費洪新　高　音　孫麗慧　廉　潔　李　林(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

黃芪多糖對阿爾茨海默病小鼠海馬組織的影響

費洪新高音孫麗慧廉潔李林
(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討黃芪多糖(APS)對阿爾茨海默病(AD)模型小鼠的影響。方法小鼠隨機分成對照組、模型組、吡拉西坦組、APS高、中、低劑量組(800、600、200 mg·kg－1·d－1)。采用Aβ1～42雙側(cè)腦室注射小鼠誘導(dǎo)AD模型。灌胃時各組給予等體積的藥物或生理鹽水，持續(xù)28 d。采用Morris水迷宮測試行為學(xué)指標(biāo)并觀察小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，觀察小鼠海馬組織的鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)、腦和脾臟的臟器指數(shù)，檢測小鼠腦組織含水量和伊文氏藍(EB)含量，采用雙抗體夾心法測定海馬組織β-淀粉樣蛋白(Aβ)和白介素(IL) -6水平。結(jié)果與模型組比較，APS高、中、低劑量組能明顯改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力(P＜0.05)，明顯改善海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，升高腦和脾臟臟器指數(shù)(P＜0.05)，降低腦組織含水量和EB含量(P＜0.05)，降低海馬Aβ和IL-6水平(P＜0.05)。結(jié)論APS能改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低AD模型小鼠血腦屏障破壞程度。APS通過抑制Aβ和IL-6蛋白水平而在AD治療中發(fā)揮作用。

〔關(guān)鍵詞〕黃芪多糖;阿爾茨海默病;海馬組織

第一作者:費洪新(1978-)，男，在讀博士，講師，主要從事老年性癡呆、痛風(fēng)、腫瘤研究。

Effect of astragalus polysaccharides on the hippocampal tissue in Alzheimer＇s disease mouse

FEI Hong-Xin，GAO Yin，SUN Li-Hui，et al.
Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China

【Abstract】Objective To explore the effect of astragalus polysaccharides (APS) on the hippocampal tissue in Alzheimer＇s disease (AD) model mouse．Methods Mouse were randomly divided into control，model，piracetam，APS high-dose(800 mg·kg－1·d－1)，middledose(400 mg·kg－1·d－1)，low-dose (200 mg·kg－1·d－1) groups．Aβ1～42was injected into the bilateral hippocampus to induce AD models．The Morris water maze was used to observe the learning and memory ability．After the treatment，all animals were sacrificed，morphology of hippocampus was observed，the calculated the organ coefficients of brain and splenic organ were measured，water content and EB level were observed．Biochemical methods were used to determine the contents of Aβ and IL-6 in hippocampal tissue．Results Compared with those of model group，the learning and memory abilitise of APS groups were significantly improved(P＜0．05)，the number of nerve cells was significantly increased，the organ coefficients of brain and splenic organ were significantly increased(P＜0．05)，the water content and EB level were significantly decreased(P＜0．05)，the contents of Aβ and IL-6 were significantly decreased(P＜0．05)．Conclusions APS could improve the abilities of learning and memory of AD model mouse．APS could maintain normal morphological structure of nerve cells of AD mice．APS should depress the damage of blood brain barrier in AD mouse．APS plays a certain role in the treatment of AD through inhibiting Aβ and IL-6．

【Key words】Astragalus polysaccharides; Alzheimer＇s disease; Hippocampal tissue

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理變化是海馬組織出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)目減少及面部老年斑(SP)的形成〔1〕。SP的核心成分是β-淀粉樣蛋白(Aβ)，Aβ大量沉積后在海馬區(qū)出現(xiàn)Aβ的物質(zhì)團塊，同時出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生白介素(IL) -6等炎癥因子，進一步刺激Aβ產(chǎn)生，導(dǎo)致Aβ含量劇增，引發(fā)AD〔2〕。黃芪是一種常用的中藥，黃芪多糖(APS)是黃芪的主要成分之一，作用十分廣泛，包括提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔3〕、降低老年早期糖尿病腎病腫瘤壞死因子(TNF) -α及IL-6的水平〔4〕、降低腎小球腎炎大鼠血IL-6的水平〔5〕，還有增強機體免疫、強心降壓、抗氧化〔6〕等功能。但APS對AD模型小鼠的實驗研究國內(nèi)外未見報道，基于此，本課題開展APS對AD小鼠行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、血腦屏障通透性、Aβ及IL-6影響的研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物42只雄性8周齡清潔級C57BL/6小鼠，體重(23±2) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號: SCXK(京) 2012-0001。在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心常溫、常濕飼養(yǎng)，動物自由攝取食物和飲用水。

