馮素香， 王蒙蒙， 吳兆宇， 李 先， 郝 蕊， 徐艷華

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450046）

大黃5種蒽醌類成分在大鼠肝微粒體中的代謝及酶促反應(yīng)動力學(xué)

馮素香1，2， 王蒙蒙1， 吳兆宇1， 李 先1， 郝 蕊1， 徐艷華1

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450046）

研究大黃5種蒽醌類成分在大鼠肝微粒體中的代謝特征和參與代謝的細胞色素P450亞型.超速離心法制備大鼠肝微粒體，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定孵育液中大黃5種蒽醌類成分的質(zhì)量濃度，研究大黃蒽醌類成分的酶促動力學(xué)，推導(dǎo)藥物米氏常數(shù)（K m）和最大反應(yīng)速度（V max），并計算體外酶對藥物的清除率（Clint）；用苯巴比妥鈉（PB）、地塞米松（DEX）、β-奈黃酮（β-NF）誘導(dǎo)大鼠肝微粒體，觀察大黃5種蒽醌類成分在各溫孵體系中的代謝，同時觀察不同質(zhì)量濃度和不同種類的CYP酶特異性抑制劑對大黃蒽醌類成分代謝的影響.結(jié)果表明大黃蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在肝微粒體中的Km、Vmax、Clint分別為（18.97±1.89）、（2.50±0.11）、（15.68±1.09）、（183.41±1.90）、（1.37±0.14）mg·L-1；（0.52±0.015）、（0.066±0.003）、（0.41± 0.009）、（5.22±0.09）、（0.036±0.0034）mg·L-1·min-1；（2.69±0.12）、（2.56±0.16）、（2.61±0.20）、（2.81± 0.10）、（2.63±0.18）min-1·10-2；經(jīng)DEX、PB、β-NF誘導(dǎo)后，PB組、DEX組大黃蒽醌類成分代謝率高于CMC-Na組，具有顯著性差異（P＜0.05），β-NF組大黃蒽醌類成分代謝率低于CMC-Na組，無顯著性差異（P＞0.05）；非那西汀、氟康唑、酮康唑的Dixon圖均為一組相交于第二象限的直線.通過研究得知大黃5種蒽醌類成分在PB、DEX誘導(dǎo)的肝微粒體中代謝較快，CYP3A4、CYP2A6為介導(dǎo)大黃蒽醌類成分代謝的主要代謝酶；非那西汀、氟康唑、酮康唑均為為大黃蒽醌類成分的競爭性抑制劑.

大黃蒽醌類成分； 大鼠肝微粒體； CYP450； 酶促動力學(xué)

大黃為歷代醫(yī)家本草和歷版《中國藥典》收載的常用瀉下類中藥，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃之功效［1］.大黃具多類藥效活性成分，其中主要活性成分為蒽醌類，包括大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等［2］，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示.體外代謝研究是新藥研究中廣泛使用的代謝研究方法，它能夠直觀地確定藥物代謝途徑及相關(guān)酶系，并且研究藥物代謝相互作用，指導(dǎo)體內(nèi)研究和用藥安全［3］.本試驗通過肝微粒體體外代謝研究法來研究中藥大黃有效單體蒽醌類成分在體外的代謝情況，同時探明大黃蒽醌類成分在大鼠肝微粒體中的酶促動力學(xué)特征，以及CYP450酶抑制劑對其代謝的影響，明確參與大黃蒽醌在大鼠肝微粒體中代謝的相關(guān)CYP450酶.預(yù)期通過本研究，闡明參與藥物代謝的酶，評價藥物與代謝酶間的相互作用，為理解藥物代謝的機制、預(yù)測藥物相互作用和藥物代謝多態(tài)性以及指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論依據(jù).

圖1 大黃蒽醌類成分結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure diagram of five Anthraquinones in Rhubarb

1 材料

1.1 儀器

Dionex-P680高效液相色譜儀；BY89-1型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SIGMA3-18K高速離心機配12154-H轉(zhuǎn)子（sigma公司）；HIMA CP80MX超高速離心機配P65ST轉(zhuǎn)子（日本Hitachi公司）；UV-2450雙波長紫外一可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；UV-2000分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；pHS-3C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）.

