卞　華　呂　芹胡久略　毛秉豫　葉松山(南陽(yáng)理工學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南　南陽(yáng)　473004)

益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方對(duì)糖尿病腎病大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/Smads信號(hào)通路的影響

卞華呂芹1胡久略毛秉豫葉松山
(南陽(yáng)理工學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南南陽(yáng)473004)

〔摘要〕目的觀察益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) -β1/Smads信號(hào)通路的影響，探討其對(duì)DN的作用機(jī)制及治療效果。方法選擇50只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組10只，造模組40只。造模組大鼠接受單側(cè)腎切除手術(shù)2 w后，給予高糖高脂飲食4 w，再加用小劑量鏈脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射，造模組在DN模型成模后，隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組。中藥組給予益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方煎劑，西藥組給予貝那普利，治療8 w后處死大鼠。測(cè)定血糖、24 h尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐的變化，同時(shí)檢測(cè)腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，中藥組血糖、24 h尿蛋白量、血尿素氮及肌酐均顯著降低(P＜0.01)，TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)下調(diào)，Smad7蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論在DN大鼠模型中，益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方能夠改善腎功能，保護(hù)腎組織，調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路是其作用機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕糖尿病腎病;益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) -β1; Smad蛋白

1南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校中醫(yī)系

第一作者:卞華(1973-)，男，副教授，博士，主要從事中醫(yī)藥治療內(nèi)分泌疾病的研究。

糖尿病腎病(DN)的主要病理表現(xiàn)為腎小球肥大，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增生，腎小球系膜區(qū)增寬及毛細(xì)血管基底膜增厚，最后進(jìn)展至腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。研究表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) -β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔1，2〕。本文前期臨床研究顯示，益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方能改善DN患者血清TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP) -9及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP) -1水平，降低結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、Ⅳ型膠原水平而延緩DN的發(fā)展〔3，4〕。本研究旨在觀察益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方對(duì)DN大鼠TGF-β1/Smads信號(hào)通路的干預(yù)作用，以進(jìn)一步探討其對(duì)DN的治療作用及抗腎臟纖維化的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方煎劑，由黃芪、太子參、葛根、薏苡仁各30 g，生地黃、丹參各20 g，鬼箭羽15 g，絲瓜絡(luò)、白芥子、穿山甲各10 g等藥物組成，該方一劑共含生藥220 g，水煎濃縮后使藥液濃度相當(dāng)于生藥2.5 g/ml，2 000 r/min離心5 min，取上清液，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。貝那普利? 10 mg，北京諾華制藥有限公司，批號(hào)x1377。鏈脲佐菌素(STZ) (美國(guó)Sigma公司) ;血肌酐(Scr)試劑盒、血尿素氮(BUN)試劑盒(南京建成生物工程有限公司) ;兔抗大鼠TGF-β1抗體、山羊抗鼠磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)多克隆抗體、兔抗鼠Smad7單抗(美國(guó)Santa Cruz公司) ;辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗(美國(guó)KPL公司) ; BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce公司)。

1.2DN模型制備及分組〔5，6〕雄性SD健康成年大鼠，體重(220±10) g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(豫) 2010-0002。選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠50只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，分別檢測(cè)血糖、尿糖和尿蛋白均為陰性者用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取10只大鼠行左腎摘除假手術(shù)操作，作為正常組，其余40只大鼠行左腎摘除術(shù)，5萬(wàn)U青霉素腹腔沖洗并注射后縫合。手術(shù)后肌注2萬(wàn)U青霉素，共1 w。手術(shù)后2 w，正常組普通飼料喂養(yǎng)，其他各組給予高脂高糖飼料(60％普通飼料、10％的豬油、5％膽固醇、5％蛋黃粉和20％蔗糖)，隨日齡增加，投料相應(yīng)增多。4 w后，造模組大鼠一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，pH值4.2～4.5，配制成2％STZ溶液)，正常組大鼠一次性腹腔內(nèi)注射等體積不含STZ的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，以3次連續(xù)隨機(jī)尾靜脈血糖≥16.7 mmol/L，尿糖強(qiáng)陽(yáng)性()～()、尿量大于正常組的50％，24 h尿蛋白定量在30 mg以上者為DN造模成功。其中手術(shù)過程中意外死亡4只，2只大鼠血糖未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，剔除。造模組在DN模型成模后1 w，隨機(jī)分為模型組(11只)、西藥組(11只)、中藥組(12只)。DN模型成模1 w后開始給藥，正常組、模型組每天生理鹽水灌胃，西藥組予貝那普利1.0 mg·kg-1·d-1灌胃，中藥組予中藥煎劑22.9 g·kg-1·d-1灌胃，每日上午10∶00左右給藥1次，連續(xù)給藥8 w。實(shí)驗(yàn)期間，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.3生化指標(biāo)的檢測(cè)給藥結(jié)束后，取大鼠股動(dòng)脈血，分離血清，BECKMAN CX7全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖、Scr、BUN。24 h尿蛋白定量用雙縮脲法測(cè)定。