1.2主要藥物及其儀器藥物:吡拉西坦，批號130325，購于湖南迪諾制藥有限公司; Aβ、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒，批號20140401，南京建成生物工程研究所生產(chǎn); Aβ1～42購于Sigma公司; APS購于南京澤朗醫(yī)藥科技集團公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器: Morris水迷宮，安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司;電子天平，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司; 6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀，美國RT公司; Leica-2135切片機，德國Leica公司; TGL-16G臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠; TCNAI-G2型透射電子顯微鏡，荷蘭公司等。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型的復(fù)制小鼠水合氯醛麻醉后，用微量加樣器向雙側(cè)腦室一次性注入5 μl凝聚態(tài)Aβ1～42(80 pmol/μl)，針頭留置2 min后包扎。對照組雙側(cè)腦室注射等量生理鹽水。

1.3.2動物分組及給藥小鼠隨機分對照組、模型組、吡拉西坦組、APS高、中、低劑量組，每組7只。對照組、模型組小鼠給予生理鹽水灌胃、吡拉西坦組給予吡拉西坦620 mg·kg－1·d－1灌胃、APS高、中、低劑量組分別給予APS 800、400、200 mg· kg－1·d－1灌胃，灌胃時間均為28 d。

1.3.3Morris水迷宮檢測AD小鼠定位航行能力Morris儀器水深20 cm，水溫(23±2)℃，平臺放于第四象限，沒于水下1 cm，第1～4天為訓(xùn)練時間，每次訓(xùn)練60 s。第5天為測試時間，觀察小鼠到達平臺位置的潛伏期時間，以此來衡量小鼠的定位航行能力，反映小鼠學(xué)習(xí)能力指標(biāo)。

1.3.4Morris水迷宮檢測AD小鼠空間探索能力訓(xùn)練過程同上，在第5天時撤去平臺，檢測在60 s內(nèi)小鼠找到平臺的游泳距離衡量小鼠的空間探索能力，反映小鼠記憶能力。

1.3.5HE染色檢測海馬組織結(jié)構(gòu)將小鼠用水合氯醛麻醉，迅速開胸，暴露心臟，剪開右心耳，左心室迅速灌注100 ml生理鹽水，用4％多聚甲醛緩慢勻速灌注固定，斷頭取海馬組織固定于4％多聚甲醛之中。制備石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織結(jié)構(gòu)。

1.3.6透射電鏡檢測海馬組織結(jié)構(gòu)向各組小鼠心臟灌注戊二醛后，取小鼠海馬組織，用戊二醛、四氧化鋨固定、脫水、包埋、切片后，用電子顯微鏡觀察海馬組織結(jié)構(gòu)。

1.3.7小鼠臟器指數(shù)測定實驗結(jié)束后，各組小鼠迅速斷頭處死，取小鼠腦、脾臟，用電子天平稱取臟器質(zhì)量，計算腦、脾臟的臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(mg/g) =臟器質(zhì)量(mg) /體重(g)。

1.3.8腦組織含水量的測定在腦組織稱重后，去除小腦和腦干，吸去表面液體，在電子天平上稱量腦組織重量計為腦組織濕重;用電熱恒溫箱(52℃)烘烤3 d，再次稱量，此時小鼠腦組織重量為腦組織干重。腦組織含水量(％) = (腦組織濕重－腦組織干重) /腦組織濕重×100％。

1.3.9腦組織伊文氏藍(EB)含量的測定向小鼠尾靜脈注射2％EB，水合氯醛麻醉，心臟灌注生理鹽水70 ml，冰臺上迅速解剖，取腦組織，放入甲酰胺溶液內(nèi)浸泡，45℃避光孵育72 h，勻漿，5 000 r/min離心10 min。在酶標(biāo)儀上630 nm處測定上清液吸光度值(A)。根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)曲線求出EB含量，EB含量(μg/g)用EB濃度/腦濕重來表示。

