激組PCNA的表達(dá)(0.004 950±0.003 385 3)與空白對(duì)照組有顯著差異(P = 0.039)。其中，針刺刺激組PCNA釋放增加的強(qiáng)度呈略微下降趨勢(shì):細(xì)針刺激組＞中針刺激組＞粗針刺激組。見圖3。

圖3　各組“中脘”穴區(qū)筋膜結(jié)締組織PCNA免疫組化的表達(dá)(×400)

3　討論

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)研究認(rèn)為〔3〕，針刺腧穴后，其作用機(jī)制的始動(dòng)環(huán)節(jié)在穴位感受器(游離神經(jīng)末梢、肌梭、環(huán)層小體、克氏終球及關(guān)節(jié)囊感覺器)，穴位感受器將針刺機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動(dòng)(生物電信號(hào))，并通過(guò)神經(jīng)調(diào)節(jié)和神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)發(fā)揮防治疾病作用。但陳波等〔4〕對(duì)現(xiàn)代細(xì)胞生物力學(xué)的廣泛研究發(fā)現(xiàn)除了以往認(rèn)知的神經(jīng)組織神經(jīng)元以外，機(jī)體其他組織(上皮組織、結(jié)締組織、肌組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等)都是力學(xué)敏感細(xì)胞，力學(xué)刺激均可誘使這些細(xì)胞將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)，因此曾提出了廣義穴位感受器的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，并立足于此研究針刺治療的作用機(jī)制，逐步從生物物理學(xué)的角度建立起針刺效應(yīng)的非神經(jīng)組織細(xì)胞生物學(xué)啟動(dòng)機(jī)制構(gòu)想。眾多的研究者發(fā)現(xiàn)穴位并不能由一種組織學(xué)說(shuō)來(lái)闡述說(shuō)明時(shí)，轉(zhuǎn)向綜合性、整體性的研究，贊同穴位的立體構(gòu)筑學(xué)說(shuō)〔5〕，即由多種組織構(gòu)成，共同參與穴位的傳導(dǎo)作用，但不同的穴位由某一種或幾種組織起著主要作用。同時(shí)有學(xué)者認(rèn)為腧穴位于“筋膜支架”〔6〕較粗的珠樣部位，其存在以纖維(膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維)為框架，以成纖維細(xì)胞為主要細(xì)胞主體和以細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)(ECM)為主要成分建構(gòu)遍布全身的空間網(wǎng)絡(luò)中，不僅作為發(fā)揮力學(xué)功能的載體，并且參與物質(zhì)、信息和能量的傳輸和調(diào)節(jié)，構(gòu)成一個(gè)能夠?qū)ι餀C(jī)體內(nèi)外環(huán)境發(fā)生反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡體系。因此，研究毫針針刺對(duì)穴區(qū)筋膜組織細(xì)胞力感受始動(dòng)機(jī)制和效應(yīng)反應(yīng)，可能是進(jìn)一步認(rèn)識(shí)針刺治療作用基本和必然途徑之一。

