王　娟(綜述)，張艷亮，段　勇(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032)

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DNA甲基化芯片檢測技術(shù)在惡性腫瘤診療中的應(yīng)用

王娟△(綜述)，張艷亮※，段勇(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032)

摘要：表觀遺傳學(xué)的改變普遍存在于各種惡性腫瘤中，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)改變的主要形式之一。DNA甲基化狀態(tài)的改變可顯著影響基因的表達(dá)，抑癌基因高甲基化及癌基因低甲基化是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。因此，檢測惡性腫瘤DNA甲基化狀態(tài)的變化對于揭示其發(fā)病機(jī)制意義重大。近年來，DNA甲基化檢測技術(shù)尤其是DNA甲基化芯片檢測技術(shù)在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制、臨床診療等方面得到越來越廣泛的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：甲基化芯片技術(shù)；惡性腫瘤；去甲基化藥物

近年來隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)，除了基因序列改變外，基因的表觀遺傳學(xué)改變也是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[1]。DNA甲基化是基因表觀遺傳學(xué)改變的主要形式之一，所謂DNA甲基化，是指通過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)將S腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的碳5′位上。大于500 bp 的DNA序列，GC含量大于55%的DNA區(qū)域稱為CpG島[2]。哺乳動物50%～60%的啟動子區(qū)位于CpG島上[3]。正常組織中，CpG島一般沒有甲基化，CpG島外的CG序列可發(fā)生甲基化；當(dāng)CpG島的胞嘧啶發(fā)生甲基化或CpG島外CG序列發(fā)生低甲基化時可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。

1檢測DNA甲基化的方法

檢測基因組DNA甲基化水平的方法很多，包括亞硫酸氫鹽測序法、限制性內(nèi)切酶酶切法、甲基化酶溫育法、高壓液相色譜法、免疫法、氯乙醛法等；檢測特定DNA片段甲基化水平的方法包括限制酶聚合酶鏈反應(yīng)法、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)、甲基化敏感性單鏈核苷酸引物延伸、聚合酶鏈反應(yīng)熒光溶解曲線分析等。常用的檢測DNA甲基化的方法是亞硫酸氫鹽測序，該方法最精確，可定量檢測全基因組的甲基化水平，但該法需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、耗時且費(fèi)用昂貴[5]；甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)是一種快速、特異性好、靈敏度高、所需樣本量少的DNA甲基化檢測方法，但其只能定性而不能準(zhǔn)確定量[6]。由于上述檢測方法的缺陷，有必要開發(fā)一種快捷、靈敏、相對廉價且可定量的檢測的技術(shù)。DNA甲基化芯片檢測技術(shù)具有上述優(yōu)點(diǎn)，可用于惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究，而且在惡性腫瘤的診斷、分類、分期、預(yù)后判斷及藥物療效預(yù)測等諸多方面均發(fā)揮重要作用。

2DNA甲基化芯片檢測技術(shù)

甲基化免疫沉淀聯(lián)合芯片的檢測技術(shù)是將待測DNA通過酶切降解后，用甲基化胞嘧啶抗體免疫沉淀有甲基化修飾的胞嘧啶。對沉淀產(chǎn)物和非沉淀產(chǎn)物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。利用雙色熒光分別標(biāo)記兩組擴(kuò)增產(chǎn)物，再在基因芯片上雜交，最后通過熒光密度比值的高低篩選出差異甲基化基因。該技術(shù)可在整個基因組范圍內(nèi)掃描差異甲基化，也可針對某個特定基因的甲基化進(jìn)行檢測。甲基化芯片檢測技術(shù)具有高通量性、自動化、微型性的優(yōu)點(diǎn)，可用于大規(guī)模研究[7]。