1.3.10海馬組織Aβ和IL-6含量的測定各組小鼠斷頭后迅速取海馬組織，勻漿，靜置，離心，取上清液，分裝，－20℃保存。按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進行操作，在450 nm波長處測定各孔吸光度(A)，求得海馬組織Aβ和IL-6的含量。

2　結(jié)果

2.1APS對AD小鼠定位航行能力及空間探索能力的影響與對照組比較，模型組小鼠潛伏期及游泳距離明顯增加(P＜0.05) ;與模型組比較，吡拉西坦組、APS高、中、低劑量組小鼠潛伏期及游泳距離明顯縮短(P＜0.05)。見表1。

表1　APS對AD小鼠潛伏期、游泳距離的影響(±s，n=7)

表1　APS對AD小鼠潛伏期、游泳距離的影響(±s，n=7)

與模型組比較: 1) P＜0.05;下表同

組別　　潛伏期(s)　　游泳距離(cm)對照組　15.94±9.031)　538.90±87.221)模型組　41.46±10.16　1257.20±137.59吡拉西坦組　21.49±9.161)　760.96±166.061)APS高劑量組　28.06±6.411)　837.57±59.151)APS中劑量組　26.51±6.221)　802.14±61.131)APS低劑量組　23.04±3.471)　770.11±85.721)

2.2APS對AD小鼠海馬組織CA3區(qū)HE染色的影響對照組海馬組織CA3區(qū)神經(jīng)元分布均勻，細(xì)胞4～5層，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富;模型組神經(jīng)元2～3層，排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)較少;吡拉西坦組神經(jīng)元萎縮較少，細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞質(zhì)染色深; APS高、中、低劑量組神經(jīng)元萎縮較少、細(xì)胞3～4層、排列比較規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)比較清晰(見圖1)。

圖1　小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

2.3APS對AD小鼠海馬組織CA3區(qū)超微結(jié)構(gòu)的影響對照組海馬組織CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)豐富，線粒體豐富，線粒體結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無異常結(jié)構(gòu);模型組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器較少，線粒體腫脹，線粒體呈現(xiàn)圓形或者橢圓形;吡拉西坦組海馬神經(jīng)元細(xì)胞器較多，線粒體輕度腫脹，核膜清晰; APS高、中、低劑量組海馬神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，核膜清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常(見圖2)。

2.4APS對AD小鼠腦、脾臟臟器指數(shù)的影響與對照組比較，模型組小鼠腦、脾臟的臟器指數(shù)明顯降低(P＜0.05) ;與模型組比較，吡拉西坦組、APS高、中、低劑量組小鼠腦、脾臟的臟器指數(shù)明顯升高(P＜0.05)。見表2。

2.5APS對AD小鼠腦組織含水量的影響與對照組〔(72.57±2.07) ％〕比較，模型組小鼠腦組織含水量〔(84.14± 2.41) ％〕明顯升高(P＜0.05) ;與模型組比較，吡拉西坦組〔(76.00±2.16) ％〕、APS高、中、低劑量組小鼠腦組織含水量〔(74.86±3.02) ％、(75.86±3.34) ％、(75.00±2.94) ％〕明顯降低(P＜0.05)。

圖2　小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)改變(×16 500)

表2　APS對小鼠腦、脾臟臟器指數(shù)的影響(±s，n=7，mg/g)

表2　APS對小鼠腦、脾臟臟器指數(shù)的影響(±s，n=7，mg/g)

組別　　腦　　脾臟對照組　8.25±0.191)　3.21±0.251)模型組　7.63±0.23　2.65±0.20吡拉西坦組　8.12±0.181)　3.06±0.161)APS高劑量組　8.07±0.221)　3.01±0.211)APS中劑量組　7.91±0.221)　2.93±0.221)APS低劑量組　7.90±0.191)　3.04±0.211)

