姚 芳，張 鵬，王元國

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心胸外科，天津300052）

論著

5-雜氮-2′-脫氧胞苷上調(diào)CK13表達(dá)并抑制人肺鱗癌YTMLC-9細(xì)胞增殖

姚 芳，張 鵬，王元國

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心胸外科，天津300052）

目的：探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮2′-脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine）對人肺鱗癌YTMLC-9細(xì)胞株增殖的影響及對細(xì)胞角蛋白13（CK13）表達(dá)和CK13基因甲基化的影響。方法：采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測不同濃度（1、2、5、10，20、40 μmol/L）5-aza-2′-deoxycytidine處理1～4 d后的5-aza-2′-deoxycytidine對人肺鱗癌YTMLC-9細(xì)胞株生長的影響；采用半定量PCR及Western blot檢測5 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine作用YTMLC-9 1～4 d CK13的表達(dá)；采用甲基化PCR檢測不同濃度（1、2、5、10 μmol/L）5-aza-2′-deoxycytidine處理48 h后CK13甲基化和非甲基化的變化。結(jié)果：5-aza-2′-deoxycytidine對人肺鱗癌YTMLC-9細(xì)胞株的生長具有明顯地抑制作用，當(dāng)用藥濃度高于20 μmol/L后產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性；5-aza-2′-deoxycytidine能夠上調(diào)CK13基因表達(dá)，呈時間依賴性。結(jié)論：5-aza-2′-deoxycytidine抑制人肺鱗癌YTMLC-9細(xì)胞的生長，抑制作用呈濃度、時間依賴性。5-aza-2′-deoxycytidine可以使CK13重新表達(dá)。其生物學(xué)效應(yīng)可能與CK13啟動子甲基化狀態(tài)改變有關(guān)。

5-aza-2′-deoxycytidine；YTMLC-9；細(xì)胞增殖；DNA甲基化；CK13

肺癌是最為常見的惡性腫瘤，近50年來世界上很多國家的肺癌發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢。據(jù)我國居民死因調(diào)查，肺癌死亡率20年間增加近1.5倍，在惡性腫瘤中增長最快。肺癌發(fā)生涉及遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)，近年來表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤中的作用受到廣泛重視，表觀遺傳學(xué)的研究對象是基因表達(dá)在時間和空間上的調(diào)控問題，其中最主要的兩個研究內(nèi)容是甲基化和組蛋白修飾，抑癌基因啟動子甲基化參與的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，己成為目前分子生物學(xué)領(lǐng)域研究基因表達(dá)調(diào)控的熱點(diǎn)。DNA甲基化可以影響抑癌基因表達(dá)，但并不改變DNA本身的序列和基因產(chǎn)物，因此這種改變可逆。運(yùn)用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制劑5-雜氮2′-脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine）通過DNA去甲基化作用可使多種CpG島過甲基化的抑癌基因重新表達(dá)，從而恢復(fù)抑癌功能[1-2]。CK13基因是黏膜非角化復(fù)層鱗狀上皮終末分化的標(biāo)志，可作為細(xì)胞惡性程度的標(biāo)志。近年來，對CK13基因在鱗狀細(xì)胞癌中的研究日益趨多，現(xiàn)有資料證明CK13基因與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-6]，CK13表達(dá)減低與其基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游CpG島過甲基化有關(guān)[7]。本研究用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮2′-脫氧胞苷處理人肺鱗癌細(xì)胞系YTMLC-9，觀察其對肺癌細(xì)胞生長增殖的影響及對CK13基因表達(dá)的影響，探討其影響腫瘤細(xì)胞生物活性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺鱗癌YTMLC-9細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibico公司，5-aza-2′-deoxycytidine購自美國Sigma公司，噻唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Amresco公司，無菌6孔板、96孔培養(yǎng)板購自丹麥Corning公司；提取RNA的Trizol、La Taq酶、2×GC Buffer、dNTP mixture、6× Loading Buffer等購自大連寶生物工程有限公司（Takara），DNA Marker DL2000、DNA提取試劑盒購自北京Tiangen生物技術(shù)有限公司，引物（北京奧科生物技術(shù)有限公司），CK13基因鼠抗人IgG單克隆抗體（美國Abcam公司），β-actin基因鼠抗人IgG抗體（北京博奧森公司），辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋公司），DNA重亞硫酸鹽修飾試劑盒購自美國Epigentek生物公司。

