劉郁瑩，崔曉騰，高星杰，趙秀娟，付雪，葛林，蘇超，楊潔,

（天津醫(yī)科大學(xué)1.生物化學(xué)系；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心；3.細(xì)胞生物學(xué)系，天津 300070）

論著

利用改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株

劉郁瑩1，崔曉騰1，高星杰2，趙秀娟3，付雪1，葛林1，蘇超2，楊潔1,2

（天津醫(yī)科大學(xué)1.生物化學(xué)系；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心；3.細(xì)胞生物學(xué)系，天津 300070）

目的：利用改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除HeLa細(xì)胞中SND1基因，構(gòu)建HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株。方法：設(shè)計(jì)一對特異性識別SND1基因第二個啟動子的上下游sgRNA，以PX462質(zhì)粒為載體，構(gòu)建出一對重組真核表達(dá)質(zhì)粒。酶切和測序鑒定后，將一對重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入HeLa細(xì)胞中，使用嘌呤霉素進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選，挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。最后用Western Blot鑒定敲除效果。結(jié)果：sgRNA正確插入到PX462質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)染并篩選單克隆后的細(xì)胞中沒有SND1蛋白的表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建出HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株。

SND1；基因敲除；CRISPR/Cas9；HeLa細(xì)胞

人類SND1（Staphylococcal Nuclease Domain-Containing Protein 1）蛋白是在不同種屬間具有高度保守性的蛋白質(zhì)[1-4]，廣泛參與細(xì)胞多種生物學(xué)過程[5-8]。本實(shí)驗(yàn)是利用改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，即以一對單鏈向?qū)NA（single guide-RNA, sgRNA）靶標(biāo)SND1基因，招募Cas9核酸酶的突變體Cas9n核酸切口酶（Cas9 D10 nickase,Cas9n）對其進(jìn)行切割，從而敲除SND1基因，構(gòu)建出HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株，為更加深入地研究SND1蛋白的功能提供了一個SND1基因敲除的人類細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 HeLa細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室留存；真核表達(dá)質(zhì)粒pSpCas9n（BB）-2A-Puro（PX462）由天津醫(yī)科大學(xué)吳旭東教授惠贈；trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、Trans2K PlusII DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BbsI、DMEM高糖培養(yǎng)基購自Thermo公司；T4連接酶購自NEB公司；質(zhì)粒保護(hù)的核酸外切酶（plasmid safe exonuclease）購自Epicentre公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Biomiga公司；Neofect轉(zhuǎn)染試劑購自零客創(chuàng)智生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒購自Pierce公司；鼠源SND1蛋白抗體為本實(shí)驗(yàn)室自制[9]；β-tubulin蛋白抗體購自Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗購自Fermentas公司；LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物購于KPL公司；RIPA裂解液、嘌呤霉素（puromycin）購自北京索萊寶科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司；Western blot電泳槽、電泳儀購自Bio-Rad公司。sgRNA序列合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；質(zhì)粒測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 針對SND1基因序列的sgRNA設(shè)計(jì) （1）采用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站確定人類SND1（NM_014390.2）的基因序列。（2）根據(jù)文獻(xiàn)提示[10]，使用 http：//crispr.mit.edu/設(shè)計(jì) SND1基因 double nick的上下游sgRNA。sgRNA設(shè)計(jì)原則：（1）sgRNA的5′端第一個堿基若不是G，則需要在前面加上1個G；（2）以sgRNA序列為模版，設(shè)計(jì)出其互補(bǔ)鏈；（3）sgRNA及其互補(bǔ)鏈分別添加BbsI的酶切位點(diǎn)。

1.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒PX462-sgRNA的構(gòu)建 （1）PX462載體線性化：使用快速限制性內(nèi)切酶BbsI線性化PX462質(zhì)粒載體，切膠回收。體系：1 μg PX462載體，1 μL BbsI，1 μL FastAP，2 μL 10×Green FastDigest Buffer，加水稀釋至20 μL。程序：37℃，30 min；4℃，stop。（2）sgRNA的合成及形成二聚體：人工合成sgRNA寡核苷酸鏈A、B及其互補(bǔ)鏈，使用降落PCR退火形成二聚體。體系：100 nmol sgRNA-A/B，100 nmol sgRNA-A/B的互補(bǔ)鏈，1 μL 10×T4 Ligation Buffer，0.5 μL T4 PNK，加水至10 μL。程序：37℃，30 min；95℃，5 min；-1℃/min，至25℃；4℃，stop。（3）sgRNA二聚體與PX462線性載體連接：PX462載體和降落PCR產(chǎn)物比例為1∶3，室溫（25℃）反應(yīng)60min。體系：PX462線性載體50ng，降落PCR產(chǎn)物150 ng，1 μL 10×T4 Ligation Buffer，加水稀釋至10 μL，1 μL T4 Ligase。程序：25℃，60 min；4℃，stop。（4）重組質(zhì)粒純化：使用質(zhì)粒保護(hù)的核酸外切酶去除非特異連接。體系：11μL二聚體與載體連接后的產(chǎn)物，1.5 μL 10×PlasmidSafe Buffer，1.5 μL 10mmolATP,1μLPlasmidSafeexonuclease。程序：37℃，30 min；4℃，stop。（5）轉(zhuǎn)化trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆搖菌，使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證。

