鄧遠斐 許達才 肖順華 趙 青*

(1廣州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510182； 2江蘇建康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系生化教研室，江蘇 南京 211800)

?

·論著·

大麻素WIN55,212-2對裸小鼠肝癌移植瘤及PPARγ表達的影響

鄧遠斐1許達才1肖順華2趙 青1*

(1廣州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510182；2江蘇建康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系生化教研室，江蘇 南京 211800)

目的:探討大麻素WIN55,212-2(WIN) 對裸小鼠肝癌移植瘤及過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)、c-myc表達的影響。方法：采用5 mg/kg的WIN對荷瘤裸小鼠進行瘤周皮下注射干預(yù)15 d，每3天測量1次瘤體體重和體積，計算腫瘤體積和抑瘤率。熒光定量PCR和Western blotting測定HepG2移植瘤中PPARγ和c-myc的表達情況。結(jié)果：WIN對HepG2細胞移植瘤具有抑制作用，抑瘤率為66.00%，熒光定量PCR結(jié)果顯示W(wǎng)IN抑制HepG2細胞移植瘤c-myc在mRNA水平的表達，促進HepG2細胞移植瘤PPARγ在mRNA水平表達。Western blotting 結(jié)果顯示W(wǎng)IN抑制HepG2細胞移植瘤c-myc在蛋白水平的表達，促進HepG2細胞移植瘤PPARγ在蛋白水平表達。結(jié)論：WIN能夠抑制HepG2細胞移植瘤的生長和c-myc的表達，并上調(diào)PPARγ的表達。

大麻素;WIN55,212-2;肝癌細胞;移植瘤;c-myc; PPARγ

大麻系統(tǒng)由大麻類物質(zhì)(cannaboids)及大麻素受體(cannabinoid receptor 1 and 2,CB1/2)組成，大麻類物質(zhì)主要有天然的△9-四氫大麻酚(△9-tetrahydrocannbinol,THC)、人工合成的大麻素WIN和內(nèi)源性大麻素AEA及JWH等。THC、JWH-015在HepG2和Huh7細胞中上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferactor-activated receptor gamma, PPARγ)表達，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。國外研究報道， WIN能激活PPARγ通路誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡[2]；本實驗室則發(fā)現(xiàn)， WIN能活化肝癌細胞PPARγ，抑制下游基因c-myc表達，進而抑制細胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡[3-5]。但大麻素WIN在體內(nèi)對HepG2移植瘤的作用及機制尚未見報道。本研究主要探討大麻素WIN對HepG2移植瘤生長的影響及可能的機制。

PPARγ在調(diào)節(jié)細胞生長、促進凋亡和抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展方面已越來越受到重視[6],而PPARγ及其配體是今后腫瘤治療的新靶點已成共識。但是, 目前大多數(shù)研究尚停留在細胞分子水平[7], 而對肝癌癌體內(nèi)作用的研究更未見報道。本實驗旨在探討WIN在肝癌裸小鼠移植瘤內(nèi)對PPARγ及其下游分子 c-myc的調(diào)控作用, 為進一步的臨床試驗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，多功能多色熒光成像系統(tǒng)(型號：VersaDoc MP 4000，美國 BIO-RAD公司)。BALB/c雄性裸鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，SPF級別，6周齡，體質(zhì)量18～20 g；PPARγ一抗購自美國Thermo公司；β-actin一抗、c-myc一抗購自proteintech group；SYBR?PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)、PrimeScript?RT-PCR Kit試劑盒購自日本TaKaRa；二亞基甲砜(dimethyl sulfoxide,美國DMSO)、大麻素WIN、Cremophor購自美國Sigma；RIPA裂解液(中)購自上海碧云天。熒光定量PCR的引物由上海生工生物工程有限公司合成，GAPDH的正向引物：5′-TGGAGAAGGCTGG GGCTCATTT-3′，反向引物：5′-TGGTGCAGGAGGCAT TGCTGAT-3′；c-myc的正向引物：5，-AGCGACTCT GAGGAGGAACAAG-3′，反向引物：5′-GTGGCACCT CTTGAGGACCA-3′；PPARγ的正向引物：5′-CCGTGGCCGCAGATTTGAAAGA-3′，反向引物：5′-AAGTTGGTGGGCCAGAATGGCA-3′。