1.2 設(shè)備 醫(yī)用潔凈工作臺（美國Baker公司），水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司），空氣搖床（美國Thermo Forma公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），PCR擴(kuò)增儀(杭州晶格科學(xué)儀器公司；光學(xué)顯微鏡購自德國萊卡公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC-9常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（pH 7.4）中，在37℃、5%CO2、充分濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，每2～3 d傳代1次。傳代時用含EDTA的胰酶37℃消化3～5 min，選用對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 試劑配置 5-aza-2′-deoxycytidine用DMSO溶解配成濃度為2.0×105μmol/L的儲存液，-20℃保存，使用時用PRMI 1640培養(yǎng)液稀釋為工作液。MTT溶于PBS中，過濾除菌，濃度為5 mg/mL，避光冷藏。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞生長情況 采用5-aza-2′-deoxycytidine對人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC-9的生長抑制率進(jìn)行測定。將對數(shù)生長期細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于無菌96孔培養(yǎng)板，每孔體積為180 μL。過夜貼壁后，每孔各自加入 5-aza-2′-deoxycytidine使終濃度為1、2、5、10、20、40 μmol/L，以不加藥物為陰性對照組，終體積200 μL。共6組，每種濃度設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)處理24、48、72、96 h后每孔加入5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 80 μL，震蕩10 min，使紫藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀以570 nm為波長測吸光度值。細(xì)胞生長抑制率＝（對照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值）/對照組吸光值×100%，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以細(xì)胞生長抑制率（%）為縱坐標(biāo)，作用時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.5 半定量RT-PCR檢測CK13表達(dá) 將對數(shù)生長期細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于無菌6孔培養(yǎng)板。過夜貼壁后，每孔各自加入5-aza-2′-deoxycytidine使終濃度為5 μmol/L，以不加藥物為陰性對照組，每天換藥，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后提取RNA，檢測RNA質(zhì)量及濃度后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，分別以如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CK13的引物序列（擴(kuò)增產(chǎn)物為124 bp）：上游5′-GTGACTGGCACCTGAAG CA-3′，下游5′-AGGATGACCCGGTTGTTTT-3′；內(nèi)參GAPDH的引物序列（擴(kuò)增產(chǎn)物為152 bp）：上游：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游：5′-GGGTGGAATCATATTGGAAC-3′。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL；dNTP（2.5 μmol/L）2 μL；上游引物（10 μmol/L）1 μL；下游引物（10 μmol/L）1 μL；cDNA 1 μL；Easy Taq 0.125 μL；加ddH2O至25 μL。于PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火56℃30 s，延伸72℃30 s，35個循環(huán)；終止72℃10 min。取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer混合均勻后在含溴乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠200 V電壓電泳10 min分離，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。

1.6 Western blot檢測CK13蛋白表達(dá) 將對數(shù)生長期細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于無菌6孔培養(yǎng)板。過夜貼壁后，每孔各自加入5-aza-2′-deoxycytidine使終濃度為5 μmol/L，以不加藥物為陰性對照組，每天換藥，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后收集細(xì)胞，提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離細(xì)胞總蛋白，將蛋白通過電轉(zhuǎn)移印跡到NC膜上，5%脫脂奶粉/TBST液封閉；蛋白上樣量分別為30 g，CK13工作濃度為1∶1 000，β-actin工作液濃度為1∶1 000，二抗工作濃度為1∶10 000，ECL試劑發(fā)光，X線膠片曝光、顯影、定影，將條帶掃描后灰度分析。

1.7 MSP檢測CK13甲基化

1.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)、藥物作用及基因組DNA的提取與檢測 將對數(shù)生長期細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于無菌6孔培養(yǎng)板。過夜貼壁后，每孔各自加入 5-aza-2′-deoxycytidine使終濃度為1、2、5、10 μmol/L，以不加藥物為陰性對照組，每天換藥，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行提取基因組DNA（gDNA），按照說明書進(jìn)行，同時提取健康志愿者外周血淋巴細(xì)胞DNA作為陽性對照，用紫外分光光度計(jì)測定gDNA的濃度和純度，凝膠電泳質(zhì)檢，檢測gDNA完整性。外周血淋巴細(xì)胞DNA首先經(jīng)甲基化酶處理：模板DNA 5 μg，10×buffer 4 μL，50×SAM 2 μL，SssI甲基化酶4 μL，去離子水補(bǔ)至40 μL，37℃水浴6 h。經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理的DNA作為甲基化陽性對照，未經(jīng)該酶處理的DNA作為陰性對照，之后進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾，用于MSP檢測。