1.2 試藥

蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、1，8-二羥基蒽醌（編號分別為：110795-200605、0757-200206、110756-200110、110796-200716、110758-200610、0829-9702，均購于中國食品藥品檢定研究院）；大黃蒽醌類成分由河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物分析學(xué)科提供，含量大于80%；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（Roche公司）；勻漿緩沖液（0.05 mol／mLTris、1.15%KCL）；0.25 mol／mL蔗糖溶液；牛血清白蛋白（Roche公司）；連二亞硫酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；甲醇為色譜-質(zhì)譜醇（美國Tedia公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水.

1.3 動物

健康雄性SD大鼠（購于河北省實驗動物中心，許可證號：1006120），體質(zhì)量（250±25）g.飼養(yǎng)于河南中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心（許可證號：SYXK（豫）.2010-0001）.

2 方法

2.1 溶液配制

（1）對照品溶液配制 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、1，8-二羥基蒽醌對照品適量于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為89.6、84.8、78.0、90.4、58.4μg／mL的儲備液，使用時分別將上述儲備液各取2 mL混合.

（2）NADPH再生系統(tǒng)孵化液及孵化啟動劑的配制 精密稱取MgCl2、KCl、NADPH適量于10mL容量瓶中，用濃度為0.1 mol／mL Tris-HCI緩沖液溶解并定容，得NADPH再生孵化液（pH7.40）.精密稱取NADPH 1 mg于1 mL容量瓶，用1%NaHCO3定容，得孵化啟動劑.

2.2 分組及給藥

將20只大鼠隨機分成4組，分別為：空白對照組：0.5%CMC-Na，10μg／kg，i.g；PB組：75 mg／kg，i.p；DEX組：80 mg／kg，i.g；β-NF組：75 mg／kg，i.g.各組均在末次給藥12 h后禁食不禁水，24 h后取肝制備微粒體.

2.3 肝微粒體的制備及CYP450酶活性測定

采用超速離心法［4］制備肝微粒體.大鼠禁食12 h后斷頭處死，放出血液，迅速剖開腹腔，用預(yù)冷生理鹽水灌流，取出肝臟，將新鮮肝臟放入冰冷的生理鹽水中反復(fù)沖洗，洗至溶液呈淡黃色后，用濾紙擦干并稱重，用于計算肝臟指數(shù).按1∶4加入勻漿緩沖液，快速剪碎肝臟，用電動玻璃勻漿機勻漿，制成肝勻漿.將勻漿后的肝臟轉(zhuǎn)移至離心管，在4℃下10 000×g離心20 min.取上清液在4℃下105 000 ×g離心60 min.紅色沉淀即為肝微粒體，將肝微粒體沉淀重懸于濃度為0.25 mol／mL蔗糖溶液，可新鮮使用或存放于-80℃?zhèn)溆?依據(jù)Omura和Sato法［5］測定各組肝微粒體CYP450酶活性.

2.4 溫孵條件

精密量取750μL孵化液、150μL CMC-Na肝微粒體、50μL大黃蒽醌類成分CMC-Na，渦旋混合0.5 min，于37℃恒溫箱中預(yù)熱5 min，加入50μL啟動劑，渦旋混合1 min，于37℃恒溫箱中孵化30 min，置于-30℃低溫冰箱終止反應(yīng).

2.5 樣品處理

取終止反應(yīng)后的樣品，解凍，渦旋混合1 min，加入固相萃取柱，加入淋洗液（5%甲醇水）1 mL，棄去淋洗液，先后用甲醇、乙腈各1mL沖洗固相萃取柱，收集洗脫液，于空氣流下吹干，100μL甲醇定容.