1.2 方法

1.2.1 成瘤模型的建立 HepG2細胞于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的HepG2細胞，胰酶消化，PBS洗滌2次，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×107個/mL。15只BALB/c裸鼠，隨機分成兩組：成瘤組(n=12)和空白組(n=3)。成瘤組每只裸鼠接種HepG2細胞懸液100 μL(即細胞數(shù)為1×106個)于腹右側(cè)；空白組每只裸鼠在腹右側(cè)注射100 μL不含HepG2細胞的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。裸鼠接種HepG2細胞4 d后，分別用游標卡尺和天平測量腫瘤體積和裸鼠體重，每3天測量1次，成瘤過程中要密切關(guān)注裸鼠的飲食、活動情況。瘤塊體積的計算公式：V=a×b2×3.14/6(a為長徑，b為短徑)。

1.2.2 大麻素WIN對HepG2移植瘤的影響 稱量0.002 g WIN粉末溶解于100 μL DMSO中，配制成WIN溶液，按照WIN溶液體積∶Cremophor體積∶生理鹽水體積=1∶3∶6配制WIN注射液，而 DMSO注射液中用DMSO代替WIN溶液，其余成分不變。裸鼠接種HepG2細胞15 d后，把成瘤組裸鼠隨機分成兩組：WIN組(n=6)、對照組(n=6)。每天在WIN組瘤旁皮下注射WIN注射液，劑量為 5 mg/kg；對照組及空白組注射等體積DMSO注射液。連續(xù)注射15 d，每3天測量體重和瘤塊體積。頸椎脫臼處死小鼠，剝出完整瘤塊，稱量瘤塊的質(zhì)量，計算藥物WIN的抑瘤率，抑瘤率=(對照組平均瘤重-WIN組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.3 熒光定量PCR技術(shù)檢測腫瘤組織c-myc、PPARγ mRNA的表達 提取WIN組和對照組瘤塊的總RNA，按照試劑盒要求操作。定量PCR采用的體系為20 μL,反應(yīng)條件：①95℃ 10min(循環(huán)數(shù)為1)；②95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s(循環(huán)數(shù)為40)；③95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s(循環(huán)數(shù)為1)。熒光定量PCR結(jié)果判定：△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對照組，RQ(Relative Quantitation)處理組=2-△△Ct，其中對照組RQ值設(shè)為1。以GAPDH為內(nèi)參，依據(jù)2-△△CT法計算各mRNA的相對表達量。

1.2.4 Western blotting檢測腫瘤組織中c-myc、PPARγ蛋白的表達 提取WIN組及對照組瘤塊的蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，以一抗在4 ℃孵育過夜。孵育一抗后洗膜3次，以二抗在室溫下孵育1 h，洗膜3次后進行ECL化學(xué)發(fā)光檢測，在多功能多色熒光成像系統(tǒng)中拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示，多組比較采用單因素Dunnett方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組裸鼠的致瘤率

WIN組及對照組裸鼠均于接種HepG2細胞4 d后明顯成瘤，移植瘤模型成功建立，各組裸鼠致瘤率均為100%，無顯著差異。

2.2 大麻素WIN對裸鼠移植瘤生長的抑制作用

從模型建立至第15天，各組腫瘤體積無顯著差異，第16天起(即開始用WIN處理的第1天)，WIN組的皮下移植瘤生長速度顯著慢于對照組(P<0.05)，見圖1；WIN組皮下移植瘤體積和重量均顯著小于對照組(P<0.05)，見表1和圖2。WIN對肝癌HepG2裸鼠移植瘤有較明顯的生長抑制作用，且WIN對裸鼠移植瘤的抑瘤率為66.00%，見表1。