1.7.2 gDNA重亞硫酸鹽修飾 操作步驟嚴(yán)格按照美國Epigentek生物公司的gDNA重亞硫酸鹽修飾試劑盒推薦方案進(jìn)行，將得到的gDNA用于下一步實(shí)驗(yàn)或分裝凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7.3 甲基化特異性PCR（MSP）檢測CK13基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) 引物設(shè)計(jì)：本研究甲基化和非甲基化兩對引物設(shè)計(jì)序列見表1。

表1 CK13引物序列及產(chǎn)物長度Tab 1 The PCR primers and products lengths

以重亞硫酸氫鹽修飾的DNA為模板，分別以甲基化和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×GC buffer 12.5 μL；dNTP（2.5 μmol/L）2 μL；上游引物（10 μmol/L）1 μL；下游引物（10 μmol/L）1 μL；Template（修飾后gDNA）2 μL；LA Taq 0.3 μL；加ddH2O至25 μL。于PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，變性94℃30 s，退火68℃（非甲基化60℃）45 s，延伸72℃60 s，40個循環(huán)；終止72℃6 min。

1.7.4 PCR結(jié)果的判讀 取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer混合均勻后在含溴乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠200 V電壓電泳10 min分離，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。用甲基化特異性引物擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物表明存在DNA甲基化，僅非甲基化特異性引物擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物者表明不存在DNA甲基化，若同時出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物則考慮DNA部分甲基化，凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

2.1 5-aza-2′-deoxycytidine對YTMLC-9細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測發(fā)現(xiàn)5-aza-2′-deoxycytidine對人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC-9細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度（1～10 μmol/L）依賴性（P<0.05）；呈時間依賴性（24～96 h）（P<0.05），見圖1。但20 μmol/L 5-aza-2′-deoxycytidine作用的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，40 μmol/L濃度組細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)。

圖1 MTT法測定YTMLC-9在不同5-aza-2′-deoxycytidine濃度下的96 h細(xì)胞生長抑制率Fig 1 MTT cell proliferation assay in YTMLC-9 cell line

2.2 5-aza-2′-deoxycytidine對 YTMLC-9細(xì)胞CK13的mRNA表達(dá)的影響 細(xì)胞PCR電泳結(jié)果用 5 μmol/L的 5-aza-2′-deoxycytidine處理YTMLC-9細(xì)胞，經(jīng)圖像處理分析統(tǒng)計(jì)，GAPDH灰度值為參照，所有藥物組與對照組比較CK13 mRNA表達(dá)均增高，且隨著作用時間增加，CK13 mRNA表達(dá)水平上升，用藥24、48、72、96 h組較對照組上升百分比分別為 26.5%、68.7%、86.7%、209.6%（P<0.05）[上升百分比=（實(shí)驗(yàn)組值－對照組值）/對照組值）×100%]，見圖2、3。

圖2 5-aza-2′-deoxycytidine不同時間YTMLC-9細(xì)胞CK13的mRNA表達(dá)水平Fig 2 Changes of CK13 mRNA levels in YTMLC-9 cell line

圖3 5-aza-2′-deoxycytidine不同時間YTMLC-9細(xì)胞CK13的mRNA表達(dá)水平Fig 3 Changes of CK13 mRNA levels in YTMLC-9 cell line

2.3 5-aza-2′-deoxycytidine對 YTMLC-9細(xì)胞CK13蛋白表達(dá)的影響 用5 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine處理YTMLC-9細(xì)胞，經(jīng)圖像處理分析統(tǒng)計(jì)，β-actin灰度值為參照，所有藥物組與對照組比較CK13蛋白表達(dá)均增高，且隨著用藥時間增加，CK13蛋白表達(dá)水平上升，用藥24、48、72、96 h組較對照組上升百分比分別為 109.3%、301.3%、397.3%、478.7%（P<0.05）[上升百分比=（實(shí)驗(yàn)組值－對照組值）/對照組值）×100%]，見圖4、5。