2.6 大黃5種蒽醌類成分在大鼠肝微粒體中酶促反應(yīng)動力學(xué)

影響酶活性的因素主要有溫孵時間、蛋白質(zhì)量濃度、底物濃度［6］，實驗分別對每個因素進行優(yōu)化.在蛋白質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0 mg／mL的孵化體系中分別加入質(zhì)量濃度為0.875、1.75、3.5、7.0、14μg／mL的大黃5種蒽醌類成分，在前述溫孵條件下孵育0、10、20、30、40 min，確立最佳孵育條件.

2.7 大黃5種蒽醌類成分在各誘導(dǎo)劑組大鼠肝微粒體溫孵液中代謝影響的比較

將各誘導(dǎo)組肝微粒體組分懸浮液適量分別與大黃5種蒽醌類成分質(zhì)量濃度為高、中、低（14、7、3.5 μg／mL）在NADPH再生溫孵體系中共同溫孵，觀察大黃5種蒽醌類成分在各溫孵體系中的代謝.

2.8 代謝抑制實驗

為進一步研究選擇性的CYP酶抑制劑對大黃蒽醌類成分代謝的影響，進行大黃蒽醌的代謝抑制實驗.孵育條件同前，孵育體系中大黃蒽醌質(zhì)量濃度為7μg／mL，微粒體蛋白質(zhì)量濃度為1 mg／mL，實驗中所用的選擇性抑制劑為非那西?。?、0.105、0.21、0.42 mg／mL）、氟康唑（0、0.2、0.4、0.8 mg／mL）、酮康唑（0、0.031、0.062、0.124 mg／mL）.

2.9 代謝物檢測色譜條件

色譜柱：Venusil XBPC18（L），4.6 mm×250 mm，5μm（博納艾杰爾科技有限公司）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水（75∶25，v／v）；柱溫：25℃；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL／min；進樣量：20μL；內(nèi)標(biāo)：1，8-二羥基蒽醌.

2.10 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 方法專屬性

實驗分為無肝微粒體空白對照組、無大黃蒽醌類成分組及樣品組.按2.4項下進行溫孵反應(yīng)，按2.6項下色譜條件進行測定，結(jié)果如圖2：

圖2 方法專屬性色譜圖Fig.2 Chromatogram of the specific method

由圖可知，所建方法能有效分離樣品中各成分，排除雜質(zhì)干擾，專屬性良好.

3.2 線性范圍和檢測限

在經(jīng)滅活的大鼠肝微粒體孵育體系中，分別加入適量各系列質(zhì)量濃度的大黃5種蒽醌混合對照品，照2.4項下條件進行孵化和樣品處理，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立工作曲線.蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的線性方程分別為：Y＝1.763 3X＋0.621 8（R＝0.999 6，n＝7）；Y＝0.613 7X＋0.035 4（R＝0.999 5，n＝7）；Y＝0.576 9X＋0.128 1（R＝0.999 4，n＝7）；Y＝1.399 4X-0.175（R＝0.999 7，n＝7）；Y＝0.241 2X-0.001 9（R＝0.999 4，n＝7）.采用逐步稀釋法得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的檢測限質(zhì)量濃度分別為0.01、 0.02、0.02、0.03、0.03μg／mL（S／N≧3）.

結(jié)果表明：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別在0.15～18.7、0.18～23.1、0.13～16.9、0.26～16.6、0.18～11.6μg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

3.3 方法回收率

在滅活的大鼠肝微粒體孵育體系中，分別加入低、中、高（8.96、17.92、35.84μg／mL）3個質(zhì)量濃度的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚混合對照品溶液，照2.4項樣品處理方法進行處理后采用高效液相色譜法測定.結(jié)果表明低、中、高質(zhì)量濃度的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的回收率分別為106.8%、98.67%、88.98%；98.04%、95.02%、87.25%；105.95%、102.20%、92.3%；105.15%、98.50%、90.09%；99.89%、99.80%、89.11%.

