張　蕓　紀(jì)惜鑾　羅朝霞　楊　順　劉曉雷　姜　舒

(1.深圳市茵冠生物科技有限公司，廣東 深圳　518000；2.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東 深圳　518000)

金屬硫蛋白修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞治療鉛中毒*

張蕓1紀(jì)惜鑾1羅朝霞1楊順1劉曉雷2姜舒1

(1.深圳市茵冠生物科技有限公司，廣東 深圳518000；2.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東 深圳518000)

摘要：目的研究過(guò)表達(dá)金屬硫蛋白的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(MT-hADSCs)對(duì)鉛中毒小鼠排鉛的作用及機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、鉛中毒模型組、單純細(xì)胞組、空載病毒組和病毒感染組，空白對(duì)照組小鼠給予生理鹽水，其他組小鼠給予1 mg/kg醋酸鉛連續(xù)于實(shí)驗(yàn)第1-10 d腹腔注射，第11 d各組分別給予生理鹽水、hADSCs、空載慢病毒感染的hADSCs、MT - hADSCs注射，觀察14 d后處死小鼠，檢測(cè)血鉛濃度、血清超氧化物歧化酶( SOD)活性和丙二醛(MDA)含量、腦組織Caspases 3和Bcl - 2蛋白表達(dá)。結(jié)果鉛中毒小鼠血鉛顯著升高，血清SOD活性顯著下降，血清MDA含量顯著升高。病毒感染組與鉛中毒模型組相比，血鉛顯著下降，血清SOD活性顯著升高，血清MDA含量顯著下降，腦海馬DG區(qū)細(xì)胞actived caspase 3表達(dá)明顯下降。結(jié)論MT - hADSCs能促進(jìn)鉛中毒小鼠排鉛，提高其SOD活性和降低MDA含量及Caspases 3蛋白表達(dá)，從而減少細(xì)胞氧化損傷和凋亡。

關(guān)鍵詞：金屬硫蛋白；人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞；鉛中毒

鉛是一種具有神經(jīng)毒性的重金屬元素，隨著工業(yè)和其他行業(yè)的迅速發(fā)展, 鉛被大量使用, 鉛污染已經(jīng)成為各個(gè)領(lǐng)域所面對(duì)的緊迫向題。但是，至今為止尚無(wú)特別有效的方法阻止人對(duì)鉛元素的吸收。

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是指一類(lèi)低分子量、高巰基含量(20%~30%)的活性肽[1]，對(duì)人體的正常生理代謝、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、組織和器官各種生理功能的正常進(jìn)行起著非常重要的作用。MT富含巰基及其重金屬結(jié)合能力決定了它在重金屬解毒方面起著重要的作用[2]。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSCs)是一種來(lái)源于人脂肪組織的成體干細(xì)胞，取材容易、來(lái)源豐富，具有自我更新能力、活力持久及多向分化潛能等干細(xì)胞特征[3]，并且具有穩(wěn)定生長(zhǎng)和增殖、促進(jìn)組織修復(fù)的能力，在心肌缺血、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、組織工程等領(lǐng)域中有著很好的應(yīng)用前景[4]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將攜帶MT基因的hADSCs移植鉛中毒小鼠模型，探討MT蛋白對(duì)排鉛的影響及作用機(jī)制，評(píng)估MT - hADScs應(yīng)用于促排鉛的安全性和有效性，為推動(dòng)MT - hADScs作為促排鉛藥物進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)C 57雄性小鼠(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，40只，體重18 - 22 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠飼以普通飼料，自由飲水。

1.2 藥品與試劑

國(guó)產(chǎn)醋酸鉛，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水稀釋，濃度為1 mg/ml；博暉全血鉛鎘元素檢測(cè)試劑(改進(jìn)型)購(gòu)自北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒和丙二醛(MDA)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；兔源Anti - Bcl2A1 antibody、兔源Anti - active Caspase 3 antibody、小鼠源Anti - metallothionein antibody均購(gòu)自Abcam。

1.3 儀器

微量元素檢測(cè)儀(BH 2100鎢舟原子吸收光譜儀)購(gòu)自北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1分組與給藥將40只小鼠分為5組，每組8只，分別為空白對(duì)照組、鉛中毒模型組、單純細(xì)胞組、空載病毒組、病毒感染組?？瞻讓?duì)照組小鼠腹腔注射等量0.9%的氯化鈉注射液；鉛中毒模型組、單純細(xì)胞組、空載病毒組、病毒感染組采用醋酸鉛腹腔注射染毒法構(gòu)建小鼠鉛中毒模型，1次/天，連續(xù)10 天，每日的染毒劑量為10 mg/kg。末次染鉛24 h后，空白對(duì)照組和鉛中毒模型組小鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1ml，單純細(xì)胞組、空載病毒組和病毒感染組小鼠分別經(jīng)尾靜脈給予5×105hADSCs、空載慢病毒感染的hADSCs和MT - hADSCs各1 ml，14 d后處死小鼠取血和腦組織。從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，每天進(jìn)行常規(guī)觀察，包括動(dòng)物外觀、體征、進(jìn)食量、行為活動(dòng)等，每天稱體重1次。

