陳法江 何麗姍 李康蘭 楊 婭 羅健東

( 廣州醫(yī)科大學藥理教研室， 廣東 廣州 510182)

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·論著·

小鼠急性心肌梗死后IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3甲基腺嘌呤的影響

陳法江 何麗姍 李康蘭 楊 婭 羅健東*

( 廣州醫(yī)科大學藥理教研室， 廣東 廣州 510182)

目的:探討小鼠急性心肌梗死(AMI)后炎癥因子IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3-甲基腺嘌呤對心肌炎癥因子IL-1β和IL-6釋放的影響。方法：雄性C57BL/6小鼠隨機分成四組：假手術組、AMI 1 d組、AMI 7 d組、AMI 21 d組，用超聲心動儀檢測心功能變化，用熒光定量PCR法、ELISA法和免疫組化法測量血清和心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的變化，用免疫蛋白印跡方法檢測心肌組織IL-1β轉換酶caspase-1蛋白的變化情況。在AMI 后給予3-甲基腺嘌呤7 d，用超聲心動儀檢測心功能變，用ELISA法和免疫組化法測量心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的變化情況。結果：小鼠冠狀動脈左前降支結扎術后7、21 d心功能顯著下降。小鼠AMI 后炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA水平表達增加，在血清和心肌組織中蛋白含量增加(P<0.05)。小鼠AMI 后心肌中caspase-1蛋白表達增加(P<0.05)。3-甲基腺嘌呤加重小鼠AMI 7 d后心臟功能下降(P<0.05)，并促進炎癥因子IL-1β和IL-6的釋放(P<0.05)。結論：小鼠心肌損傷過程中炎癥因子IL-1β和IL-6表達增加，其機制可能跟AMI 后caspase-1的增加有關；3-甲基腺嘌呤加重AMI 后心功能的下降，其機制可能與促進炎癥因子釋放有關。

急性心肌梗死；3-甲基腺嘌呤；炎癥因子；白介素-1；白介素-6；半胱氨酸天冬氨酸酶-1

冠心病已成為人類死亡的首要原因，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中的急危重癥。目前臨床廣泛的救治手段是在治療窗內對閉塞的冠狀動脈進行血運重建，如經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈搭橋術，但是缺血造成心肌細胞炎癥等損傷導致心臟功能下降仍然是AMI臨床治療的重要障礙[1]。各種誘因導致的血栓形成阻斷冠脈血流引發(fā)AMI后異常激活炎癥反應系統(tǒng)，致IL-1β、IL-6等促炎因子分泌增多，共同參與心肌細胞肥大、心肌纖維化等病理過程，成為導致心肌進行性重構、心功能惡化的重要原因[2]。半胱氨酸天冬氨酸酶 (caspase)-1是caspase超家族的重要成員，能夠將IL-1β前體切割為具有活性的IL-1β，活性的IL-1β可激活下游NF-κB信號通路，促進IL-6等炎癥因子的釋放[3]，被認為與機體的炎癥反應和細胞凋亡有關。鑒于炎癥因子在AMI病程中扮演重要角色，本研究旨在觀察小鼠AMI后促炎因子的動態(tài)變化以及可能的相關機制，為臨床進一步認識AMI的病理生理過程提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性清潔級C57BL/6小鼠68只，體質量 24～26 g，由廣東省動物實驗中心提供，許可證：SCXK 粵 2008-0002。

1.2 主要試劑

3-甲基腺嘌呤購自美國Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce。蛋白電泳分子量(10～170kDa) 標記購自加拿大Fermentas。IL-1β抗體、IL-6抗體、caspase-1 抗體、GAPDH抗體、抗兔Ⅱ抗購自美國Santa Cruz。ELISA試劑盒購自深圳欣博盛。逆轉錄試劑盒購自日本Takara。SYBR?Green Ⅰ熒光定量試劑購自Roche。引物合成購自美國Invitrogen。其余試劑均為分析純產品。所用引物由美國Invitrogen公司根據設計合成，見表1。