2.6APS對AD小鼠腦組織EB含量的影響與對照組〔(0.90±0.14)μg/g〕比較，模型組小鼠腦組織EB含量〔(2.15±0.39)μg/g〕明顯升高(P＜0.05) ;與模型組比較，吡拉西坦組〔(1.24±0.32)μg/g〕、APS高、中、低劑量組小鼠腦組織EB含量〔(1.32±0.41)μg/g、(1.32±0.17)μg/g、(1.27± 0.19)μg/g〕明顯降低(P＜0.05)。

2.7APS對AD小鼠海馬組織Aβ和IL-6表達的影響與對照組比較，模型組小鼠海馬組織Aβ和IL-6含量明顯升高(P＜0.05) ;與模型組比較，吡拉西坦組、APS高、中、低劑量組海馬組織Aβ和IL-6含量明顯降低(P＜0.05)。見表3。

表3　APS對各組小鼠海馬組織Aβ和IL-6表達的影響(±s，n=7)

表3　APS對各組小鼠海馬組織Aβ和IL-6表達的影響(±s，n=7)

組別　Aβ(ng/L)　IL-6(ng/ml)對照組　327.48±53.591)　5.70±0.411)模型組　482.11±53.16　7.38±0.31吡拉西坦組　346.05±51.871)　5.92±0.411)APS高劑量組　400.51±62.491)　6.27±0.211)APS中劑量組　398.99±66.671)　6.21±0.161)APS低劑量組　393.28±77.711)　6.09±0.131)

3　討論

AD是目前引發(fā)癡呆的最常見致病原因之一〔7〕。AD小鼠早期主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶能力減退〔8，9〕，因此本實驗采用水迷宮檢測小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，探尋與小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力相關(guān)的因子。

AD的發(fā)病機制極其復(fù)雜，許多蛋白質(zhì)參與了AD的發(fā)生和發(fā)展。AD發(fā)生的核心成分是Aβ，主要的細(xì)胞因子是IL-6、TNF-α、IL-1β等〔10，11〕。AD的研究有很多模型，如快速老化小鼠模型〔12〕、注射Aβ模型〔13〕等，但近年來很多研究者采用小鼠雙側(cè)腦室注射Aβ造模，以獲得快速準(zhǔn)確的結(jié)果。

本實驗結(jié)果顯示，模型組AD小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力減退，模型建立成功;小劑量APS對AD小鼠的治療有明顯效果且無劑量依存關(guān)系，各劑量均能明顯改善AD小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力。文獻報道海馬CA3區(qū)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)聯(lián)很大〔14〕，因此本研究測定海馬CA3區(qū)結(jié)構(gòu)。形態(tài)學(xué)觀察對照組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，無損傷，適宜為對照組。模型組神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，模型建立成功。經(jīng)過治療后，APS能明顯改善AD小鼠的海馬結(jié)構(gòu)，使其損傷減輕，甚至有不同程度的恢復(fù)。這些都提示APS對AD小鼠有一定療效和實用價值，為臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。而且，APS能明顯改善AD小鼠的腦、脾臟相對質(zhì)量，增強機體的抗感染能力，提示APS可恢復(fù)脾臟、腦的部分功能。

模型組小鼠腦組織含水量和EB含量明顯升高。當(dāng)機體水分過多，部分水分進入腦組織后，腦組織容易出現(xiàn)腦水腫，同時腦實質(zhì)結(jié)構(gòu)的重量就會減輕，腦組織血腦屏障的通透性增加; APS可明顯改善腦組織的水腫程度，改善腦組織血腦屏障的通透性，腦組織含水量的變化與腦、脾臟的臟器指數(shù)變化一致，提示腦組織炎癥反應(yīng)明顯的同時可伴有一定的腦組織水腫及血腦屏障通透性增加。

綜上所述，APS能改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能及海馬組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，減輕炎癥反應(yīng)，降低血腦屏障的通透性。同時，APS能夠通過抑制海馬Aβ和IL-6蛋白的水平，可在AD治療中發(fā)揮重要的作用，但具體的機制還待進一步研究。

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〔2014-09-19修回〕

(編輯郭菁)

通訊作者:高音(1969-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年性癡呆、腦損傷分子機制研究。

基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(81373777，81173599) ;教育部科學(xué)技術(shù)重點項目(210068)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4426-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.004