3DNA甲基化芯片檢測技術(shù)在惡性腫瘤診療中的應(yīng)用

3.1篩查患癌高危人群及早期診斷對于惡性腫瘤患者來說，早期治療可以提高患者生存期，減小手術(shù)創(chuàng)面，提高患者生存質(zhì)量。如乳腺癌早期診斷的存活率為98%，晚期診斷存活率僅為27%[8]。目前，CT或磁共振成像能發(fā)現(xiàn)直徑>1 cm 的實(shí)體腫瘤，腫瘤標(biāo)志物，如糖類腫瘤標(biāo)志物CA199只能在腫瘤的中晚期才能檢測到。目前研究人員可從基因及基因表觀遺傳學(xué)的水平檢測腫瘤標(biāo)志物，因?yàn)樵趯?shí)體腫瘤出現(xiàn)前，基因表觀遺傳學(xué)就有可能發(fā)生明顯的改變。如在多個類型的腫瘤形成前，多梳蛋白組靶基因就已經(jīng)出現(xiàn)高甲基化，所以其可作為一個診斷潛在腫瘤的標(biāo)志物[9]。針對惡性腫瘤早期生物學(xué)標(biāo)志物的研究是很有必要的。Bethqe等[10]應(yīng)用芯片技術(shù)在480例淋巴瘤患者中篩查表觀遺傳學(xué)藥物治療前后基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，治療后表達(dá)上調(diào)的基因有233個；在18個淋巴瘤細(xì)胞株中用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測233個基因中表達(dá)上調(diào)最高的30個基因發(fā)現(xiàn)，有7個基因在>70%的細(xì)胞株中出現(xiàn)甲基化；再在37例淋巴瘤病例中檢測這7個基因，其中的36例患者中牙本質(zhì)涎蛋白基因、人卷曲蛋白8基因、電壓門控鉀通道H2基因及人類蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基14A基因啟動子區(qū)的甲基化率分別為28%、67%、22%和78%，把它們結(jié)合起來的陽性率高達(dá)89%，表明這些基因很有可能是診斷和監(jiān)測B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的標(biāo)志物。Kim等[11]應(yīng)用甲基化芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，人中心體蛋白1基因在前列腺癌和胰腺癌中的高表達(dá)與其啟動子區(qū)甲基化有關(guān)。Kuhmann等[12]應(yīng)用DNA甲基化芯片技術(shù)檢測大腸癌患者中231個DNA修復(fù)基因，發(fā)現(xiàn)在不同人種間大腸癌患者的基質(zhì)金屬蛋白酶9基因、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A基因及連接酶4基因均出現(xiàn)高甲基化，在51%的患者中連接酶4基因啟動子區(qū)的高甲基化達(dá)60%。連接酶4基因啟動子甲基化是控制連接酶Ⅳ表達(dá)的新機(jī)制，其可能是診斷大腸癌的一個新的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物[12]。隨著研究的開展，有望找出特定腫瘤的特異性標(biāo)志物，從而早期診斷腫瘤。常見的高甲基化基因及其相關(guān)的惡性腫瘤類型見表1。

表1　腫瘤中常見的高甲基化基因及其相關(guān)的惡性腫瘤類型

RASSF1A：相關(guān)區(qū)域家族1A基因；APC：大腸息肉基因；BRCA1：乳腺癌1基因；CDH1：鈣黏蛋白1基因；CDKN2A：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A基因；GSTP1：谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1基因；MGMT：甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因；DAPK1：死亡相關(guān)蛋白激酶 1基因

3.2評估預(yù)后應(yīng)用甲基化芯片技術(shù)檢測癌組織、癌旁組織、癌轉(zhuǎn)移組織及正常組織的甲基化水平，并通過對比患者生存期、復(fù)發(fā)率等指標(biāo)，尋找與預(yù)后相關(guān)的異常甲基化基因，以指導(dǎo)臨床診斷，避免不必要的侵入性治療。Sandoval等[13]使用甲基化芯片法檢測444例非小細(xì)胞肺癌患者45萬個CpG點(diǎn)的甲基化水平發(fā)現(xiàn)，組蛋白H4基因、 原鈣黏蛋白亞族B6基因、黑白神經(jīng)肽受體1基因、四氧嘧啶基因及同源異形盒A9基因的高甲基化可增加非小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)率。Zhen等[14]通過甲基化芯片分析69對鼻咽癌組織與正常鼻咽部組織的結(jié)締組織生長因子基因的甲基化水平發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織生長因子基因高甲基化導(dǎo)致該基因表達(dá)受抑制，使黏著斑激酶/磷脂酰肌醇三羥基激酶/蛋白激酶B途徑活化并調(diào)節(jié)下游的細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。Hou等[15]應(yīng)用甲基化芯片方法檢測45對肝癌及癌旁組織和6例正常人肝組織的甲基化水平，并分析其中的高甲基化基因與無病生存期和總生存期的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，無眼基因4的甲基化水平與無病生存期及總生存期呈反比，無眼基因4基因的表達(dá)水平與腫瘤的大小呈負(fù)相關(guān)，因此無眼基因4基因甲基化水平的檢測有助于判斷肝癌預(yù)后。上述研究表明，基因甲基化水平的改變與惡性腫瘤的預(yù)后相關(guān)，找出其關(guān)聯(lián)程度可更有效地判斷預(yù)后。

3.3預(yù)測藥物療效及靶向治療DNA甲基化水平的檢測可幫助臨床醫(yī)師判斷惡性腫瘤患者對抗癌藥物的反應(yīng)，從而優(yōu)化治療，實(shí)現(xiàn)靶向及個體化治療，減少療程并評估藥物不良反應(yīng)。Moutinho等[16]應(yīng)用甲基化芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者中致敏紅細(xì)胞基因的高甲基化預(yù)示著對奧沙利鉑的抵抗。在Karakoula等[17]的研究中，應(yīng)用芯片技術(shù)檢測顱內(nèi)室管膜瘤經(jīng)5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC)治療前后多個基因的甲基化改變發(fā)現(xiàn)，因高甲基化而失活的腦組織表達(dá)X1基因可作為靶向治療的潛在靶標(biāo)。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓增生異常綜合征的患者磷酸酶張力蛋白同源基因高甲基化使磷酸酶張力蛋白同源基因表達(dá)降低、甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)升高，應(yīng)用尿多酸肽治療后，可使磷酸酶張力蛋白同源基因逆甲基化。因此，基因的甲基化水平可預(yù)測抗腫瘤藥物的療效。常見的基因甲基化與藥物療效關(guān)系，見表2。

