王力先， 張曉鈺， 潘 浩， 徐麗慧， 歐陽東云， 何賢輝

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫生物學(xué)系，廣東廣州510632；2.廣東省體育科學(xué)研究所國家體育總局體能與訓(xùn)練適應(yīng)控制系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510663；3.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，廣東廣州510632）

葫蘆素E對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞體外活化及細(xì)胞因子表達(dá)的影響

王力先1，2， 張曉鈺1， 潘 浩1， 徐麗慧3， 歐陽東云1， 何賢輝1

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫生物學(xué)系，廣東廣州510632；2.廣東省體育科學(xué)研究所國家體育總局體能與訓(xùn)練適應(yīng)控制系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510663；3.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，廣東廣州510632）

目的：分析葫蘆素E（CucE）對(duì)二丁酸佛波醇酯（PDB）和離子霉素（Ion）刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）活化及促炎因子表達(dá)的影響，探討其潛在的抗炎效應(yīng)及作用機(jī)制.方法：利用流式細(xì)胞術(shù)分析人外周血PBMC活化抗原CD69和CD25表達(dá)，用流式微球陳列檢測(cè)白介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ）表達(dá)的變化.結(jié)果：CucE能明顯抑制PDB和Ion刺激引起的CD3＋T細(xì)胞早期活化標(biāo)志分子CD69和中期活化分子CD25的表達(dá)；同時(shí)，CucE以劑量依賴方式抑制PDB和Ion誘導(dǎo)的IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá).結(jié)論：CucE對(duì)人外周血CD3＋T細(xì)胞的活化具有明顯抑制作用，同時(shí)減少炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，提示其通過對(duì)適應(yīng)性免疫的調(diào)控發(fā)揮抗炎效應(yīng).

葫蘆素E； 人外周血單個(gè)核細(xì)胞； CD69； CD25； 細(xì)胞因子

人類外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其他少量細(xì)胞（如造血干細(xì)胞）等白細(xì)胞.用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離得到的PBMC中，淋巴細(xì)胞約占90%，其中T淋巴細(xì)胞占80%，B淋巴細(xì)胞占4%～10%［1］，因此PBMC常用于研究各類藥物對(duì)人類淋巴細(xì)胞功能的影響.二丁酸佛波醇酯（phorbol 12，13-dibutyrate，PDB）能激活蛋白激酶C，而離子霉素（Ionomycin，Ion）能作為鈣離子載體使胞內(nèi)鈣離子濃度提高，模擬抗原刺激的信號(hào)，常用作T和B細(xì)胞的激活劑［2-3］.活化的T細(xì)胞能表達(dá)多種活化抗原（包括CD69、CD25等），并可產(chǎn)生IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子，這些活化抗原和細(xì)胞因子的表達(dá)水平是評(píng)價(jià)T細(xì)胞活化和功能的標(biāo)志分子［4］.

葫蘆素E（Cucurbitacins E，CucE）是一類從葫蘆科植物中提取的一種四環(huán)三萜類化合物，具有抗腫瘤、抗病毒、保肝、抗炎等多種生物學(xué)活性［5-7］.CucE的研究主要集中于其抗腫瘤活性和機(jī)制的探索，研究顯示CucE可能是通過抑制癌細(xì)胞Jak-STAT3信號(hào)通路并破壞細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架而發(fā)揮其抗癌作用［7-9］.近年來CucE的抗炎作用也受到重視，研究顯示，CucE可通過抑制固有免疫細(xì)胞環(huán)加氧酶2（COX-2）和活性氮族的活性、抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位、以及抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）等細(xì)胞因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用［7，10］.然而，CucE對(duì)人PBMC的作用卻尚不清楚.本研究以PDB和Ion活化的PBMC為模型，分析CucE對(duì)PBMC中T細(xì)胞的活化和炎癥因子表達(dá)的影響，從而探討其對(duì)適應(yīng)性免疫細(xì)胞的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葫蘆素E（純度98%），購自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配成10 mmol／L的儲(chǔ)存液，置-20℃保存，實(shí)驗(yàn)前稀釋成所需濃度.二丁酸佛波醇酯（phorbol 12，13-dibutyrate，PDB）、離子霉素（Ionomycin，Ion）、多聚甲醛和DMSO均購自Sigma-Aldrich公司；RPMI-1640、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol）、L-谷氨酸、青霉素、鏈霉素、和Trizol總RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；WST-1試劑盒購自Roche公司；熒光標(biāo)記單克隆抗體anti-CD3-FITC、anti-CD25-APC和anti-CD69-PE購自BioLegend公司；人Th1／Th2／Th17 CBA試劑盒購自BD Biosciences公司.

