徐 敏

（安順職業(yè)技術學院應用醫(yī)藥系，貴州安順561000）

沙棘總黃酮是胡頹子科沙棘屬沙棘的主要活性成分。沙棘別名醋柳、酸柳果，為落葉性小喬木或灌木［1-4］。沙棘在我國資源豐富，尤其是食用和藥用價值世界公認，因此合理開發(fā)沙棘資源，提高沙棘資源的附加值具有重要的意義［5］。沙棘的生態(tài)價值、營養(yǎng)價值和藥用價值都很高。沙棘是具有枝葉茂密、根系發(fā)達、生長迅速、抗干旱、御嚴寒、保持水土、防風固沙、改良土壤、適應性強等特點的優(yōu)質植物，其內含有蛋白質、糖類、脂類、維生素等多種營養(yǎng)物質。另外，沙棘因富含多種生物活性成分尤其是沙棘中的黃酮類化合物具有重要的藥用價值。沙棘總黃酮在心血管、消化、呼吸、抗腫瘤、抗衰老、提高機體免疫力等多方面具有治療優(yōu)勢，具有活血、養(yǎng)胃、健脾、利肺、祛痰等藥理功效，在臨床上有著廣泛前景及應用價值，并記載在古代的《月王藥珍》、《四部醫(yī)典》和《晶珠本草》等醫(yī)書中［6-7］。沙棘總黃酮還可吸收紫外線，有直接捕獲超氧自由基和羥基自由基的作用，對皮膚系統(tǒng)具有清除自由基、抗氧化、抗輻射、抗衰老的作用［8-9］。本實驗采用從一次利用后的高原沙棘果渣和籽渣中提取黃酮，通過對小鼠中波紫外線（UVB）輻射皮膚損傷模型的影響，初探其抗紫外線輻射的作用，以便為深度開發(fā)和綜合利用沙棘資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 KM 小鼠，雌性，42～56d，體質量22～25g，購自貴陽醫(yī)學院實驗動物中心，按清潔動物標準條件分籠喂養(yǎng)。

1.2 藥品及試劑 1%沙棘總黃酮提取物自制藥物；高原護膚霜由第二軍醫(yī)大學藥學院研制生產；6%硫化鈉，成都化學試劑廠；1%戊巴比妥鈉，北京普博斯生物科技有限公司；羥脯氨酸標準品由中國藥品生物制品檢定所提供；考馬斯亮藍蛋白測試、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒均是南京建成生物工程研究所產品。

1.3 方法

1.3.1 沙棘總黃酮的提取 沙棘除汁，晾干，用中藥粉碎機粉碎，60℃烘干12h，用超臨界CO2萃取裝置去油。稱取去油粉末100g，用超聲波以5倍體積的純水萃取1h，過濾得濾液Ⅰ；濾渣重復萃取，過濾得濾液Ⅱ；合并濾液Ⅰ、Ⅱ。60 ℃以下減壓蒸餾濃縮，然后加95%乙醇至60%醇沉，放置低溫過夜。過濾溶液，4 000r／min離心，取液體減壓蒸餾，回收乙醇，濃縮液體。冷凍干燥得20mg干粉，所得干粉即沙棘總黃酮給藥組的主要成分。

1.3.2 UVB輻射小鼠皮膚損傷模型的構建、分組設計、給藥途徑［10-14］小鼠注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，并把小鼠背部鼠毛剪短至1 mm，用配制好6%Na2S 液體脫掉面積約為5cm×5cm 的鼠毛。將已脫毛的小鼠分為4 組，每組10 只：正常對照組（正常組）﹑UVB照射組（模型組）﹑UVB照射＋高原護膚霜（陽性對照組）﹑ UVB照射＋1%沙棘總黃酮給藥組（沙棘總黃酮給藥組）。給予普通基礎顆粒飼料，每日1次。正常組不做UVB照射，模型組只做UVB 照射。陽性對照組和沙棘總黃酮給藥組的小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，皆為均勻的一層覆蓋涂抹給藥，10min后與模型組一起置于40w 紫外光源下（光源距小鼠皮膚垂直距離為35cm）UVB 輻射20 min（輻照強度為0.17mW／cm2，放射270～400nm 連續(xù)波譜，光譜集中在313nm）。持續(xù)相同時間輻射7d，第7天輻射結束后24h內，把小鼠背部脫毛區(qū)的皮膚取下，然后去除血液和皮下脂肪，并用生理鹽水漂洗，最后固定和冷凍保存以備用。