3.4 精密度試驗

選擇低、中、高3種質(zhì)量濃度，以空白大鼠肝微粒體配制質(zhì)量控制（QC）樣品，每個質(zhì)量濃度點5份樣品，連續(xù)測定5 d，以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算QC樣品中各成分的實測質(zhì)量濃度，根據(jù)QC樣品的各成分實測質(zhì)量濃度計算本法的日內(nèi)和日間精密度.結(jié)果表明：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚低、中、高3種質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為6.9%、2.6%、4.8%；3.4%、3.2%、7.0%；6.5%、3.8%、3.2%；4.6%、2.3%、1.4%；6.9%、4.3%、2.7%.日間精密度RSD分別為5.7%、2.6%、3.9%；4.3%、3.6%、4.6%；7.6%、5.8%、3.2%；6.2%、2.7%、2.7%；5.7%、6.2%、2.6%.5種大黃蒽醌類成分的日內(nèi)和日間精密度的RSD%均＜10%，符合生物樣品測定要求.

3.5 大黃5種蒽醌類成分在大鼠肝微粒體中酶促反應(yīng)動力學(xué)

（1）反應(yīng)時間優(yōu)化 在蛋白質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL的大鼠肝微粒體酶中加入大黃5種蒽醌類成分，于37℃恒溫箱中孵育0、10、20、30、40 min.以時間為橫坐標(biāo)，大黃蒽醌類成分代謝消失率（w%）為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果顯示，大黃5種蒽醌類成分在0～10 min內(nèi)呈線性消除的趨勢明顯，孵化30 min后大黃5種蒽醌類成分剩余百分數(shù)不高于40%，確定最佳孵化時間為30 min.孵育時間-代謝消失率的關(guān)系如圖3：

（2）肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度優(yōu)化 在蛋白質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、2.0 mg／mL的大鼠肝微粒體酶中加入大黃5種蒽醌類成分，于37℃恒溫箱中孵育30 min.以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，大黃5種蒽醌類成分代謝消失率（w%）為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果顯示，隨著肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度的增加，大黃5種蒽醌類成分消失率有增加的趨勢，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度為1.0 mg／mL時，由于蛋白質(zhì)量濃度太大，出現(xiàn)固相萃取柱堵塞的現(xiàn)象，故選擇1.0 mg／mL為肝微粒體孵化實驗的最佳蛋白質(zhì)量濃度，蛋白質(zhì)量濃度-代謝消失率的關(guān)系如圖4：

圖3 溫孵時間對大黃5種蒽醌類成分代謝的影響Fig.3 Effect of incubation time on five Anthraquinones in Rhubarb

圖4 肝微粒體蛋白濃度對大黃蒽醌類成分代謝的影響Fig.4 Effect of livermicrosomal protein concentration on five Anthraquinones in Rhubarb

（3）底物質(zhì)量濃度優(yōu)化 質(zhì)量濃度分別為1.75、3.5、7.0、14.0μg／mL大黃5種蒽醌類成分在NADPH再生反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃恒溫箱中孵化30 min，以底物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，大黃5種蒽醌類成分代謝消失率（w%）為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果顯示，當(dāng)大黃5種蒽醌類成分質(zhì)量濃度大于7μg／mL時，其代謝速率并未隨大黃5種蒽醌類成分質(zhì)量濃度的增加而呈線性增加，表現(xiàn)出明顯的代謝飽和特性，確定最佳底物質(zhì)量濃度為7μg／mL.底物質(zhì)量濃度與代謝消失率的關(guān)系如圖5：

圖5 底物濃度對大黃蒽醌類成分代謝的影響Fig.5 EffectofsubstrateconcentrationonfiveAnthraquinonesinRhubarb

3.6 大黃5種蒽醌類成分在大鼠肝微粒體中的酶動力學(xué)參數(shù)測定

在蛋白質(zhì)量濃度為1.0mg／mL的孵化體系中分別加入質(zhì)量濃度為0.875、1.75、3.5、7.0、14μg／mL的大黃5種蒽醌類成分，按2.4項下進行孵化反應(yīng)，按2.5項下處理樣品，測定剩余底物質(zhì)量濃度.根據(jù)Lineweave—Burk（雙倒數(shù)作圖法）方程［7］，求得大黃5種蒽醌類成分在肝微粒體中的Km、Vmax、Clint，結(jié)果見表1：