圖4 5-aza-2′-deoxycytidine不同時間YTMLC-9細(xì)胞CK13的蛋白表達(dá)水平Fig 4 Changes of CK13 protein levels in YTMLC-9 cell line

2.4 5-aza-2′-deoxycytidine對 YTMLC-9細(xì)胞CK13基因甲基化的影響 用1～10 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine處理YTMLC-9細(xì)胞，隨著用藥濃度的增加，CK13發(fā)生去甲基化，甲基化逐漸減少，非甲基化逐漸增多，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但10 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine仍不能使CK13完全去甲基化，見圖6。

圖5 5-aza-2′-deoxycytidine不同時間YTMLC-9細(xì)胞CK13的蛋白表達(dá)水平Fig 5 Changes of CK13 protein levels in YTMLC-9 cell line

圖6 5-aza-2′-deoxycytidine對YTMLC-9細(xì)胞CK13基因甲基化的影響Fig 6 Changes of the methylation level of CK13 in YTMLC-9 cell line

3 討論

基因組的不穩(wěn)定通常會引起遺傳物質(zhì)改變，引發(fā)多種疾病，尤其是腫瘤和癌癥。細(xì)胞采用多種機(jī)制來保證DNA復(fù)制的真實(shí)性。DNA甲基化在DNA復(fù)制起始、錯配修復(fù)以及轉(zhuǎn)座子的失活等過程中對維持遺傳信息的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用[8-9]。DNA甲基化對基因的抑制活性是多方面導(dǎo)致的，DNA甲基化可能直接影響一些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性或DNA甲基化結(jié)合蛋白抑制了轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。在細(xì)胞中有些轉(zhuǎn)錄因子的特異結(jié)合位點(diǎn)中有CpG位點(diǎn)，這些位點(diǎn)發(fā)生甲基化的時候，就降低了轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合效率，從而減低基因的轉(zhuǎn)錄率。在多種癌細(xì)胞中有抑癌基因的過度甲基化，而這種過度甲基化與細(xì)胞內(nèi)高水平的DNMT是一致的。DNMT抑制劑能使因CpG島過甲基化而失活的抑癌基因重新表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖。

DNA去甲基化治療已被證實(shí)在骨髓增生異常綜合征（MDS）、白血病AML、CML的治療中取得較好療效。Liu等[2]發(fā)現(xiàn)5-aza-2′-deoxycytidine能呈時間和劑量依賴性抑制T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Molt4細(xì)胞的增殖，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。0.50 μmol/L地西他濱處理72 h后，Molt4細(xì)胞LTF基因啟動子甲基化率較低，mRNA和蛋白表達(dá)增加，caspase 3、caspase 9凋亡蛋白表達(dá)增加[10]。Zhang[11]報道了1例難治性AML（58%原始細(xì)胞）患者用5-aza-2′-deoxycytidine預(yù)處理后成功進(jìn)行造血干細(xì)胞移植。Kadia等[12]研究發(fā)現(xiàn)5-aza-2′-deoxycytidine能夠改善AML患者的預(yù)后。Hwang等[13]發(fā)現(xiàn)SPINT2具有腫瘤抑制活性，其功能可能與抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)信號HGF有關(guān)。在黑色素瘤中SPINT2沉默，而5-aza-2′-deoxycytidine處理后可以使SPINT2恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性。Zych等[1]研究發(fā)現(xiàn)5-aza-2′-deoxycytidine可以減少脂肪細(xì)胞增殖及分化，導(dǎo)致PPARG、FABP4下調(diào)，GATA2上調(diào)。但在不同組織中5-aza-2′-deoxycytidine作用不同。Pandey等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，在光動力療法（PDT）治療環(huán)境下，多種腫瘤模型中應(yīng)用5-aza-2′-deoxycytidine可以釋放多種腫瘤相關(guān)抗原（TAA）。免疫系統(tǒng)可以識別由腫瘤表面MHC I類分子呈遞的TAA，然后CTLs通過穿孔素和顆粒酶破壞腫瘤細(xì)胞。因此5-aza-2′-deoxycytidine潛在地增強(qiáng)免疫系統(tǒng)而抗腫瘤從而延長生存期。雖然5-aza-2′-deoxycytidine可作用于血液系統(tǒng)腫瘤，但由于5-aza-2′-deoxycytidine的細(xì)胞毒性及復(fù)甲基化，在實(shí)體腫瘤中的作用卻令人失望[16]。