1.3.3 制作病理切片 將取材的部分皮膚組織，放入固定液（10%福爾馬林溶液）固定，石蠟包埋，用切片機切成薄片，一般為厚為4μm，用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.3.4 制備皮膚組織勻漿 用濾紙將取材的部分皮膚組織拭干稱取組織質量，加9倍的組織質量的預冷的勻漿介質放在冰上，并將組織充分剪碎進行勻漿，在冰浴中多次研磨以研碎皮膚組織，勻漿后皮膚組織用低溫高速離心機4 000r／min離心15min，取適量上清液待測。組織勻漿上清液中蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法（Bradford法）檢測，以牛血清清蛋白為標準繪制標準曲線。

1.3.5 SOD 活性的測定 SOD 活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法，具體測定按測試盒說明書進行。

1.3.6 MDA 量的測定MDA量的測定采用TBA法，具體測定按測試盒說明書進行。

1.3.7 膠原蛋白量的測定 膠原蛋白中的羥脯氨酸占其總氨基酸的13.4%［15］，分析其中羥脯氨酸的含量，可換算出膠原蛋白的量［16］。羥脯氨酸含量的測定用氯胺-T 法：即氯胺-T 作為氧化劑能把羥脯氨酸氧化，再用高氯酸終止氧化，最后加入對二甲氨基苯甲醛溶液生成紫紅色化合物進行比色測定；然后取不同量的羥脯氨酸標準品制作標準曲線；最后根據膠原蛋白量＝羥脯氨酸測定濃度／組織質量／0.134，計算出膠原蛋白的量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 實驗期間小鼠的皮膚形態(tài)學觀察 正常組小鼠皮膚各層細胞紋理清晰，有較薄的真皮層，有排列有序的波浪狀彈性纖維，未見盤曲打結、聚集成團的現象，有束狀定向疏松排列的膠原纖維，皮膚附屬器完整。模型組小鼠皮膚有層次增加的表皮細胞，有增厚的真皮層，有呈嗜堿性變、無定形、破壞、變粗、盤曲打結、聚集成團、甚至消失的彈性纖維，有不規(guī)則排列、粗大致密的膠原纖維，皮膚附屬器缺失。陽性對照組小鼠皮膚有呈結節(jié)狀或旋渦狀不規(guī)則排列、粗大致密的膠原纖維。沙棘總黃酮給藥組小鼠皮膚和模型組相比，表皮及其附屬器較完整，真皮層中彈性纖維破壞較小，有排列較規(guī)則的膠原纖維。見圖1。

圖1 各組小鼠皮膚組織HE染色（×100）

表1 UVB輻射后小鼠皮膚組織SOD、MDA 和膠原 蛋白含量變化（±s，n＝10）

表1 UVB輻射后小鼠皮膚組織SOD、MDA 和膠原 蛋白含量變化（±s，n＝10）

＃：P＜0.01，＊：P＜0.05，與正常組比較；△：P＜0.01，與模型組比較。

組別 SOD（U／mg） MDA（nmol／mg） 膠原蛋白含量（μg／mg）正常組84.25±7.87 1.82±0.33 1.26±0.10模型組 61.17±3.59＃ 3.19±0.45＃ 1.01±0.09＊陽性對照組 75.10±6.27△ 1.63±0.26△ 1.79±0.15△沙棘總黃酮給藥組 72.41±4.05△ 1.45±0.30△ 1.38±0.14△

2.2 小鼠皮膚組織SOD 活性測定結果 模型組小鼠經UVB輻射后，與正常組相比，皮膚組織中的SOD 活性極顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，陽性對照組和沙棘總黃酮給藥組SOD 的活性極顯著升高（P＜0.01）。見表1。

2.3 小鼠皮膚組織MDA 量的檢測結果 與正常組比較，模型組含MDA 的量多（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和沙棘總黃酮給藥組含MDA 的量少（P＜0.01）。見表1。

2.4 小鼠皮膚組織膠原蛋白量的測定結果 與正常組比較，模型組小鼠膠原蛋白的量降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和沙棘總黃酮給藥組較高（P＜0.01），而陽性對照組產生了增生性瘢痕。