表1 大黃蒽醌類成分在肝微粒體中的酶動力學(xué)參數(shù)（± s，n＝5）Table1 ThekineticparametersofAnthraquinonesin Rhubarbinlivermicrosomes（±s，n＝5）

表1 大黃蒽醌類成分在肝微粒體中的酶動力學(xué)參數(shù)（± s，n＝5）Table1 ThekineticparametersofAnthraquinonesin Rhubarbinlivermicrosomes（±s，n＝5）

名稱 Km／（mg·L-1）Vmax／（mg·L-1·min-1）Clint／（min-1·10-2蘆薈大黃素）18.97±1.89 0.520±0.015 2.69±0.12大黃酸 2.50±0.11 0.066±0.003 2.56±0.16大黃素 15.68±1.09 0.410±0.009 2.61±0.20大黃酚 183.41±1.90 5.220±0.09 2.81±0.10大黃素甲醚1.37±0.14 0.036±0.0034 2.63±0.18

Km代表了酶對底物的親合能力，Km值越大，則酶對底物的親合能力越?。籆lint值代表了酶對底物的清除能力，Clint值越大，則酶對底物的清除能力越大［8］.結(jié)果表明，大鼠肝微粒體的酶系對大黃蒽醌類成分親和力由大到小的順序為：大黃素甲醚＞大黃酸＞大黃素＞蘆薈大黃素＞大黃酚；大鼠肝微粒體的酶系對大黃蒽醌類成分的清除能力由大到小的順序為：大黃酚＞蘆薈大黃素＞大黃素甲醚＞大黃素＞大黃酸.

3.7 大黃5種蒽醌類成分在4種不同誘導(dǎo)組大鼠肝微粒體中的代謝研究

經(jīng)DEX、PB、β-NF誘導(dǎo)后，大黃5種蒽醌類成分在大鼠肝微粒體中的代謝明顯提高，高、中、低質(zhì)量濃度大黃5種蒽醌類成分均為PB組、DEX組與CMC-Na組比較P＜0.05，有顯著差異，β-NF組與CMC-Na組比較P＞0.05，無顯著差異.結(jié)果見表2：

由此得.結(jié)論：大黃蒽醌類成分在PB、DEX誘導(dǎo)的肝微粒體中代謝較快，參考文獻PB主要誘導(dǎo)CYP3A4，DEX主要誘導(dǎo)CYP2A、2B、2C［9］，這說明CYP3A4、CYP2A6可能為介導(dǎo)大黃蒽醌類成分代謝的主要代謝酶.

3.8 抑制實驗

（1）非那西丁對大黃蒽醌類成分代謝的抑制實驗 在空白肝微粒體中加入質(zhì)量濃度為0、0.105、0.21、0.42mg／mL的非那西丁各50μL，再加入再生系統(tǒng)至1mL，預(yù)孵育5min，加入NADPH的l% NaHCO3溶液，共孵育30min，測定剩余底物質(zhì)量濃度，計算代謝速率v，以1／［s］對1／［v］作圖，兩直線交點的橫坐標(biāo)即為抑制常數(shù)Ki，其Dixon圖為一組相交于第二象限的直線.

（2）氟康唑?qū)Υ簏S蒽醌類成分代謝的抑制實驗

在空白肝微粒體中加入質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8mg／mL的氟康唑各25μL，照前述方法處理做Dixon圖.

（3）酮康唑?qū)Υ簏S蒽醌類成分代謝的抑制實驗

在空白肝微粒體中加入質(zhì)量濃度為0、0.031、0.062、0.124mg／mL的酮康唑各25μL，照前述方法處理做Dixon圖.