1.2 分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞

用密度梯度離心法分離志愿者外周血PBMC.把分離出來的PBMC用PBS洗3遍后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、2 mmol／L L-谷氨酸、100 U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素和0.05 mmol／L 2-巰基乙醇的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).

1.3 藥物濃度M TT實(shí)驗(yàn)

人周血PBMC細(xì)胞以1×104／孔種于96孔板，體積為0.1 mL，分別加入不同濃度梯度CucE，使其終濃度為0、0.01、0.1、1、10、100μmol／L，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)6和24 h后分別用WST-1試劑盒和酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞增殖情況.

1.4 PBMC活化表面分子檢測(cè)

PBMC細(xì)胞以1×106／孔種于24孔板，體積為0.5 mL.實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、CucE單獨(dú)處理組、PDB＋I(xiàn)on對(duì)照組（PDB終濃度為0.5μmol／L，Ion終濃度為0.5μg／mL）及CucE＋PDB＋I(xiàn)on藥物組（PDB終濃度為0.5μmol／L，Ion終濃度為0.5μg／mL，CucE設(shè)濃度梯度0.1μmol／L、0.3μmol／L和1 μmol／L）在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集上清液進(jìn)行CBA檢測(cè)；細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)2%小牛血清、0.1%NaN3的PBS洗滌1次后進(jìn)行胞外染色、4%多聚甲醛固定后用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞表面分子表達(dá)情況.

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液上清細(xì)胞因子檢測(cè)

收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液用人Th1／Th2／Th17 CBA試劑盒和BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)情況，按試劑盒建議的方法進(jìn)行，簡述如下：在50μL按濃度梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和待檢標(biāo)本中分別加入50μL微球，并分別加入50μL PE標(biāo)記的檢測(cè)試劑，低速振蕩5 s、混勻，室溫下避光孵育2 h；每管加入1 mL洗滌液，200×g離心5 min，棄上清，每管加入300μL洗滌液重懸，上機(jī)檢測(cè)，用CELLQuest軟件獲取并分析數(shù)據(jù).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品捕獲微球流式圖，繪制出CBA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，然后根據(jù)CBA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計(jì)算出待測(cè)標(biāo)本中細(xì)胞因子的濃度.

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 藥物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用WST-1法檢測(cè)藥物毒性.結(jié)果如圖1所示，6 h細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CucE濃度低于1μmol／L時(shí)無顯著毒性；24 h細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CucE濃度低于1μmol／L時(shí)有較低毒性.因此，以下實(shí)驗(yàn)CucE采用0.1、0.3和1μmol／L這3個(gè)濃度.

圖1 葫蘆素E對(duì)人PBMC細(xì)胞藥物毒性實(shí)驗(yàn)Fig.1 The cytotoxicity of CucE on human PBMCs

2.2 CucE抑制PBMC活化標(biāo)志分子的表達(dá)

人PBMC中的淋巴細(xì)胞大部分為CD3＋T細(xì)胞，CD3＋T細(xì)胞在抗原或化學(xué)藥品刺激等條件下可被激活.本實(shí)驗(yàn)在人PBMC培養(yǎng)液中加入激活劑PDB＋I(xiàn)on，培養(yǎng)24 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3＋T細(xì)胞早期活化分子CD69和中期活化分子CD25的表達(dá)情況.從圖2可以看出，CucE單獨(dú)處理組與空白組無差異；PDB＋I(xiàn)on激活對(duì)照組CD3＋CD69＋／CD3＋比值顯著升高（P＜0.01）；而同時(shí)加入PDB＋I(xiàn)on和CucE的藥物處理組則以劑量依賴方式顯著抑制T細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD69的表達(dá).從圖3可以看出，CucE單獨(dú)處理組與空白組無差異；PDB＋I(xiàn)on激活對(duì)照組CD3＋CD25＋／CD3＋比值顯著升高（P＜0.01）；而同時(shí)加入PDB＋I(xiàn)on和CucE的藥物處理組則以劑量依賴方式顯著抑制T細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD25的表達(dá).