表1 熒光定量PCR所用的引物

1.3 研究方法

1.3.1 分組 將小鼠隨機分成5組：假手術組(AMI 0d，n=10)：小鼠冠狀動脈左前降支(LAD)只穿線不結扎；AMI 1d組(n=16)：小鼠LAD進行結扎；AMI 7d組(n=16)：小鼠LAD進行結扎；AMI 21d組(n=16)：小鼠LAD進行結扎；AMI 7d+3-甲基腺嘌呤組(AMI 7d+3MA組，n=9)：小鼠LAD進行結扎后，給予3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)]。

1.3.2 小鼠AMI模型的建立[4]連接心電圖，氣管插管，連接小動物呼吸機，正壓通氣，頻率為 150次/min，呼吸氣時比為5∶4，潮氣量約 1.5 mL/kg。于左胸第3～4肋間開胸，暴露心臟。在左心耳與肺動脈圓錐間，以左冠狀動脈主干為標志，用8～0號縫線針穿刺結扎LAD。觀察心電圖，以心電圖Ⅱ導聯(lián)出現(xiàn) ST 段抬高及肉眼觀察結扎區(qū)域以下組織變白等心肌缺血表現(xiàn)確定為結扎成功的指標；結扎確實后，膨肺，逐層關胸。

1.3.3 超聲測量心功能 實驗結束進行M型超聲心動圖檢測。采用加拿大Visual Sonics產的Vevo2100高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)(RMV707B 探頭，頻率設置為23MHz或30 MHz，探測深度為10～15 mm)和連接高頻探頭西門子超聲儀。2%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定，左胸前化學脫毛膏脫毛，在胸廓表面涂抹超聲波導聲劑，探頭置于小鼠胸骨前，獲取胸骨旁長軸、短軸視野。左室短軸切面，于乳頭肌水平應用M型超聲記錄左心室運動曲線，測量左室舒張末期和收縮末期內徑 (left ventricular internal dimension，diastolic；left ventricular internal dimension,systolic； LVIDd和LVIDs)，左室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短軸縮短率(fractional shortening, FS)。

1.3.4 熒光定量PCR法檢測IL-1β、IL-6 mRNA的表達 根據Takara逆轉錄試劑盒合成cDNA，樣本按以下反應體系進行：總體積25 μL，其中SYBR?GreenⅠ12.5 μL，上游引物 F 0.5 μL，下游引物R 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，母版DNA1 μL。反應條件為，95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.3.5 細胞因子的測定方法 用酶聯(lián)免疫方法測定心肌組織和血清IL-1β、IL-6水平。步驟如下：①除空白孔外，分別將標本或不同濃度標準品(100 μL/孔) 加入相應孔中，用封板膠封住反應孔，36℃孵箱孵育90 min，洗板； ② 除空白孔外，加入生物素抗體工作液(100 μL /孔) 封住板孔，36℃孵箱孵育60 min，洗板； ③加入酶結合物工作液(100 μL /孔) 封住板孔，36℃孵箱孵育30 min，洗板；④加入顯色劑(100 μL /孔)，36℃避光顯色15 min；⑤加入終止液(100 μL /孔)，混勻即刻測量A450 值； ⑥在手工繪制的標準曲線上測出標本的濃度。

1.3.6 免疫組織化學 用免疫組織化學方法測定心肌IL-1β、IL-6水平。標本常規(guī)固定、 石蠟包埋后切片，免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀察心肌IL-1β、IL-6的表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 小鼠AMI7、21d后心臟功能下降

本實驗共準備68只雄性C57BL/6小鼠進行AMI手術。根據小鼠LAD結扎前后心臟結扎區(qū)域心肌顏色的變化情況和心電圖Ⅱ導聯(lián)ST段是否抬高來判斷手術是否成功。總體造模成功57只小鼠,成功率為83.82%。小鼠行LAD結扎1、7和21d后分別進行超聲心功能檢測,結果顯示AMI7、21d后小鼠心功能下降(P<0.05)，見圖1。