研究顯示CK13基因與多種鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在口腔癌、鼻咽癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、皮膚癌等失表達(dá)，腫瘤抑制活性降低。CK13基因陽性表達(dá)率與鱗癌的組織分化程度相關(guān)，其表達(dá)隨腫瘤分化程度下降而下降，并且隨原發(fā)腫瘤的增大及向周圍的侵襲而表達(dá)逐步減少，證明該基因可能參與了腫瘤組織由高到低分化的演進(jìn)過程[17-23]。研究顯示，在癌細(xì)胞中，CK13的失活可能是通過CpG啟動子的過度甲基化來實(shí)現(xiàn)的。Winter等[7]發(fā)現(xiàn)CK13的組織特異性表達(dá)及在上皮性腫瘤中的異常表達(dá)與CK13基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的CpG甲基化密切相關(guān)，CpG低甲基化導(dǎo)致CK13基因表達(dá)，CpG島高甲基化導(dǎo)致CK13基因失活。因此5-aza-2′-deoxycytidine的生物學(xué)活性可能與CK13存在密切關(guān)系。

本研究中，筆者探討了5-aza-2′-deoxycytidine對肺癌細(xì)胞增殖的影響。數(shù)據(jù)顯示，5-aza-2′-deoxycytidine在較低濃度1 μmol/L時就抑制細(xì)胞生長，在10 μmol/L作用時，細(xì)胞就不再生長并凋亡，但是更高濃度的藥物就會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。以往研究顯示0.1 μmol/L或0.5 μmol/L 5-aza-2′-deoxycytidine可以使宮頸癌細(xì)胞T24去甲基化并且有很低的毒性，提高濃度后藥物會集合到復(fù)制的DNA中產(chǎn)生細(xì)胞毒性但是不抑制DNA甲基化。Liu等[2]研究發(fā)現(xiàn)5-aza-2′-deoxycytidine促進(jìn)HXO-RB44細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，MSP檢測顯示5-aza-2′-deoxycytidine作用濃度在0.5～5 μmol/L時，RASSF1A DNA非甲基化增加，甲基化減少，并呈劑量依賴性。在5 μmol/L藥物濃度作用HXORB44第4天，RASSF1A完全去甲基化，并且在第4天至第7天，RASSF1A表達(dá)明顯增加。Kantarjian等[24]認(rèn)為低劑量的5-aza-2′-deoxycytidine可以去甲基化，使基因重新表達(dá)，而不是最大耐受劑量。但研究者相信5-aza-2′-deoxycytidine通過使凋亡誘導(dǎo)基因的去甲基化重新恢復(fù)活性而產(chǎn)生抑癌作用，目標(biāo)主要在于復(fù)表達(dá)的基因或信號通路[25]。筆者研究也顯示5-aza-2′-deoxycytidine具有去甲基化作用，使抑癌基因CK13重新表達(dá)，并且呈時間依賴性。5 μmol/L的5-aza-2′-deoxycytidine可以有效抑制CK13基因啟動子甲基化。隨著濃度的提高，CK13基因啟動子去甲基化明顯增加，但不能完全去甲基化?？紤]藥物作用時間也是基因啟動子去甲基化的一個影響因素或者存在復(fù)甲基化。當(dāng)藥物濃度增高至產(chǎn)生細(xì)胞毒性時CK13并未完全去甲基化，此時藥物不再對CK13的去甲基化有明顯作用。數(shù)據(jù)表明由5-aza-2′-deoxycytidine誘導(dǎo)的CK13基因啟動子的去甲基化及重新表達(dá)對于細(xì)胞生長抑制、凋亡具有重要作用。

該研究顯示5-aza-2′-deoxycytidine可以抑制肺癌細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用可能與其使CK13去甲基化，重新表達(dá)有關(guān)。臨床上，只有產(chǎn)生細(xì)胞毒劑量或最大耐受劑量的 5-aza-2′-deoxycytidine才能抗白血病、骨髓多發(fā)性硬化癥，并且在治療Ⅰ、Ⅱ期的實(shí)性腫瘤過程中就產(chǎn)生大量的副作用[26]。5-aza-2′-deoxycytidine等更多的去甲基化藥物對于治療肺癌等腫瘤的生物活性機(jī)制及可行性需要更多探索。