1.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定 使用快速限制性內(nèi)切酶BbsI對PX462質(zhì)粒載體、PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B進(jìn)行酶切。體系：1 μg質(zhì) 粒 ，1 μL BbsI，1μL FastAP，2 μL 10×Green FastDigest Buffer，加水稀釋至20 μL。程序：37℃，30 min；4℃，stop。酶切后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.2.4 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒載體PX462和重組真核表達(dá)質(zhì)粒PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B。 HeLa細(xì)胞接種至6 cm皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),至細(xì)胞50%～60%匯合時，根據(jù)產(chǎn)品說明書使用Neofect轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體PX462（HeLa-SND1-WT）或共轉(zhuǎn)重組真核表達(dá)質(zhì)粒PX462-sgRNA-A和 PX462-sgRNA-B（HeLa-SND1-KO）。

1.2.5 HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株的單克隆篩選 轉(zhuǎn)染后48 h，更換培基為含有2 μg/mL Purom ycin和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，以未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞為陰性對照。加藥48 h后，未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞全部被殺死。72 h后撤去培基中的Puromycin繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿，將細(xì)胞用胰酶消化，鋪到10 cm皿中，平均每個顯微鏡低倍鏡視野中有3～5個細(xì)胞即可。待細(xì)胞長成單克隆集落，用槍頭分別將單克隆集落輕輕刮取，移至96孔板中培養(yǎng)。待96孔板長滿，移至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.6 HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株Western Blot檢測 將篩選后的單克隆穩(wěn)定株HeLa-SND1-WT和HeLa-SND1-KO分別傳至6 cm皿中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿，使用預(yù)冷的PBS緩沖液對細(xì)胞洗滌3次，吸凈PBS后，加入300μL RIPA裂解液，用干凈的細(xì)胞刮刮取細(xì)胞至1.5 mL離心管中，冰上靜置裂解15 min。之后對其進(jìn)行超聲處理，強(qiáng)度60%，時間30 s（1次10 s，間隔5 s，共進(jìn)行3次）。4℃13 000 r/min超速離心10 min，取上清細(xì)胞裂解液。用BCA蛋白測定試劑盒測定裂解液的蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液（50%甘油，10%SDS，0.5%溴酚藍(lán)，250 mmol pH6.8 Tris-HCl），99℃對其熱變性10 min。進(jìn)行8% SDS-PAGE電泳后，用濕電轉(zhuǎn)膜儀將PAGE膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF上。使用含有5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉2 h后，用自制鼠源SND1抗體4℃孵育過夜。使用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10 min。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗室溫孵育2 h。之后再用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10 min。孵育LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物1 min，進(jìn)入暗室曝光。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA靶點(diǎn)的選擇及寡核苷酸鏈的設(shè)計(jì) 由于SND1基因第1個外顯子區(qū)（expressed region 1, EXON 1）和基因編碼區(qū)（Coding Sequence,CDS）的重疊區(qū)域過短，因此選取第2個外顯子區(qū)進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作示意圖如圖1。設(shè)計(jì)好的sgRNA及其互補(bǔ)鏈如表1。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割SND1基因外顯子上下游Fig 1 CRISPR/Cas9 system cut the upstream and downstream of SND1

表1 上下游sgRNA及其互補(bǔ)鏈寡核苷酸序列Tab 1 The nucleotide sequences of the upstream and downstreamsgRNA

2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒PX462-sgRNA的酶切和測序結(jié)果 利用BbsI限制性內(nèi)切酶對構(gòu)建好的PX462-sgRNA-A和PX462-sgRNA-B進(jìn)行酶切。結(jié)果如圖2 A，成功構(gòu)建的質(zhì)粒不含有BbsI酶切位點(diǎn)，因此不能被切割為線性。測序結(jié)果如圖2 B，插入序列的位置、方向均正確，質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切和測序結(jié)果Fig 2 The enzyme digestion and sequencing of recombinant eukaryotic expressional plasmid

2.3 Western blot檢測HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株中SND1蛋白的表達(dá) 結(jié)果如圖3，同HeLa-SND1-WT相比，HeLa-SND1-KO中的SND1沒有表達(dá)，HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株構(gòu)建成功。