2.2 小鼠AMI1、7和21d后心肌IL-1β和IL-6mRNA表達增加

實驗結束后迅速取AMI周邊區(qū)于提取RNA進行熒光定量PCR實驗，結果顯示AMI1、7和21d后小鼠心臟組織IL-1βmRNA表達增加，而IL-6mRNA表達在AMI1d達到峰值，隨后下降，但與正常組相比仍具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖2。

注：A：M-模式圖典型代表團；B：左心室收縮末內徑、左心室舒張末內徑、射血分數和短軸縮短率的統(tǒng)計分析；與假手術組比較，*P<0.05

圖1 小鼠AMI后心臟功能變化情況

注：與假手術組比較，*P<0.05

圖2 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的mRNA水平

2.3 小鼠AMI 1、7 d后心肌和血清中IL-1β和IL-6表達增加

實驗結束后麻醉小鼠行主動脈取血并迅速取AMI周邊區(qū)進行ELISA法實驗，結果顯示AMI 1、7d后小鼠心臟組織和血清中IL-1β和IL-6表達增加(P<0.05)，見圖3。

2.4 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌IL-1β和IL-6 免疫組化結果

實驗結束后迅速取心臟固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋切片后進行免疫組化法檢測，結果顯示AMI 1、7、21 d后小鼠心臟組織IL-1β和IL-6表達增加。見圖4

注：與假手術組比較，*P<0.05

圖3 小鼠AMI后心肌和血清IL-1β和IL-6的含量

圖4 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的表達變化情況(×400)

2.5 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌caspase-1蛋白表達增加

實驗結束后迅速取AMI周邊區(qū)提取蛋白進行蛋白印跡法實驗，結果顯示AMI 1、7 d后小鼠心臟組織活化的caspase-1蛋白表達增加(P<0.05)，見圖5。2.6 小鼠AMI后給予3-甲基腺嘌呤后心功能下降，心肌細胞IL-1β和IL-6的表達增加

C57BL/6小鼠進行AMI手術后即腹腔注射3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)]，給藥7 d后進行進行超聲心功能檢測, 結果顯示，與AMI 7d組相比，給予3-甲基腺嘌呤7 d后小鼠心功能下降，LVIDs增加，EF、FS下降(P<0.05)，心肌細胞IL-1β和IL-6的表達增加(P<0.05)，見圖6，7。

注：與假手術組比較，*P<0.05

圖5 小鼠AMI后心肌活化的caspase-1蛋白的表達情況

注：與假手術組比較，*P<0.05

圖6 小鼠AMI并注射3-甲基腺嘌呤7 d后心臟功能變化情況

注：與AMI 7 d組比較，*P<0.05

圖7 3-甲基腺嘌呤促進小鼠AMI 7 d后心肌IL-1β和IL-6的表達

3 討 論

心肌缺血是威脅人類健康的常見心血管疾病。明確AMI的發(fā)病機制對于臨床治療具有重要的現(xiàn)實意義[5-6]。AMI的基本病因是冠狀動脈粥樣硬化斑塊的破裂、出血和血栓的形成，造成管腔嚴重狹窄或閉塞引起心肌血供不足或中斷[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著小鼠LAD結扎時間的增長，心臟功能逐漸下降。AMI后心輸出量的急劇減少引起機體和各組織器官血供減少，導致內環(huán)境失衡，產生大量自由基激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，使 IL -1β、IL -6等炎癥因子水平升高，并引起反應逐級放大，引起炎癥反應綜合征、加重心肌組織缺氧、功能障礙[9]。

Yuan等[10]在1993年發(fā)現(xiàn)IL-1β轉換酶(IL -1β converting enzyme, ICE)與秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)的死亡基因CED-3具有高度同源性，過表達該基因可以誘導細胞凋亡的發(fā)生，于是ICE后來被重新命名為caspase-1，故caspase-1也可以被稱為IL -1β轉換酶。caspase-1是以無活性的酶原形式(pro-caspase-1)存在于細胞質中，其分子量為45 kDa，其活化需要炎性平臺[11]。當機體受到各種病原體或其他刺激時細胞內會生成炎性體，該炎性體可以募集pro-caspase-1并形成相對局部高濃度，此時酶原自體水解，形成具有活性的caspase-1，后者通過促進炎癥因子IL-1β的加工和釋放而調控細胞的炎癥反應[3]。IL-1β是細胞內重要的促炎癥因子，與相應受體結合而激活下游的NF-κB信號通路，促進如IL-3、IL-5、IL-6等炎癥因子的釋放。