2.3 CucE抑制PBMC細(xì)胞因子的表達(dá)

收集PBMC培養(yǎng)上清液，用人CBA檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá).如圖4所示，與空白組相比，CucE單獨(dú)處理組一定程度上促進(jìn)了TNF-α的表達(dá)；PDB＋I(xiàn)on激活對(duì)照組IL-2、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平均極顯著提高（P＜0.01），與激活組相比，CucE以劑量依賴方式顯著抑制IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)水平.

圖2 葫蘆素E顯著抑制T細(xì)胞表面分子CD69的表達(dá)Fig.2 Inhibition of CD69 and CD25 expression on T cells by CucE treatment

圖3 葫蘆素E顯著抑制T細(xì)胞表面分子CD25的表達(dá)Fig.3 Inhibition of CD25 expression on T cells by CucE treatment

圖4 CucE抑制人PBMC細(xì)胞因子的表達(dá)Fig.4 Effect of CucE on cytokine secretion by human PBMCs

3 討論

用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離得到的PBMC中大部分為T淋巴細(xì)胞［1］.T淋巴細(xì)胞在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用.本研究發(fā)現(xiàn)，PBMC在體外可被PDB＋I(xiàn)on激活，CD3＋T細(xì)胞表面分子CD69和CD25表達(dá)量顯著上升，炎性細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ表達(dá)量也顯著提高.而CucE則顯著抑制T細(xì)胞活化，并抑制了IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá).

一般情況下，體內(nèi)表達(dá)某一特異性TCR的T細(xì)胞克隆僅占總T細(xì)胞的1／105～1／104，這些特異性T細(xì)胞需被抗原激活后，通過克隆擴(kuò)增而產(chǎn)生大量效應(yīng)細(xì)胞，才能發(fā)揮作用.T細(xì)胞激活需要抗原識(shí)別信號(hào)、共刺激信號(hào)和細(xì)胞因子的輔助.T細(xì)胞通過表面TCR-CD3復(fù)合受體分子與APC表面相應(yīng)抗原肽-MHC-Ⅱ／Ⅰ類分子復(fù)合物特異性結(jié)合后，引起TCR交聯(lián)并啟動(dòng)抗原識(shí)別信號(hào)，即T細(xì)胞活化第1信號(hào).T細(xì)胞接受活化第1信號(hào)刺激的同時(shí)，需要接受共刺激分子B7對(duì)CD28的刺激，即T細(xì)胞活化第2信號(hào).T細(xì)胞完全活化有賴于雙信號(hào)的刺激和多種細(xì)胞因子的參與.CD69和CD25都是活化T細(xì)胞的表面分子標(biāo)記.其中CD69與其單克隆抗體的結(jié)合可引發(fā)細(xì)胞外Ca2＋的內(nèi)流，促使細(xì)胞內(nèi)TNF、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，是T細(xì)胞活化的早期標(biāo)志［11］.CD25常表達(dá)于活化的T細(xì)胞，也是IL-2R的α鏈，是T細(xì)胞活化的中期標(biāo)志［12］.PDB和Ion因其分別能激活蛋白激酶C和鈣離子通道，常用作免疫細(xì)胞激活劑.在本研究中，用PDB＋I(xiàn)on在體外作用于人PBMC，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面分子表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PDB＋I(xiàn)on顯著提高CD3＋T細(xì)胞早期活化分子CD69和中期活化分子CD25表達(dá)，而加入CucE的藥物處理組則以劑量依賴方式抑制CD69和CD25的表達(dá)，提示CucE可能通過抑制T細(xì)胞的活化而進(jìn)一步抑制其功能.