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1 WIN對HepG2移植瘤生長曲線的影響

表1 WIN對人肝癌細胞HepG2移植瘤的影響

注：與對照組比較，*P<0.05

注：A：實驗分組；B：成瘤組裸鼠HepG2移植瘤大小

圖2 各實驗組裸鼠HepG2移植瘤的大小

2.3 WIN抑制HepG2移植瘤中c-myc mRNA表達及上調(diào)PPARγ mRNA表達

熒光定量PCR的結(jié)果顯示， WIN組c-myc mRNA表達水平低于對照組，WIN抑制了c-myc mRNA的表達(P<0.05)，具有下調(diào)作用；WIN組PPARγ mRNA表達水平高于對照組(P<0.05)，促進了PPARγ mRNA的表達，具有上調(diào)作用,見圖3，4。

2.4 大麻素WIN抑制HepG2移植瘤c-myc蛋白表達，上調(diào)PPARγ蛋白表達

Western blotting結(jié)果顯示，c-myc蛋白在WIN組中的表達水平比對照組低，而PPARγ蛋白在WIN組中的表達水平比對照組高，見圖5。用Quantity One軟件計算各條帶的灰度值，結(jié)果顯示，WIN抑制了c-myc蛋白的表達，具有下調(diào)作用(P<0.05)，而促進了PPARγ蛋白的表達，具有上調(diào)作用(P<0.05)，見圖5。

圖3 WIN對HepG2移植瘤 c-myc、PPARγ mRNA熔解曲線(上)、擴增曲線(下)的影響

圖4 WIN對HepG2移植瘤 c-myc、PPARγ mRNA表達的影響

注：對照組比較，*P<0.05

注：對照組比較，*P<0.05

圖5 WIN對HepG2移植瘤中c-myc和>PPARγ蛋白表達的影響

3 討 論

大麻早在幾個世紀前就作為草藥，用來治療疾病，大麻類藥物具有止痛、鎮(zhèn)靜、抗痙攣、抗嘔吐、抗青光眼、抗驚厥等藥理作用。近年來，大麻類藥物的抗腫瘤作用倍受關(guān)注[8]。天然大麻素由于依賴性、成癮性強，往往在化療的同時產(chǎn)生較嚴重的不良反應(yīng)，如精神依賴性，而人工合成大麻素WIN的依賴性、成癮性弱，具有抗腫瘤藥物的潛能[9]。

研究表明，植物大麻素及內(nèi)源性大麻素在不同的腫瘤細胞株中發(fā)揮抗增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用[10-14]，這激起了科學(xué)工作者對合成大麻素生物活性研究的興趣，也表明了大麻素WIN是一種有前途的藥物。在最近的研究中，本組首先發(fā)現(xiàn)大麻素WIN以濃度依賴性和時間依賴性的方式抑制BEL7402肝癌細胞增殖并且誘導(dǎo)其凋亡，本組還發(fā)現(xiàn)大麻素WIN的促凋亡作用能夠被PPARγ拮抗劑GW9662減弱，這表明PPARγ介導(dǎo)WIN所誘導(dǎo)的凋亡作用[3]。眾所周知，大麻素WIN是大麻素受體CB1/CB2激動劑。PPARγ是核激素受體超家族的配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。本組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在BEL7402肝癌細胞中，WIN顯著上調(diào)PPARγ的表達，但CB2受體選擇性拮抗劑AM630能夠阻斷WIN的這種誘導(dǎo)作用，表明CB2介導(dǎo)WIN對PPARγ誘導(dǎo)的表達。凝膠電泳結(jié)果顯示，WIN可促進該細胞中PPARγ與DNA結(jié)合，這進一步說明WIN通過激活PPARγ來調(diào)控細胞增殖、凋亡相關(guān)基因的表達。實際上，WIN以時間依賴性的方式抑制重要癌基因c-myc的表達，而PPARγ拮抗劑GW9662能夠阻斷這種抑制作用。總之，本組前期研究結(jié)果表明，WIN能夠通過線粒體caspase信號通路及PPARγ的介導(dǎo)來抑制肝癌細胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，但在體內(nèi)WIN是否能夠抑制肝癌的增殖尚未見報道。