[1] Zych J,Stimamiglio M A,Senegaglia A C,et al.The epigenetic modifiers 5-aza-2′-deoxycytidine and trichostatin A influence adipocyte differentiation in human mesenchymal stem cells[J].Braz J Med Biol Res,2013,46(5)：405

[2] Liu R,Zhang X H,Zhang K,et al.5-Aza-2''-deoxycytidine inhibits retinoblastoma cell by reactivating epigenetically silenced RASSF1A gene[J].Int J Ophthalmol,2014,7(1)：51

[3] Wang J,Lai Q,Pan H,et al.Evaluation of specific marker CK13 andCK10/13 combined with APM staining for the diagnosis of amniotic fluid embolism and aspiration[J].Forensic Sci Int,2014,238：108

[4] Rivarola de Gutierrez E,Innocenti A C,Cippitelli M J,et al. Determination of cytokeratins 1,13 and 14 in oral lichen planus[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal,2014,19(4)：e359

[5] Nobusawa A,Sano T,Negishi A,et al.Immunohistochemical staining patterns of cytokeratins 13,14,and 17 in oral epithelial dysplasia including orthokeratotic dysplasia[J].Pathol Int,2014,64 (1)：20

[6]丁凱，毛志福，孫作永.食管鱗癌中細(xì)胞角蛋白13的表達(dá)及臨床意義[J].疑難病雜志,2010,9(10)：746

[7] Winter H,Rentrop M,Nischt R,et al.Tissue-specific expression of murine keratin CK 13 in internal stratified squamous epithelia and its aberrant expression during two-stage mouse skin eareinogenesis is associated with the methylation slate of a distinct CpG site in the remote 5-flanking region of the gene[J].Differentiation,1990, 43(2)：105

[8] Su Y,Xu H,Xu Y,et al.Azacytidine inhibits the proliferation of human promyelocytic leukemia cells (HL60)by demethylation of MGMT,DAPK and p16 genes[J].Hematology,2012,17(1)：41

[9] Momparler R L,C?té S,Momparler L F,et al.Epigenetic therapy of acute myeloid leukemia using 5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine) in combination with inhibitorsofhistone methylation and deacetylation[J].Clin Epigenetics,2014,6(1)：19

[10]Liu J,Huang C,Cheng H,et al.Effects of decitabine against acute T lymphoblastic leukemia cell line Molt4[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi,2015,36(3)：230

[11]Zhang C,Chen X H,Liu J,et al.Decitabine as a conditioning regimen in haploidentical stem cell transplantation for refractory acute myeloid leukaemia[J].J Clin Pharm Ther,2015,40(3)：336

[12]Kadia T M,Thomas X G,Dmoszynska A,et al.Decitabine improves outcomes in older patients with acute myeloid leukemia(AML)and higher blast counts[J].Am J Hematol,2015,90(7)：E139

[13]Hwang S,Kim H E,Min M,et al.Epigenetic silencing of SPINT2 promotes cancer cell motility via HGF-MET pathway activation in melanoma[J].J Invest Dermatol,2015,135(9)：2283

[14]Pandey A,Kurup A,Shrivastava A,et al.Cancer testes antigens in breastCancer：biologicalrole,regulation,and therapeutic applicability[J].Int Rev Immunol,2012,31(5)：302

[15]Wachowska M,Gabrysiak M,Muchowicz A,et al.5-Aza-2'-deoxycytidine potentiates antitumour immune response induced by photodynamic therapy[J].Eur J Cancer,2014,50(7)：1370

[16]Graham M R,Ryan P,Baker J S,et al.Counterfeiting in performance-and image-enhancing drugs[J].Drug Test Anal,2009, 1(3)：135

[17]Takashima M,Kawachi H,Yamaguchi T,et al.Reduced expression of cytokeratin 4 and 13 is a valuable marker for histologic grading of esophageal squamous intraepithelial neoplasia[J].J Med Dent Sci, 2012,59(1)：17

[18]Huang Y,Li P,Xu Y,et al.The expression of CK4,CK13 in hypopharyngealsquamouscellcarcinomousand itsclinical significance[J].J Clin Otothiolaryngol Head Neck Surg,2014,28 (12)：874