1.4TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白檢測(cè)Western印跡法檢測(cè)。收集的腎組織加入蛋白裂解液裂解，冰浴30 min。4℃10 000 r/min離心10 min，收集上清，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量，－70℃保存。取60 μg蛋白按常規(guī)方法進(jìn)行10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。按0.1 ml/cm2加入封閉液，室溫封閉2 h后，依次加入一抗(1∶1 000稀釋)，室溫下輕搖2 h，4℃孵育過夜。棄去反應(yīng)液，用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min;加入二抗(1∶2 000稀釋)，37℃孵育1 h，用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行顯色反應(yīng)，用Bio Rad-Image Lab全自動(dòng)電泳凝膠成像系統(tǒng)分析儀成像并對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行半定量分析，用β-actin作內(nèi)參照，以與β-actin的比值表示各組蛋白表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN變化情況的比較與正常組相比，模型組及兩治療組血糖、24 h尿蛋白定量、Scr、BUN均明顯增高(P＜0.01) ;與模型組相比，兩治療組24 h尿蛋白定量、Scr、BUN及中藥組血糖均明顯降低(P＜0.05，P＜0.01) ;與西藥組相比，中藥組血糖、24 h尿蛋白定量、Scr顯著降低(P＜0.01)。見表1。

2.2益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方對(duì)DN大鼠TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)的影響Western印跡檢測(cè)顯示，與正常組相比，模型組、西藥組、中藥組TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7表達(dá)水平均異常(P＜0.05，P＜0.01) ;與模型組相比，西藥組、中藥組TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)降低，Smad7表達(dá)升高(P＜0.01) ;與西藥組相比，中藥組TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)改善更明顯(P＜0.05)。見表2，圖1。

表1　各組大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN比較(±s)

表1　各組大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN比較(±s)

與正常組比較: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;與模型組比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01;與西藥組比較: 5) P＜0.05，6) P＜0.01，下表同

組別　n　　血糖(mmol/L)　　尿蛋白(mg/24 h)　Scr(μmol/L)　BUN(mmol/L)正常組模型組西藥組中藥組10 11 11 12 5.05±0.39 26.43±0.692)26.16±0.932)18.42±1.022) 4) 6)7.04±0.39 61.11±4.192)38.95±3.302) 4)34.75±3.362) 4) 5)45.44±5.46 137.56±5.682)89.43±6.672) 4)72.66±7.052) 4) 6)5.13±0.21 9.77±1.162)8.48±0.662) 3)8.22±0.562) 4)

表2　各組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)的變化(±s)

表2　各組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)的變化(±s)

組別　n　 TGF-β1　p-Smad2/3　Smad7正常組模型組西藥組中藥組10 11 11 12 0.212±0.035 0.804±0.0712)0.451±0.0622) 4)0.367±0.0421) 4) 5)0.189±0.014 0.795±0.0522)0.516±0.0372) 4)0.328±0.0251) 4) 5)0.511±0.042 0.176±0.0132)0.268±0.0322) 3)0.305±0.0262) 4)

圖1　Western印跡分析TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

3　討論

TGF-β1是導(dǎo)致DN的關(guān)鍵性因子，高血糖、血管緊張素Ⅱ、糖基化終末產(chǎn)物等是激活TGF-β1/Smads信號(hào)通路的重要因素〔7〕。TGF-β1活化后與其受體結(jié)合，通過Smads蛋白將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)腎小球及腎小管細(xì)胞肥大，促進(jìn)ECM積聚，抑制ECM的降解，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化〔8〕。

Smads作為TGF-β1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞分子，調(diào)控細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化型和輔助型Smad蛋白是正調(diào)控分子，而抑制型Smad蛋白是負(fù)調(diào)控分子。Smad2、Samd3是活化型Smad蛋白，為TGF-β1下游調(diào)節(jié)因子，在DN動(dòng)物模型中均高表達(dá)，提示Smad2/Smad3在DN纖維化過程中起了重要作用〔9〕。Smad7為抑制型Smad蛋白，可與Smad2或Smad3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGF-β受體Ⅰ，抑制Smad2 /Smad3磷酸化及向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，增加泛素介導(dǎo)的TGF-β受體Ⅰ自身的降解，從而負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路。Smad7作為內(nèi)源性TGF-β1拮抗劑，抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路已得到公認(rèn)〔10〕。因此，抑制TGF-β1的產(chǎn)生和(或)活性，拮抗或阻斷TGF-β1/Smads信號(hào)途徑可以減輕實(shí)驗(yàn)性腎纖維化的進(jìn)展〔11〕。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方治療后，DN大鼠尿蛋白排泄減少，腎功能得到恢復(fù)，提示益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方具有抗纖維化作用，模型組TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)升高，表明存在TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。與模型組比較，中藥組TGF-β1、p-Smad2/3的表達(dá)有所下降，Smad7蛋白表達(dá)有所增強(qiáng)，說(shuō)明益氣養(yǎng)陰化濁通絡(luò)方能上調(diào)腎臟組織中Smad7蛋白的表達(dá)，抑制TGF-β1、p-Smad2/3的表達(dá)，從而抑制TGF-β1/ Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮抗DN腎臟纖維化的作用。

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〔2014-08-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目:河南省中醫(yī)內(nèi)科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科支撐課題(2012) ;河南省中醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心建設(shè)項(xiàng)目(2010)

〔中圖分類號(hào)〕R259

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4432-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.006