本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠AMI急性期(AMI 1d)和亞急性期(AMI 7d)心肌炎癥因子IL -1β、IL -6的mRNA和蛋白表達水平增加，釋放入血清中的炎癥因子IL -1β、IL -6也增加，但是在修復期(AMI 21d) 時IL -1β、IL -6的表達又明顯下降了，表明炎癥因子IL -1β、IL -6參與了AMI急性期和亞急性期的病理生理進展過程，而在修復期時炎癥對心肌重構的作用就減弱了。同時發(fā)現(xiàn)在小鼠AMI急性期和亞急性期心肌caspase-1前體表達下降，而有活性的caspase-1表達增加，而在修復期時活化的caspase-1表達減少。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠AMI后心臟活性caspase-1的表達與炎癥因子IL -1β、IL -6的表達具有一定的同步性，那么AMI后炎癥因子IL -1β、IL -6的增加與caspase-1信號通路的變化是否具有一定的因果關系，尚需進一步的研究探討。

本研究發(fā)現(xiàn)3-甲基腺嘌呤可以促使AMI后心臟功能的進一步惡化，同時進一步促進炎癥因子IL-1β和IL-6的表達，但是其機制尚不清楚。很多文獻報道3-甲基腺嘌呤可抑制自噬的水平[12]，有研究3-甲基腺嘌呤可以抑制III型PI3K或干擾Bcl-2和Beclin-1的表達[13]，發(fā)現(xiàn)因此3-甲基腺嘌呤加AMI后心功能的惡化，有可能與抑制自噬途徑有關，需要進一步進行試驗研究探討。

[1] Dargie H. Heart failure post-myocardial infarction:a review of the issue[J]. Heart, 2005;91(Suppl 2):ii3-ii6.

[2] Ferrari AU, Radaelli A, Centola M. Invited Review:Aging and the cardiovascular system[J]. J Appl Physiol, 2003, 95 (9):2591-2597.

[3] Kiichi Nakahira, Jeffrey Adam Haspel, Vijay AK Rathinam, et al. Autophagy proteins regulate innate immune response by inhibiting NALP3 inflammasome-mediated mitochondrial DNA release[J]. Nat Immunol,2011,12(3):222-230.

[4] Qing Xiao, Ning Hou, Yan-Ping Wang, et al. Impaired sonic hedgehog pathway contributes to cardiac dysfunction in type 1 diabetic mice with myocardial infarction[J]. Cardiovascular Research, 2012, 95 (11):507-516.

[5] 熊龍根, 陸東鳳, 劉世明, 等. 直接經皮冠狀動脈介入治療80歲以上急性心肌梗死患者的臨床評價[J]. 中華生物醫(yī)學工程雜志,2009, 15(5):398-401

[6] 王 峰. 青少年急性心肌梗死的原因分析[J]. 衛(wèi)生職業(yè)教育,2014, 32(23):145-148.

[7] Califf RM. The rationale for thrombolytic therapy[J]. Eur Heart J,1996; 17(supplE):2-8.

[8] Díaz R, Paolasso EA, Piegas LS, et al. Metabolic modulation of acute myocardial infarction. The ECLA (Estudios Cardiológicos Latinoamérica) Collaborative Group[J]. Circulation,1998, 98(21):2227-2234.

[9] Mouco OM, Nicolau JC, Souza TR, et al. Inflammatory markers of atherosclerotic plaque stabilization after acute coronary event temporal trends[J]. Arq Bras Cardiol, 2006, 87 (9):28-36.