[19]Nobusawa A,Sano T,Negishi A,et al.Immunohistochemical staining patterns of cytokeratins 13,14,and 17 in oral epithelial dysplasia including orthokeratotic dysplasia[J].Pathol Int,2014,64 (1)：20

[20]Wang J,Lai Q,Pan H,et al.Evaluation of specific marker CK13 and CK10/13 combined with APM staining for the diagnosis of amniotic fluid embolism and aspiration[J].Forensic Sci Int,2014,238：108

[21]Rivarola de Gutierrez E,Innocenti A C,Cippitelli M J,et al. Determination of cytokeratins 1,13 and 14 in oral lichen planus[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal,2014,19(4)：e359

[22]Nobusawa A,Sano T,Negishi A,et al.Immunohistochemical staining patterns of cytokeratins 13,14,and 17 in oral epithelial dysplasia including orthokeratotic dysplasia[J].Pathol Int,2014,64 (1)：20

[23]Yamashina M,Sato K,Tonogi M,et al.Evaluation of superficial oral squamous cell malignancy based on morphometry and immunoexpression of cytokeratin 13 and cytokeratin 17[J].Acta Cytol,2014,58(1)：67

[24]Kantarjian H M,O’brien S,Huang X,et al.Survival advantage with decitabine versus intensive chemotherapy in patients with higher risk myelodysplastic syndrome：comparison with historical experience[J].Cancer,2007,109(6)：1133

[25]Shakya R,Gonda T,Quante M,et al.Hypomethylating therapy in an aggressive stroma-rich model of pancreatic carcinoma[J].Cancer Res,2013,73(2)：885

[26]Takahashi Y,Kimura S,Okano M.Pharmacological profiles and clinical roles of 5-azacitidine(Vidaza(?)for injection 100 mg)for the treatment of myelodysplastic syndrome (MDS)[J].Nihon Yakurigaku Zasshi,2012,140(5)：235

（2015-04-13收稿）

5-Aza-2′-deoxycytidine inhibits human lung squamous carcinoma YTMLC-9 cell by epigenetically silenced CK13 gene in vitro

YAO Fang,ZHANG Peng,WANG Yuan-guo
（Department of Cardiothoracic Surgery，General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China）

Objective：To explore the effect of the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidine on human lung squamouscarcinoma YTMLC-9 cell lines and the methylation of CK13.Methods：Human lung squamous-carcinoma YTMLC-9 cell lines were treated for 1 to 4 days by 5-aza-2′-deoxycytidine with 1,2,5,10,20,40 μmol/L,respectively.Consequently,the inhibition rate of the cells were detected by MTT assay,and morphological pattern were observed.CK13 mRNA and protein levels were measured by semiquantitative RT-PCR and Western blot,respectively,after cells were treated with 5 μmol/L 5-aza-2′-deoxycytidine for one to four days. The methylation level of CK13 were detected by methylation-specific polymerase chain reaction(MSP).Results：MTT results showed that the proliferation ability of YTMLC-9 cells was inhibited by 5-aza-2′-deoxycytidine from 1 μmol/L to 10 μmol/L.Furthermore, concentration-dependent and time-dependent manner were shown by(P<0.05).But higher concentration drug derived cells especially under 40 μmol/L,were with higher cytoxicity;CK13 expression was reactivated at mRNA and protein level.Incubation time and dose of 5-aza-2′-deoxycytidine also functioned were discovered as factors for the demethylation status of CK13 promoter DNA and CK13 expression.The methylation of CK13 gene promoter was down-regulated by 5-aza-2′-deoxycytidine in a concentration-dependent manner.Conclusion：The proliferation ability of YTMLC-9 cells can be inhibited by 5-aza-2′-deoxycytidine in a concentration-dependent and time-dependent manner.CK13 expression can be reactivated in cells incubated with 5-aza-2′-deoxycytidine.These may associate with the downregulation of CK13 gene promoter methylation.

5-aza-2′-deoxycytidine;human lung squamous-carcinoma YTMLC-9;cell proliferation;DNA methylation;CK13

R734.2

A

1006－8147（2015）06-0474-06

姚芳（1989-），女，碩士在讀，研究方向：胸心外科；E-mail: yaofang198902@163.com。