PPARγ是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子, 為核激素受體超家族中的成員。許多研究表明, 在人類的多種腫瘤細胞中均存在PPARγ的表達, 如肝癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、脂肪肉瘤及前列腺癌等, 并對細胞增殖、分化及凋亡具有調(diào)節(jié)作用。國內(nèi)外已有大量研究證實,PPARγ配體能上調(diào)PPARγ的表達[7], 而此結(jié)論在本組前期細胞水平的研究結(jié)果中也得到證實[3]。但在體內(nèi)WIN是否能夠通過PPARγ的介導(dǎo)來抑制肝癌細胞的增殖尚未見報道。本研究觀察到WIN能上調(diào)核受體PPARγ的表達, 抑制了c-myc的表達，并顯現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性,結(jié)合前期體外研究結(jié)果，本組推測，WIN可能是通過激活核受體來實現(xiàn)其抗腫瘤活性的。

WIN能夠抑制肝癌細胞移植瘤生長，此效應(yīng)可能與WIN上調(diào)PPARγ的表達水平，進而下調(diào)c-myc的表達水平有關(guān)。其機制有待于進一步研究。隨著研究的深入, PPARγ必將成為腫瘤治療的新切入點, 而WIN也將成為肝癌治療的新選擇。

[1] Vara D, Morell C, Rodríguez-Henche N, et al. Involvement of PPARγ in the antitumoral action of cannabinoids on hepatocellular carcinoma[J]. Cell Death Dis,2013,4(5)：e618.

[2] Michela G, Ornella P,Patrizia P, et al. Apoptosis induced in HepG2 cells by the synthetic cannabinoid WIN:Involvement of the transcription factor PPARgama [J]. Biochimie, 2009, 91(4)：457-465.

[3] Hong YH, Zhou YT, Wang Y, et al. PPARγ mediates the effect of WIN55, 212-2, an synthetic cannabinoid, on the proliferation and apoptosis of the BEL7402 hepatocarcinoma cells [J]. Mol Bio Rep, 2013, 40(11)：6287-6293.

[4] 王 映, 周于婷, 趙 青. 大麻受體激動劑WIN-55,212-2對肝癌細胞HepG2增殖和凋亡的影響[J]. 細胞與分子免疫學(xué)雜志, 2010, 26(4)：344-347.

[5] 朱曉琴,周于婷,陳新美,等.大麻受體激動劑THC抑制肝癌細胞HepG2增殖和誘導(dǎo)其凋亡的實驗研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2010,39(3)：376-380.

[6] 夏學(xué)巍,蘇長保.PPARγ受體激動劑抗腫瘤作用機制研究進展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2005,25(12)：1109-1113.

[7] Paniqrahy D, Huanq S, Kieran MW, et al. PPARgama as a therapeutic target for tumor angiogenesis and metastasis [J].Cancer Biol Ther, 2005, 4(7)：687-693.

[8] Cridqe BJ, Rosenqren RJ. Critical appraisal of the potential use of cannabinoids in cancer management[J]. Cancer Manaq Res, 2013, 5：301-313.

[9] Amchova P, Kucerova J, Giuqliano V, et al. Enhanced self-administrantion of the CB1 receptor agonist WIN55, 212-2 in olfactory bulbectomized rats:evaluation of possible serotonergic and dopaminergic underlying mechanism[J]. Front Pharmacol, 2014, 5：44.

[10] Hermanson DJ, Marnett LJ. Cannabinoids, endocannabinoids, and cancer[J]. Cancer Metastasis Rev, 2011, 30(3-4)：599-612.

[11] Calvaruso G, Pellerio O, Notaro A, et al. Cananbinoid-associated cell death mechanism in tumor models [J]. Int J Oncol, 2012, 41(2)：407-413.

[12] Pertwee RG. Receptors and channels targeted by synthetic cannabinoid receptor agonists and antagonist[J].Curr Med Chem, 2010, 17(14)：1360-1381.

[13] Pertwee RG. Pharmacological actions of cannabinoids[J]. Handb Exp Pharmacol, 2005, (168)：1-51.

[14] Kumar RN, Chambers WA, Pertwee RG. Pharmacological actions and therapeutic uses of cannabis and cannabinoids [J]. Anaesthesia, 2001, 56(11)：1059-1068.