1.4.2 小鼠血鉛濃度測(cè)定各組血液樣本采用微量元素檢測(cè)儀(BH 2100鎢舟原子吸收光譜儀)，以及博暉全血鉛鎘元素檢測(cè)試劑(改進(jìn)型)進(jìn)行血鉛濃度檢測(cè)。

1.4.3小鼠血清SOD活性和MDA含量測(cè)定分別按照SOD和MDA測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定小鼠血清SOD活性和MDA含量。

1.4.4 小鼠腦組織Caspases 3、Bcl-2蛋白表達(dá)測(cè)定各組小鼠腦組織用4% PFA灌流固定，25%蔗糖脫水72 h，接著冰凍切片(30 μm)。收集包含腦海馬組織的切片，做免疫組化分析。0.3% PBST破膜處理20 min，10%正常山羊血清封閉40 min。加Bcl - 2、caspase 3-抗(工作濃度1∶500)孵育1 h，PBS洗3遍，每次10 min。加二抗(工作濃度1∶100)孵育1 h，PBS洗3遍，每遍10 min。貼片晾干后加含有DAPI的封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1安全性評(píng)估

實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物活動(dòng)、進(jìn)食、生長(zhǎng)正常，無(wú)小鼠死亡。各組小鼠的初始平均體重相近,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠的平均體重?zé)o顯著差異。細(xì)胞輸注部位未見(jiàn)紅腫、硬結(jié)、破潰等。

2.2 MT - hADSCs對(duì)鉛中毒小鼠血鉛含量的影響

連續(xù)10 d腹腔注射1 mg/kg醋酸鉛，導(dǎo)致小鼠血鉛顯著升高，鉛中毒模型組與空白對(duì)照組相比血鉛含量顯著升高(P<0.05)，單純細(xì)胞組、空載病毒感染組與鉛中毒模型組相比，血鉛含量明顯下降，有顯著差異(P<0.05)，病毒感染組與鉛中毒模型組、單純細(xì)胞組、空載病毒感染組相比，血鉛顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1　MT-hADSCs對(duì)鉛中毒小鼠

*P<0.05 vs 空白對(duì)照組；**P<0.05 vs 鉛中毒模型組；

#P<0.05 vs 鉛中毒模型組、單純細(xì)胞組、空載病毒組

2.3MT - hADSCs對(duì)鉛中毒小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

連續(xù)10 d腹腔注射1 mg/kg醋酸鉛，導(dǎo)致小鼠血清SOD活性顯著下降，血清MDA含量顯著升高，病毒感染組與鉛中毒模型組相比，血清SOD含量顯著升高，血清MDA含量顯著下降(P<0.05)，而單純細(xì)胞組、空載病毒感染組相比鉛中毒模型組MDA含量有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 MT - hADSCs對(duì)鉛中毒小鼠腦組織Caspases 3、Bcl - 2蛋白含量的影響

連續(xù)10 d腹腔注射1 mg/kg醋酸鉛未發(fā)現(xiàn)影響腦海馬DG區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，各個(gè)組的DG區(qū)均檢測(cè)到均勻致密表達(dá)的Bcl - 2。

表1　MT - hADSCs對(duì)鉛中毒小鼠

*P<0.05 vs 空白對(duì)照組；**P<0.05 vs 鉛中毒模型組；#P<0.05 vs 鉛中毒模型組、單純細(xì)胞組、空載病毒組

A 空白對(duì)照組；B 鉛中毒模型組；

鉛中毒模型組actived caspase 3表達(dá)明顯增強(qiáng)，其他四組actived caspase 3的表達(dá)未檢測(cè)到明顯的增強(qiáng)。

A 空白對(duì)照組；B 鉛中毒模型組；

3討論

鉛是一種作用于全身的多親和性毒物，對(duì)人體產(chǎn)生多系統(tǒng)、多器官的損傷。鉛進(jìn)入體內(nèi)后難以降解，可與酶或蛋白分子中許多基團(tuán)如巰基、羧基、咪唑基等結(jié)合，并破壞體內(nèi)其他二價(jià)金屬元素[5]，從而對(duì)機(jī)體造成損害。至今為止尚無(wú)特別有效的方法阻止人對(duì)鉛元素的吸收，目前主要采用排毒、強(qiáng)身、調(diào)理、預(yù)防等方式減少鉛元素的吸收，臨床上治療鉛中毒首選藥物是依地酸二鈉鈣，其次是二已烯二胺五乙醇三鈉鈣和二硫醇鈉，但這些化學(xué)藥物不能長(zhǎng)期使用，而且對(duì)幾乎所有金屬都具有絡(luò)合作用，會(huì)同時(shí)造成對(duì)人體有益的金屬喪失，如鋅、銅等[6]。