生物細(xì)胞力學(xué)的研究表明: ECM-整合素-細(xì)胞骨架是細(xì)胞力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑和重要通路〔7〕。integrin作為跨膜細(xì)胞黏附分子家族的重要成員之一，目前被認(rèn)為是大多數(shù)細(xì)胞共有的力的感受器〔8〕。1987年，Hynes等首次提出integrin的概念，因其使細(xì)胞得以附著而形成一個(gè)整體故名。integrin家族是一類由α亞單位(120～185 kD)和β亞單位(90～110 kD)以1∶1比例通過(guò)非共價(jià)鍵連接而構(gòu)成的異二聚體跨膜黏蛋白，目前已經(jīng)確認(rèn)的有18種α亞單位和8種β亞單位，按照不同的組合共構(gòu)成至少24種integrin〔9〕。integrinβ按亞單位可分類為β1、β2、β3三個(gè)亞家族:其中β1亞家族稱為VLA家族，主要存在于各種體細(xì)胞表面，主要介導(dǎo)細(xì)胞與ECM成分之間的黏附;含β2亞家族稱為白細(xì)胞整合素，主要存在于各種白細(xì)胞表面，介導(dǎo)多種細(xì)胞間的相互作用;β3亞家族稱為細(xì)胞黏附素，主要存在于血小板表面，含人玻璃黏蛋白受體(VNR)和血小板的gp Ⅱb/Ⅲa，介導(dǎo)血小板的聚集，并參與血栓形成。integrin作為跨膜蛋白在ECM→整合素→細(xì)胞膜→細(xì)胞骨架這一信號(hào)傳導(dǎo)通路中起到關(guān)鍵的“信號(hào)中轉(zhuǎn)站”作用，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM之間的相互黏附，并介導(dǎo)力學(xué)信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)外之間的雙向傳導(dǎo)〔10〕。integrin對(duì)于介導(dǎo)針刺生物力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)作用的研究基本還是一個(gè)空白，課題組前期通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察壓力刺激對(duì)大鼠腧穴筋膜組織成纖維細(xì)胞力感受器分子integrinα1、integrinα2、α3和integrinαV表達(dá)的影響〔11〕，為針推的力學(xué)信號(hào)生物傳遞機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

PCNA〔12〕于1978年由Miyachi等在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名，因其特異的“增殖性”而得名，只存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)，靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞基本不表達(dá)，其免疫反應(yīng)大多局限于增殖細(xì)胞的核中，胞質(zhì)則很少甚至沒有。PCNA是目前測(cè)試細(xì)胞增殖狀態(tài)最有效的標(biāo)志之一。它的表達(dá)合成與增殖細(xì)胞的增殖周期有關(guān)，G0期細(xì)胞核中無(wú)明顯表達(dá)，G1早期開始表達(dá)，至G1晚期其表達(dá)大幅度增加，S期達(dá)到高峰，G2～M期明顯減少，其表達(dá)、分布與量的變化和DNA合成一致，幾乎參與DNA所有的修復(fù)過(guò)程，對(duì)DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)起不可取代的作用。細(xì)胞增殖是機(jī)體的重要生命特征之一，是機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)，而應(yīng)力刺激是調(diào)控細(xì)胞增殖能力的重要因素之一，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝〔13〕。有相關(guān)報(bào)道證實(shí)針刺介導(dǎo)的機(jī)械刺激可以增強(qiáng)細(xì)胞的“活力”:圍刺穴位局部可使其成纖維細(xì)胞活性增強(qiáng)從而達(dá)到抗皮膚老化的作用〔14〕;通過(guò)結(jié)合Brud摻入法和免疫熒光法觀察對(duì)筋膜結(jié)締組織施予拉伸刺激針刺可以顯著提高細(xì)胞的增殖活性〔15〕。

本研究結(jié)果顯示，不同規(guī)格毫針刺激對(duì)腧穴筋膜結(jié)締組織integrinβ1亞基的表達(dá)情況均有不同程度的影響。無(wú)論是否針刺刺激，刺激量不管大還是小，筋膜結(jié)締組織細(xì)胞中integrinβ3亞基的表達(dá)始終呈陰性結(jié)果。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其針灸學(xué)意義可能是:①β1類integrins是以筋膜結(jié)構(gòu)組織為主的穴位針刺機(jī)械信號(hào)力學(xué)感受的主要分子途徑。②β3類integrins不是以筋膜結(jié)構(gòu)組織為主的穴位針刺機(jī)械信號(hào)力學(xué)感受的主要分子途徑，但有可能是以血管為主的穴位針刺機(jī)械信號(hào)力學(xué)感受的主要分子途徑。③在以β1類integrins為主的穴位筋膜結(jié)締組織中，integrinβ1亞基感受有可能存在不同的表現(xiàn)方式，對(duì)輕中度刺激強(qiáng)表達(dá)，對(duì)重刺激弱表達(dá)，這可能是integrinβ1亞基感受存在敏感閾值范圍，大體以中等強(qiáng)度刺激為佳。④毫針針刺能夠提高受治腧穴穴區(qū)局部組織的細(xì)胞PCNA表達(dá)量，進(jìn)一步揭示了針刺刺激信號(hào)通過(guò)細(xì)胞integrins感受后能激發(fā)細(xì)胞本身功能狀態(tài)的改變，但PCNA表達(dá)量大小與刺激強(qiáng)度呈反向趨勢(shì)，說(shuō)明針刺信號(hào)感受與效應(yīng)見存在復(fù)雜的量-效關(guān)系，而這有待于進(jìn)一步研究。