圖3 單克隆穩(wěn)定株Western blotFig 3 Western blotting of monoclonal stable strain

3 討論

SND1蛋白序列在不同生物中具有高度的保守性，參與調(diào)控細(xì)胞多種重要的生理過程。有研究表明，SND1蛋白在腫瘤遷移中也有作用[11]。因此，建立穩(wěn)定敲除SND1蛋白的細(xì)胞株有助于研究其生理病理?xiàng)l件下的功能。

本實(shí)驗(yàn)中，我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來完成對HeLa細(xì)胞中SND1基因的靶向性敲除。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,CRISPR）序列本是細(xì)菌抵御病毒入侵的防御機(jī)制，近年來科學(xué)家對其進(jìn)行改造，成為基因編輯的又一有力武器。傳統(tǒng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)是以sgRNA為向?qū)?，靶?biāo)目的基因，招募Cas9核酸酶對DNA雙鏈進(jìn)行切割，從而敲除該基因[12]。對比 ZFN（Zinc-finger nucleases） 技術(shù)和 TALEN（transcription activator-like effector nucleases）技術(shù)，此方法簡便易行，成為靶向基因編輯的重要技術(shù)。但是由于sgRNA長度的局限，傳統(tǒng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)容易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，即sgRNA識別到其他基因處，導(dǎo)致其他基因敲除。麻省理工學(xué)院的Zhang等[13]對其進(jìn)行改良，將Cas9核酸酶的RuvC結(jié)構(gòu)域中的天冬氨酸突變成丙氨酸（D10A），導(dǎo)致RuvC結(jié)構(gòu)域失去活性，突變后的Cas9酶變成Cas9n核酸切口酶，只能切割單鏈。如果DNA只被一個Cas9n切割，產(chǎn)生單鏈缺口，細(xì)胞很快利用堿基切除修復(fù)途徑進(jìn)行DNA修復(fù)。因此使用一對sgRNA對目的基因上下游進(jìn)行靶標(biāo)并招募Cas9n進(jìn)行切割，導(dǎo)致細(xì)胞利用非同源性末端接合（non-homologous end joining,NHEJ）機(jī)制進(jìn)行DNA修復(fù)。此修復(fù)機(jī)制并不精確，易產(chǎn)生框移突變，從而達(dá)到敲除目的基因的作用。

實(shí)驗(yàn)中，我們選擇PX462質(zhì)粒作為載體，該質(zhì)?？梢酝瑫r表達(dá)Cas9n和插入的sgRNA，簡化了表達(dá)Cas9n質(zhì)粒和sgRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的步驟。轉(zhuǎn)染后，使用2 μg/mL Puromycin進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選。同時使用未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞作為對照，也加入2 μg/mL Puromycin，待該細(xì)胞全部殺死時，即認(rèn)為轉(zhuǎn)染組存活下來的細(xì)胞為帶有Puromycin抗性的陽性細(xì)胞。之后撤掉藥物，使用完全培基對其進(jìn)行培養(yǎng)和單克隆篩選。最后，使用WesternBlot對單克隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定，從而獲得HeLa細(xì)胞SND1基因敲除穩(wěn)定株。

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（2015-04-13收稿）

Construction of HeLa SND1 knockout gene stable strain by using modified CRISPR/Cas9 gene editing system

LIU Yu-ying1,CUI Xiao-teng1,GAO Xing-jie2,ZHAO Xiu-juan3,FU Xue1,GE Lin1,SU Chao2,YANG Jie1.2
（Tianjin Medical University 1.Department of Biochemistry;2.Research Center of Basic Medical Science;3.Department of Cell Biology, Tianjin 300070,China）

Objective：To apply modified CRISPR/Cas9 gene editing system to knock out the SND1 gene in HeLa cell and construct HeLa SND1 gene knockout stable strain.Methods：A pair of sgRNAs that could specially identify the upstream and downstream of SND1 gene second promoter were designed,then a recombinant eukaryotic expressional plasmid by the carrier of PX462 was constructed.After enzyme digestion and sequencing,a pair of recombinant plasmids into HeLa cell were co-transfected,then puromycin was used to screen positive cell and the monoclonal cell was developed.The knockout effect was measured by western blotting.Results：sgRNA was correctly inserted into the PX462 recombinant plasmid,and SND1 protein was undetected in HeLa cell after transfection and screening of monoclonal cell.Conclusion：HeLa SND1 gene knockout stable strain can be successfully built.

SND1;gene knockout;CRISPR/Cas9;HeLa cells

Q7

A

1006－8147（2015）06-0480-04

劉郁瑩（1986-），女，碩士在讀，研究方向：腫瘤免疫；通信作者：楊潔，E-mail：yangji@tmu.edu.cn。