3 討 論

本實驗選7dUVB輻射小鼠，展示UVB累加損傷皮膚的過程，客觀具體地模擬了生活中UVB對皮膚的損害。紫外線根據波段可分為長波紫外線 （UVA）、UVB、短波紫外線（UVC）。大量資料顯示，UVB 是預防皮膚光老化的重點［14］。所以，本實驗選擇UVB為主要波段的光源。本實驗通過UVB輻射小鼠來構建皮膚損傷模型，并把小鼠背部脫毛區(qū)的皮膚取下做組織病理切片，進行病理學觀察。模型組小鼠皮膚形態(tài)學變化明顯，表皮細胞層增加，真皮層增厚，說明成功造模，同時也驗證了長時間UVB 輻射可誘導皮膚的老化。紫外線引起的效應不是單個因素，而是多個因素的綜合。紫外線輻射，自由基增多，使構成細胞組織的糖類、脂類、蛋白質等大分子物質被氧化而受損，從而破壞細胞的結構和功能、組織構成，導致器官老化及病變。其中構成生物膜脂類成分中的多不飽和脂肪酸由于化學性質活躍，容易被自由基破壞而形成MDA 等脂類過氧化物。因此，MDA 的量是皮膚內脂類受過氧化損傷程度的標志，間接地反映出氧自由基的含量及細胞受損傷的程度［16］。本實驗中檢測MDA 的量，模型組比正常組極顯著增高，沙棘總黃酮給藥組比模型組極顯著降低，說明沙棘總黃酮在防紫外線抗氧化的作用中效果好。SOD 是人體不可缺少的一類重要的清除氧自由基的生物活性蛋白質，起到抗衰老作用，即催化并消除超氧陰離子，在維護體內自由基產生和清除的平衡中起著重要作用，故SOD 活性已成為抗衰老的重要指標［8］。本實驗中，沙棘總黃酮給藥組SOD 的活性極顯著升高，說明沙棘總黃酮可提高SOD 的活性，減少皮膚損傷，為今后阻止和解決UVB輻射誘導的皮膚老化問題提供了支撐。

人體中含量最豐富的膠原蛋白在皮膚組成成分中占有主導地位，可使皮膚維持張力和承受外界拉力，增加皮膚彈性和韌性，使皮膚充盈和豐滿。膠原蛋白是惟一含羥脯氨酸較多的蛋白質，因此，測定膠原蛋白的量可通過羥脯氨酸的量來確定。本實驗的檢測結果表明，沙棘總黃酮給藥組膠原蛋白的量比模型組極顯著的升高，說明沙棘總黃酮對皮膚中膠原的合成和分泌具有促進作用。陽性對照組膠原蛋白的量最高，并產生了增生性瘢痕。增生性瘢痕與膠原的代謝失平衡有關，瘢痕組織中膠原合成和降解都增加，但膠原合成超過降解，使其過度沉著，由此產生了瘢痕增生。

總之，沙棘總黃酮可防止氧化損傷，增強膠原蛋白的合成和分泌，抑制瘢痕增生，從而為其用于防紫外線損傷提供了有利的證據，但沙棘總黃酮用于防紫外線損傷的機制還需要進一步研究與探索。

［1］ 牛廣財，朱丹，王軍，等.沙棘酒清除自由基作用的研究［J］.中國食品學報，2010，10（1）：36-41.

［2］ 張立明，楊鳳琴，袁本香，等.沙棘總黃酮對4種念珠菌的體外抑菌作用［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2010，30（16）：1355-1357.

［3］ 楊云裳，張應鵬，李春雷，等.沙棘汁中總黃酮提取及純化研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（3）：570-572.

［4］ 謝久祥，林恭華，都玉蓉，等.青海沙棘不同部位總黃酮含量比較研究［J］.天然產物研究與開發(fā)，2012，24（1）：45-48.

［5］ 孫天宇.沙棘葉黃酮的提取分離及降血脂作用小鼠試驗的研究［D］.大慶：黑龍江八一農墾大學，2012.

［6］ 王新瑞，侯霄.沙棘黃酮對心血管系統(tǒng)的藥理作用［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2009，7（9）：1085-1086.

［7］ 焦巖.大果沙棘黃酮分離純化及生物活性研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學，2010.

［8］ 劉瑜.大果沙棘黃酮對糖尿病小鼠生理功能的影響［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學，2010.

［9］ 金鐘.沙棘葉黃酮提取物體內外抗氧化活性、應用與護肝作用的研究［D］.哈爾濱：東北農業(yè)大學，2014.

［10］ 蘭芝薈.鐮形棘豆總黃酮防紫外線損傷作用及機制研究［D］.蘭州：蘭州大學，2011.

［11］ 李茂星，蘭芝薈，何希瑞.鐮形棘豆總黃酮防紫外線損傷作用研究［J］.中藥材，2011，34（3）：93-97.

［12］ 李建民，劉琦，王雪，等.杜仲提取物對小鼠皮膚光老化保護作用的實驗研究［J］.中國美容醫(yī)學，2012，21（4）：584-586.

［13］ 陳旭，王瑩，鞠梅，等.皮膚光老化小鼠模型的構建［J］.中國麻風皮膚病雜志，2014，30（3）：131-136.

［14］ 馬立文，趙宏偉，周炳榮，等.大豆低聚肽對中波紫外線誘導的光老化小鼠皮膚的保護作用［J］.中國皮膚性病學雜志，2014，28（2）：119-122.

［15］ 劉肅.二甲氨基乙醇和復方氨基酸延緩大鼠皮膚老化的實驗研究［D］.廣州：南方醫(yī)科大學，2014.

［16］ 周湘君，葉才果，楊廣麗，等.丹酚酸B對小鼠皮膚光老化的保護效 應［J］.中 國 組 織 工 程 研 究，2013，17（2）：275-279.