4　參考文獻(xiàn)

1陳波.毫針刺法基本微觀力學(xué)作用的分析研究〔J〕．貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011; 33(2) : 32-5．

2陳波，崔瑾，謝西梅，等.體外壓力刺激對(duì)大鼠“足三里”穴筋膜組織成纖維細(xì)胞合成釋放基質(zhì)金屬蛋白酶1、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1、前列腺素E2和胰島素樣生長(zhǎng)因子1的影響〔J〕．中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010; 14(15) : 2756-60．

3郭義.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)〔M〕．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2008: 416．

4陳波，江瑜，張小珊，等.機(jī)體非神經(jīng)組織力學(xué)敏感細(xì)胞的研究與針推治療作用機(jī)理的新思考〔J〕．貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012; 34 (1) : 9-12．

5余安勝，趙英俠，嚴(yán)振國(guó)，等.21世紀(jì)“穴位”的形態(tài)研究展望〔J〕．上海針灸雜志，2000; 19(增刊) : 1-2．

6原林，焦培峰，唐雷，等.中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)-結(jié)締組織筋膜和自體監(jiān)控體系〔J〕．中國(guó)基礎(chǔ)科學(xué)，2005; (3) : 44-8．

7 Roberts GC，Critchley DR.Structural and biophysical properties of the integrin-associated cytoskeletal protein talin〔J〕．Biophys Rev，2009; 1(2) : 61-9.

8 Vogel V，Thomas WF，Graig D，et al.Structural insights into the mechanical regulation of molecular recognition sites〔J〕．Trends Biotechnol，2001; 19(10) : 416-24．

9 Hynes RO.lntegrins: bidirectional，allostric sigaling machines〔J〕．Cell，2002; 110(6) : 673-87．

10Ingber DE.Mechanobiology and diseases of mechanotransduction〔J〕．Ann Med，2003; 35(8) : 564-77．

11楊慶，王興桂，李程，等.基本機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)腧穴筋膜成纖維細(xì)胞力感受器分子整合素α1，α3亞基表達(dá)影響研究〔A〕．中國(guó)針灸學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)針灸經(jīng)絡(luò)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集〔C〕; 2012: 18-21．

12向生光，胡維新.增殖細(xì)胞核抗原PCNA在DNA修復(fù)中的作用〔J〕．生命的化學(xué)，2009; 29(4) : 472-6．

13邱小忠，李小娜，余磊，等.周期性機(jī)械拉伸對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖的影響〔J〕．中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2006; 24(2) : 183-5．

14蘆源，任寶琴，張鷗.針刺對(duì)老齡大鼠皮膚老化影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕．針灸推拿醫(yī)學(xué):英文版，2011; 9(3) : 137-41．

15張全學(xué)，楊林林，戴景興，等.拉伸應(yīng)力對(duì)疏松結(jié)締組織結(jié)構(gòu)與細(xì)胞活性的影響〔J〕．解剖學(xué)雜志，2009; 32(3) : 391-4．

〔2015-01-26修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:陳波(1974-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，主要從事針灸推拿的基礎(chǔ)與臨床運(yùn)用研究。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No．81160456)

〔中圖分類號(hào)〕R245.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4442-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.010