[10] Yuan J, Shaham S, Ledoux S, et al. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1β-converting enzyme[J]. Cell,1993,75 (Suppl 1):641-652.

[11] Martinon F, Tschopp J. Inflammatory caspases:linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases[J]. Cell,2004,117(2):561-574.

[12] 陳興泳, 汪銀洲, 雷惠新, 等. 大鼠腦缺血再灌注后自噬的變化及燈盞生脈膠囊干預的影響[J]. 中國康復理論與實踐,2015,21(7):773-779.

[13] 孔曉霞, 張宏宇, 鐘加滕, 等. 自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神經膠質瘤U251細胞損傷中的作用[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(4):695-698.

(本文編輯:王馨)

·醫(yī)學新聞·

前列腺癌：非手術方法治療效果或許更好

據生物谷報道，一項由美國約翰霍普金斯大學Brady泌尿研究所完成的統(tǒng)計學研究表明，對于成年男性中那些非侵略性前列腺癌患者和由泌尿專家監(jiān)控病情的前列腺癌患者，其發(fā)展成為惡性前列腺癌的概率和死于癌癥的概率很低。這項研究分析了過去20年間，1298位參與“前列腺癌主動監(jiān)控”項目的成年男性患者中，僅有兩位死于前列腺癌和三位發(fā)展為了惡性前列腺癌。

這項研究的領導者、成年泌尿?？浦魅蜨. Ballentine Carter教授指出，通過他們的統(tǒng)計學數據，那些只患有非侵略性前列腺癌和長期處于醫(yī)生監(jiān)控監(jiān)控下的前列腺癌患者們的死亡率很低。雖然說，這個“前列腺癌主動監(jiān)控”項目的患者有的是被“精心選擇”過的，但是如果繼續(xù)這項研究，Carter教授認為結果也不會有太大變化。原因在于，三位死者中的兩位的死亡另有其他原因。同時，Carter教授也指出，這項研究是在高加索人種(白人)中完成的，可能并不適用于黑人，因為黑人的癌癥往往為惡性癌癥。

Effect of 3-methyl adenine on dynamic changes of IL-1β and IL-6 in mice with acute myocardial infarction

ChenFajiang,HeLishan,LiKanglan,YangYa,LuoJiandong

(DepartmentofPharmacology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

Objective:To investigate the dynamic changes of the inflammatory cytokines, interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 in mice after acute myocardial infarction (AMI) and the effect of 3-methyl adenine on the release of myocardial inflammatory cytokines IL-1β and IL-6.Methods:Male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups:sham operation group, AMI 1 day (AMI 1d) group, AMI 7 days (AMI 7d) group, and AMI 21 days (AMI 21d) group. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in serum and myocardial tissue by fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry, and IL-1β converting enzyme caspase-1 protein in myocardial tissue by Western blotting. All mice were given 3-methyl adenine for seven days after AMI. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in myocardial tissue by ELISA and immunohistochemistry. Results: The heart function in mice was significantly decreased at 7 and 21 d after left anterior descending coronary artery ligation. Increased mRNA expression levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6, and increased protein levels in serum and myocardial tissue were found in mice after AMI (P<0.05). The caspase-1 protein expression was increased in myocardial tissue in mice after AMI (P<0.05). 3-methyl adenine aggravated heart dysfunction in the AMI 7d group (P<0.05), and promoted the release of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 (P<0.05). Conclusion:In the process of myocardial injury, inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 expression are increased in mice. The mechanism may be associated with the increased caspase-1 after AMI. 3-methyl adenine aggravates heart dysfunction in mice after AMI, probably via the release of inflammatory cytokines.

acute myocardial infarction; 3-methyl adenine; inflammatory factor; interleukin-1;interleukin-6; caspase-1

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.002

國家自然科學基金資助項目(81173062)

陳法江(1989-)，男，碩士，助理研究員。

R363

2095-9664(2015)05-0006-06

2014-07-24)

研究方向：心血管藥理學。

*通訊作者:E-mail:jiandongluo@hotmail.com