結(jié)果顯示，3組抑制試驗的Dixon圖均為相交于第二象限的直線，結(jié)果如圖6～8所示，3種抑制劑對大黃蒽醌類成分的抑制常數(shù)如表3所示：

表2 不同質(zhì)量濃度大黃蒽醌類成分在4種肝微粒體中代謝（±s，n＝5）Table 2 Different concentrations of anthraquinones in Rhubarb in four kinds ofmetabolism in liver m icrosomes（±s，n＝5）

表2 不同質(zhì)量濃度大黃蒽醌類成分在4種肝微粒體中代謝（±s，n＝5）Table 2 Different concentrations of anthraquinones in Rhubarb in four kinds ofmetabolism in liver m icrosomes（±s，n＝5）

注：與CMC-Na組相比：*P＜0.05

w／%組別 高質(zhì)量濃度PB組 DEX組 β-NF組 CMC-Na組蘆薈大黃素 55.63±2.37* 53.44±4.35*50.19±3.60 51.31±2.18大黃酸 61.86±2.33* 60.01±4.39* 53.06±5.06 54.22±1.89大黃素 64.88±2.11* 63.23±2.08* 60.91±1.93 60.24±2.56大黃酚 69.57±1.47* 68.71±3.78* 66.70±4.24 63.96±2.47大黃素甲醚 61.52±1.24* 62.10±1.77* 59.04±2.75 55.72±2.75w／%組別 中質(zhì)量濃度PB組 DEX組 β-NF組 CMC-Na組蘆薈大黃素 72.13±1.75* 71.68±1.51*68.04±1.99 67.49±3.24大黃酸 59.69±4.20* 54.61±5.27* 49.17±3.99 51.42±4.60大黃素 76.80±1.86* 76.46±2.10* 67.27±4.94 68.03±4.74大黃酚 79.50±5.86* 78.71±3.91* 70.27±5.85 64.52±8.37大黃素甲醚 61.26±4.74* 64.49±1.97* 58.67±4.34 57.48±6.38w／%組別 低質(zhì)量濃度PB組 DEX組 β-NF組 CMC-Na組蘆薈大黃素 85.65±2.27* 91.69±5.19*76.35±6.01 73.73±6.70 78.50±2.56 79.02±4.76大黃酸 87.11±2.30* 86.07±1.50* 74.37±9.53 78.36±2.31大黃素 70.76±2.43* 71.58±3.49* 62.73±6.76 62.50±1.75大黃酚 82.53±3.85* 83.45±3.39* 64.17±7.43 69.30±8.40大黃素甲醚 85.30±5.66* 85.47±3.93*

圖6 非那西丁對大黃蒽醌類成分代謝的抑制實驗Fig.6 Inhibition ofmetabolism to anthraquinones in Rhubarb by Phenacetin

圖7 氟康唑?qū)Υ簏S蒽醌類成分代謝的抑制實驗Fig.7 Inhibition ofmetabolism to anthraquinones in Rhubarb by Fluconazole

圖8 酮康唑?qū)Υ簏S蒽醌類成分代謝的抑制實驗Fig.8 Inhibition ofmetabolism to anthraquinones in Rhubarb by ketoconazole

表3 不同類型抑制劑對大黃蒽醌類成分抑制常數(shù)Table 3 The inhibition constants for different types of inhibitors of anthraquinones in Rhubarb

結(jié)論：非那西汀、氟康唑、酮康唑?qū)Υ簏S蒽醌類成分的Dixon圖直線均交于第二象限，說明3者均為為大黃蒽醌類成分的競爭性抑制劑.

4 討論

本實驗建立了測定肝微粒體酶中大黃5種蒽醌的高效液相色譜方法，經(jīng)回收率、精密度及線性關(guān)系等方法學(xué)驗證項目考察，表明此分析方法具有靈敏、準(zhǔn)確、快速的特點，能成功應(yīng)用于大黃5種蒽醌類成分在大鼠肝微粒體酶中的代謝研究.