與CD3＋T細(xì)胞活化受抑制相一致，細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)量也顯著受到CucE的抑制.IL-2主要由CD4＋T細(xì)胞分泌，通過與IL-2R結(jié)合將活化信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖、促進(jìn)NK細(xì)胞毒性作用、促進(jìn)B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化等作用［13］.TNF-α由T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，具有參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、抗腫瘤等廣泛生物學(xué)活性［14］.IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)免疫功能、激活NK細(xì)胞、促進(jìn)T細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白、誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子和呈遞抗原等作用［15-16］.本研究發(fā)現(xiàn)CucE可以劑量依賴方式顯著抑制體外活化的人PBMC對(duì)IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，提示其具有一定的抗炎作用.在以往研究中，我們發(fā)現(xiàn)雪膽素乙（Cucurbitacin IIb）能明顯抑制刀豆蛋白A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞CD69和CD25的表達(dá)，且以劑量依賴方式抑制刀豆蛋白A誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α和IL-6的表達(dá)［17］.最近，我們發(fā)現(xiàn)與雪膽素乙同屬葫蘆素家族的CucE明顯可抑制LPS活化的RAW 264.7細(xì)胞表達(dá)促炎因子TNF-α［18］，還可通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路，以劑量依賴方式從蛋白水平和mRNA水平上抑制由PDB＋I(xiàn)on激活的Jurkat T細(xì)胞的IL-2、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平［19］.在本研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CucE可顯著抑制人PBMC細(xì)胞活化表面分子CD69和CD25及細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，說明CucE除了作用于固有免疫細(xì)胞，還能有效抑制適應(yīng)性免疫細(xì)胞的功能.

總之，CucE能夠明顯抑制人PBMC中T細(xì)胞的活化并抑制促炎因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，提示其具有成為抗炎以及調(diào)控適應(yīng)性免疫的新型藥物的可能.進(jìn)一步研究需要對(duì)CucE調(diào)控適應(yīng)性免疫細(xì)胞的作用機(jī)制進(jìn)行探討.

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［責(zé)任編輯：劉蔚綏］

The effects of cucurbitacin E on the in vitro activation and cytokine expression of human peripheral blood mononuclear cells

WANG Lixian1，2， ZHANG Xiaoyu1， PAN Hao1， XU Lihui3， OUYANG Dongyun1， HE Xianhui1
（1.Department of Immunobiology，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.Key Laboratory of Physical and Training Adapted Control System，Guangdong Provincial Institute of Sports Science，Guangzhou 510663，China；3.Department of Cell Biology，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Aim：This study aimed to explore the potential anti-inflammatory effect and the underlying action mechanism of cucurbitacin E（CucE）by using phorbol 12，13-dibutyrate（PDB）＋I(xiàn)onomycin（Ion）-activated human peripheral blood mononuclear cells as amodel.M ethods：The expression levels of activated antigens CD69 and CD25 were evaluated by fluorescent staining togetherwith flow cytometry.The pro-inflammatory cytokines interleukin-2（IL-2），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interferon-γ（IFN-γ）were evaluated by cytometric bead array.Results：The results showed that CucE significantlysuppressed the expression of CD69 and CD25 on the surfaces of CD3＋T cells.Meanwhile，PDB＋I(xiàn)oninduced expression of IL-2，TNF-αand IFN-γwere also dose-dependently inhibited by CucE.Conclusion：These results demonstrated that CucE could inhibit the activation of PDB＋I(xiàn)on-stimulated CD3＋T lymphocytes in human PBMCs and decrease the pro-inflammatory cytokine expression，suggesting that it might exhibit anti-inflammatory activity viamodulating the adaptive immunity.

cucurbitacin E； peripheral blood mononuclear cells； CD69； CD25； pro-inflammatory cytokine

R392.12

A

1000-9965（2015）05-0368-06

10.11778／j.jdxb.2015.05.002

2015-03-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81173604）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031600001）；廣東省體育局科研項(xiàng)目（GDSS2014165）

王力先（1982-），女，博士研究生，研究方向：分子免疫學(xué).

，何賢輝（1965-），男，研究員，Tel：020-85220679，E-mail：thexh＠jnu.edu.cn