MT的巰基基團(tuán)(-SH)能強(qiáng)烈螯合有毒重金屬汞、鉛、鎘、砷等，其中螯合鉛的強(qiáng)度比鋅大200倍，而螯合鎘的強(qiáng)度又比鉛大10倍，從而有效地清除這些有毒重金屬，使它們無(wú)法毒害人體，同時(shí)對(duì)體內(nèi)鋅等微量元素?zé)o影響，這對(duì)保護(hù)大腦、肝、腎等人體重要器官具有極其重要意義。多項(xiàng)研究表明MT在重金屬解毒方面具有顯著效果，但由于MT結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜性，目前對(duì)MT的重金屬解毒機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不明確，普遍認(rèn)為MT對(duì)重金屬的解毒機(jī)制主要包括減少機(jī)體有害重金屬存在和修復(fù)重金屬引起的機(jī)體損傷兩個(gè)方面，其作用途徑包括金屬離子代謝調(diào)節(jié)[7]、修復(fù)重金屬氧化損傷[8]、提高重金屬耐受性[9]和促進(jìn)維生素吸收[10]等。

本實(shí)驗(yàn)將攜帶MT基因的MT - hADSCs移植治療鉛中毒小鼠，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組小鼠的活動(dòng)、進(jìn)食、生長(zhǎng)未受到影響，各組小鼠平均體重在實(shí)驗(yàn)前后無(wú)顯著差異，且細(xì)胞輸注部位無(wú)不良反應(yīng)，表明MT - hADSCs應(yīng)用于治療鉛中毒小鼠是安全的，無(wú)明顯毒副作用。鉛中毒小鼠接受MT - hADSCs輸注后，檢測(cè)到血鉛和血清MDA含量顯著下降，血清SOD活性顯著升高， 腦組織actived caspase 3表達(dá)下降，提示MT - hADSCs通過(guò)降低小鼠體內(nèi)鉛含量，減輕鉛對(duì)SOD活性的抑制作用及體內(nèi)超氧陰離子自由基的蓄積，進(jìn)而降低因體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的MDA的含量，減少細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MT - hADSCs用于促排鉛治療的臨床前評(píng)價(jià)是安全有效的，為推進(jìn)MT - hADSCs作為促排鉛藥物進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為臨床治療鉛中毒提供一種更為安全有效的方法，但其促排鉛及對(duì)機(jī)體的保護(hù)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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Metallothionein modified mesenchymal stem cells to treat lead poisoning

ZHANGYunJIXi-luanLUOZhao-xiaYANGShunLIUXiao-leiJIANGShu

(Shenzhen Yinguan Biotechnology Co., Ltd. Shenzhen 578000，China)

Abstract:Objective: studied between the expression of metallothionein in human adipose-derived mesenchymal stem cells (MT-hADSCs) Excretion of lead poisoning in mice and its mechanism. Methods: were divided into blank control group, model group, lead poisoning, simple cell group, viral load group and viral infection, mice were given saline control group, the other group of mice administered 1 mg / kg of lead acetate in a row in the first experiment 1-10 d intraperitoneal injection, the first 11 d of each group were given saline, hADSCs, load lentivirus infection hADSCs, MT - hADSCs injection, mice were sacrificed observed after 14d, testing blood lead levels, serum superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) in brain tissue Caspases 3 and Bcl - 2 protein expression. Results: blood lead poisoning in mice significantly increased serum SOD activity was significantly decreased, significantly increased the content of MDA. Compared with the model group, lead poisoning, blood lead was significantly decreased viral infection group, significantly increased the activity of SOD significantly decreased the content of MDA, hippocampus DG zone cells actived caspase 3 expression was significantly decreased. Conclusion: MT - hADSCs Lead Poisoned Mice can promote and improve its SOD activity and lower MDA content and 3 protein Caspases, thereby reducing cellular oxidative damage and apoptosis.

Keywords:metallothionein; human adipose-derived mesenchymal stem cells; lead poisoning

(收稿日期2015-9-12)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.12.012

中圖分類(lèi)號(hào)：R135.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7115(2015)12-1353-03

作者簡(jiǎn)介：張蕓(1973—)，女,湖南永州人，副研究員，碩士,主要從事細(xì)胞生物技術(shù)創(chuàng)新研發(fā)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用工作。 通訊作者：姜舒，女，博士。