(本文編輯:張輝)

·醫(yī)學(xué)新聞·

我國3D打印髖關(guān)節(jié)進入“量產(chǎn)”時代

據(jù)科技日報報道，我國首個3D打印人體植入物——人工髖關(guān)節(jié)產(chǎn)品獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊批準。該產(chǎn)品也是國際上首個通過臨床驗證后獲得注冊的3D打印人工髖關(guān)節(jié)假體，標志著我國3D打印植入物已邁進產(chǎn)品化階段。

本次獲得注冊的人工髖關(guān)節(jié)產(chǎn)品屬于三類骨科植入物，是我國監(jiān)管等級最高的醫(yī)療器械產(chǎn)品，是由北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科張克、劉忠軍、蔡宏醫(yī)生和國內(nèi)最大的人工關(guān)節(jié)生產(chǎn)企業(yè)——北京愛康宜誠醫(yī)療器材股份有限公司合作研制的。

2009年，北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科關(guān)節(jié)組負責(zé)人張克教授帶領(lǐng)骨科關(guān)節(jié)組團隊將3D打印技術(shù)引入骨科，歷經(jīng)3年，研制出我國首個3D打印人工髖關(guān)節(jié)產(chǎn)品。該產(chǎn)品的臨床觀察工作由北京大學(xué)第三醫(yī)院牽頭，聯(lián)合北京積水潭醫(yī)院、北京大學(xué)人民醫(yī)院、山東大學(xué)第二醫(yī)院和武漢普愛醫(yī)院共同完成。2012年6月至今，共有32位患者接受了3D打印人工髖關(guān)節(jié)手術(shù)，臨床觀察效果良好。

曾主刀完成世界首例應(yīng)用3D打印技術(shù)人工定制樞椎治療寰樞椎惡性腫瘤的北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科主任劉忠軍教授指出，該產(chǎn)品的注冊成功，為患者提供了使用先進技術(shù)治療病痛的有效手段；產(chǎn)品國產(chǎn)化后將打破國外產(chǎn)品對高端市場的壟斷，大大降低價格，為患者節(jié)約大筆醫(yī)療支出；對推動整個3D打印產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展具有里程碑意義。

劉忠軍坦言，此次審批注冊成功，意味著3D打印植入物得到了認可，為同類產(chǎn)品獲批開辟了先河。后續(xù)研制的同類產(chǎn)品也有望加速獲到審批。

Effect of cannabinoid WIN55,212-2 on HepG2 tumor xenograft and PPAR-γ expression in nude mice

DengYuanfei1,XuDacai1,XiaoShunhua2,ZhaoQing1*

(1DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182;2DepartmentofBiochemistry,FacultyofPharmacy,JiangsuJiankangVocationalCollege,Nanjing211800,Jiangsu,China)

Objective:To investigate the effect of a cannabinoid, WIN55,212-2 (WIN), on HepG2 hepatocellular carcinoma xenografts and expression of peroxisome proliferators activated receptor (PPAR-γ) and c-myc in nude mice. Methods ：The tumor-bearing nude mice were injected subcutaneously around the tumor sites with 5 mg/kg WIN for 15 d. The weight and size of the tumor were measure every 3d for calculation of the tumor volume and tumor inhibition rate. PCR and western blotting assay were used to measure the expression of PPAR-γ and of c-myc in HepG2 tumor xenograft. Results：WIN showed inhibitory effect on the growth of HepG2 tumor xenograft, with an inhibition rate being 66.00%. Fluorescence quantitative PCR showed that WIN inhibited the expression of c-myc mRNA and promoted the expression of PPAR-γ mRNA in HepG2 tumor xenografts. Western blotting analysis showed that WIN inhibited the expression of c-myc proteins and promoted the expression of PPAR-γ proteins in HepG2 tumor xenografts. Conclusion：WIN may inhibit the growth of HepG2 tumor xenograft and c-myc expression, and upregulate the expression of PPAR-γ.

cannabinoid; WIN55,212-2; hepatocarcinoma cell; tumor xenograft; c-myc; PPAR-γ

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.001

國家自然科學(xué)基金(81372466)

鄧遠斐(1990-)，女，碩士,助理研究員。

R735.7

2095-9664(2015)05-0001-05

2014-12-22)

研究方向：惡性腫瘤分子靶向治療研究工作。

*通訊作者：E-mail：zhaoqing66@yahoo.com