表2　常見基因高甲基化與抗腫瘤藥物療效預(yù)測

BRCA1：乳腺癌1基因；GSTP1：谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1基因；MGMT：O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因；APAF1：凋亡肽酶活化因子1基因；MLH1：mutL同系物1基因

4逆轉(zhuǎn)甲基化的藥物

DNA甲基化相對于基因的改變來說是可逆的，可使用DNMTs抑制劑對腫瘤進(jìn)行靶向治療。逆轉(zhuǎn)甲基化的藥物主要分為核苷類似物和非核苷類似物。

4.1核苷類似物核苷類似物有5氮雜胞苷(5-azacytidine，5-Aza-CR)和5-Aza-dC，這兩種藥物整合進(jìn)入DNA，干擾DNA與DNMTs的相互作用，通過降解DNMTs改變嘧啶起作用。但兩者也略有不同：5-Aza-CR下調(diào)p53，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而5-Aza-dC可致細(xì)胞衰老[19]。這兩種藥物已被美國食品藥物管理局批準(zhǔn)用于骨髓增生異常綜合征、惡性間皮瘤、白血病、乳腺癌以及鼻咽癌等疾病的治療。但這兩種藥物細(xì)胞毒性大、易水解、不穩(wěn)定。嘧啶酮-B-核苷是一種新的DNMTs抑制劑，可抑制DNMTs和胞嘧啶脫氨酶的作用，而且還可使抑癌基因再活化，且具有較低的細(xì)胞毒性和較高的腫瘤敏感性[20]，其通過細(xì)胞周期阻滯以及caspase依賴的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡途徑抑制肺癌細(xì)胞生長[21]，其與甲氨蝶呤聯(lián)合治療急性淋巴細(xì)胞白血病具有很好的協(xié)同效應(yīng)[20]。2′-脫氧-N4[2-(4-硝基苯基)乙氧羰基]-5-氮雜胞苷是一種5-氮雜-2-脫氧胞苷的前體藥物，其可整合到DNA中，從而抑制DNMTs；2′-脫氧-N4[2-(4-硝基苯基)乙氧羰基]-5-氮雜胞苷可保護(hù)5-Aza-dC不被脫氨基，但療效弱于5-Aza-dC，而且其活性依賴于羧酸酯酶[22]。RG108是一個小分子藥物，其通過作用于DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1，使其失活而發(fā)揮逆甲基化的作用[23]。

4.2非核苷類似物這類藥物不需要整合進(jìn)入DNA，所以細(xì)胞毒性較小。在實(shí)體腫瘤中逆甲基化的藥物目前有肼苯達(dá)嗪和普魯卡因胺[24]。

5展望

DNA甲基化芯片檢測技術(shù)在惡性腫瘤的檢測中具有重要作用，且DNA甲基化芯片檢測技術(shù)較其他甲基化檢測技術(shù)而言具有高通量、快捷、簡便、可定量的優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中。該技術(shù)不僅可早期診斷惡性腫瘤，而且能監(jiān)測腫瘤發(fā)展、評價藥物療效、評估預(yù)后以及在此基礎(chǔ)上研究新藥等。眾多研究表明，甲基化標(biāo)志物在臨床應(yīng)用是可行的，但目前仍存在諸多困難，如甲基化芯片檢測技術(shù)仍需通過其他方式驗(yàn)證、特定腫瘤甲基化標(biāo)志物的確定等[25]。

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DNA Methylation Microarray Technology in Diagnosis and Treatment Malignant Tumor

WANGJuan,ZHANGYan-liang,DUANYong.

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032,China)

Abstract：Epigenetic changes generally exist in various malignant tumors.DNA methylation is one of the main forms of epigenetic changes.Change of DNA methylation can significantly affect expression of gene.Antioncogenes hypermethylation and oncogene hypomethylation may be the important mechanism for the occurrence and development of malignant tumor.Therefore,it is significant that detecting the changes of malignant tumor DNA methylation status can reveal the pathogenesis of malignant tumor.In recent years,DNA methylation detection technology especially DNA methylation microarray technology has been widely used in the study of the pathogenesis，clinical diagnosis and treatment of malignant tumor.

Key words：Methylation microarray technology; Malignant tumour; Demethylation drugs

收稿日期：2014-05-12修回日期：2014-08-22編輯：辛欣

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81160292)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.07.046

中圖分類號：R733

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)07-1270-03