研究不同酶抑制劑對藥物代謝的影響，可以了解藥物的代謝規(guī)律以及可能產(chǎn)生的藥物相互作用［10］.苯巴比妥鈉、地塞米松分別為CYP3A4、CYP2A6的特異性抑制劑，在本實驗中可以顯著影響大黃5種蒽醌類成分的代謝，說明CYP3A4、CYP2A6主要參與了大黃5種蒽醌類成分的代謝，是大黃5種蒽醌類成分的代謝的一個關(guān)鍵步驟.

酮康唑、氟康唑、非那西汀對大黃5種蒽醌類成分的Dixon圖均相交于第二象限，說明3者均為大黃5種蒽醌類成分的競爭性抑制劑，提示臨床用藥時可適當(dāng)增加大黃蒽醌類成分的給藥量.其機理可能是3者與大黃5種蒽醌類成分均具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，同時競爭酶上某一位點.3者的結(jié)構(gòu)式如圖所示：

在新藥研發(fā)的早期階段，了解何種肝藥酶參與藥物代謝及其本身對肝藥酶的影響，對于那些常與其他藥物合用的藥物尤為重要［11］.本研究對大黃5種蒽醌類成分的體外代謝做了初步的探討，為進一步研究藥物相互作用和進開發(fā)利用提供理論依據(jù).

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［責(zé)任編輯：劉蔚綏］

M etabolism and enzyme kinetics of five anthraquinones in rhubarb in rat liver m icrosomes

FENG Suxiang， WANG Mengmeng， WU Zhaoyu， LIXian， HAO Rui， XU Yanhua
（1.Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China；2.Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment＆Chinese Medicine Development of Henan Province，Zhengzhou 450046，China）

To study themetabolic kinetics of anthraquinones in rhubarb and participate in themetabolism of cytochrome P450 isoforms in rat livermicrosomal enzyme.Rat livermicrosomeswere prepared by using ultra-centrifugation method.anthraquinones in rat concentration in the incubation pool was determined by RP-HPLCmethod.The Michaelis-Menten parameters Kmand Vmaxin rat livermicrosomeswere initially estimated by analyzing Lineweave-Brurk plot.The clearance（Clint）was calculated for in vitro enzyme to anthraquinones in rhubarb.Various selective CYP inhibitors were used to investigate their inhibitory effects on themetabolism of anthraquinones in rhubarb and the principal CYP isoforms involved in anthraquinones in rhubarb metabolic ring.The K m，V max，and CLintof aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol，and physcion were（18.97±1.89），（2.50±0.11），（15.68±1.09），（183.41±1.90），（1.37±0.14）mg·L-1；（0.52±0.015），（0.066±0.003），（0.41±0.009），（5.22±0.09），（0.036 ±0.0034）mg·L-1·min-1；（2.69±0.12），（2.56±0.16），（2.61±0.20），（2.81±0.10），（2.63 ±0.18）min-1·10-2.After the induction of DEX，PB，β-NF，the anthraquinones in rhubarb metabolic rate of PB group and DEX group were higher than that of CMC-Na group，with a significant difference（P＜0.05）；the anthraquinones in rhubarb metabolic rate ofβ-NF group was lower than CMC-Na group（P＞0.05），both acetophenetidine，fonazole and ketoconazole's Dixon diagram were linears intersects the second quadrant.After induced by PB，DEX，the metabolism of anthraquinones in rhubarb were increase in rat livermicrosomes.Itwas shown that CYP3A4 and CYP2A6 are involved in themetabolism of anthraquinones in rhubarb，Both Acetophenetidine，F(xiàn)luconazole and Ketoconazole were competitive inhibitors of anthraquinones in rhubarb.

anthraquinones in rhubarb； rat livermicrosomes； CYP450； enzymatic kinetics

R285.8

A

1000-9965（2015）05-0383-09

10.11778／j.jdxb.2015.05.005

2015-06-01

國家自然科學(xué)基金資助項目（81274179）

馮素香（1971-），女，教授，博士研究生，研究方向：中藥質(zhì)量分析與新藥研究.E-mail：fengsx221＠163.com