周海勇

（山東省濱州市濱城區(qū)楊柳雪鎮(zhèn)獸醫(yī)站,山東濱州 256600）

致病性副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

周海勇

（山東省濱州市濱城區(qū)楊柳雪鎮(zhèn)獸醫(yī)站,山東濱州 256600）

副豬嗜血桿菌（haemophilus parasuis，Hps）是引起豬格氏病（Glassers’Disease）的致病菌，近年來隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)模化、集約化發(fā)展，豬格氏病感染有明顯增加趨勢，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前，我國獸醫(yī)臨床中常使用抗菌藥物進(jìn)行細(xì)菌性疫病的預(yù)防控制，但抗菌藥物的大量濫用，導(dǎo)致了耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，對(duì)如何正確使用藥物防控該病提出了更高的要求[4]。2014年春，山東省濱州某規(guī)?；i場斷奶仔豬突然發(fā)病，發(fā)病率高達(dá)20 %，死亡率達(dá)40 %，病豬精神沉郁、食欲減退直至禁食、體溫升高、咳嗽、呼吸困難，站立困難甚至癱瘓，剖檢病死豬可見胸膜炎、腹膜炎、腦膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎等典型病理變化。根據(jù)臨床癥狀和剖檢診斷為疑似副豬嗜血桿菌感染，為進(jìn)一步確診，本研究進(jìn)行了細(xì)菌分離與鑒定等實(shí)驗(yàn)室診斷，并對(duì)分離菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，篩選出了對(duì)該致病菌比較敏感的幾種藥物，為發(fā)病豬場防控措施的制定提供了參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源

無菌采集7頭病死豬心臟、脾臟和關(guān)節(jié)組織。

1.2 培養(yǎng)基、生化鑒定管、藥敏片

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和煙酰胺嘌呤二核苷酸（NAD）購自山東省榮成市雨林生物工程有限公司；新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化

無菌取7只病死豬的心臟、脾臟和關(guān)節(jié)組織分別劃線接種于TSA平板（含0.001% NAD和5 %牛血清）37 ℃培養(yǎng)至48 h，觀察菌落特征。取平板上的單個(gè)菌落再劃線接種于相同培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察

取純化菌落水平劃線于血平板，再取葡萄球菌垂直于水平線劃線，37 ℃培養(yǎng)至48 h，觀察血平板上是否具有溶血和衛(wèi)星生長現(xiàn)象。

1.6 生化鑒定

取分離菌株按常規(guī)方法分別進(jìn)行葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、尿素酶、吲哚試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)等生化鑒定試驗(yàn)。

1.7 致病性試驗(yàn)

取分離菌株增殖培養(yǎng)后，通過活菌計(jì)數(shù)調(diào)整菌液濃度使其成含菌量為109～1010CFU/ml懸浮液，分別經(jīng)腹腔注射5只小鼠，同時(shí)取5只小鼠注射滅菌生理鹽水作為對(duì)照。分別隔離飼養(yǎng)，觀察7 d。

1.8 藥敏試驗(yàn)

按常規(guī)方法分別測定分離菌株對(duì)常見10種藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化結(jié)果

7份分離組織樣品中有6份在含NAD和血清的TSA平板上長出的針尖大小、無色透明、邊緣整齊菌落。將6株分離菌株經(jīng)平板純化后，菌落大小均一，均呈針尖大小、無色透明、邊緣整齊。

2.2 形態(tài)觀察結(jié)果

革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)6株分離菌株均為革蘭陰性菌，細(xì)小桿菌，有的為短桿狀，有的則細(xì)長，以細(xì)桿狀居多。

2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察結(jié)果

在葡萄球菌劃線周圍長出邊緣整齊、無色透明的不溶血菌落，且具葡萄球菌越近，菌落越大，呈明顯的衛(wèi)星現(xiàn)象。

2.4 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果詳見表1，從表中可以看出，6株分離菌株均符合副豬嗜血桿菌的生化特性。

表1 6株分離菌株的生化特性

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)

6株分離菌株分別接種的5只小鼠中，有2株分離株死亡4只小鼠，4株分離株死亡5只小鼠，6株分離菌株的致死率均達(dá)到80 %以上，部分分離菌株的致死率已達(dá)到100 %，表明分離毒株均具有較強(qiáng)的致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果詳見表2。6株分離菌株對(duì)10種藥物均存在不同程度的耐藥性，其中對(duì)環(huán)丙沙星、甲氧芐啶最高。同時(shí)也篩選出紅霉素、阿米卡星2種敏感藥物。

表2 分離菌株對(duì)10藥物的敏感性

3 討論

副豬嗜血桿菌對(duì)營養(yǎng)和環(huán)境要求較嚴(yán)格，本研究采用含NAD和血清的TSA平板對(duì)7份臨床組織病料進(jìn)行了分離鑒定，共獲得6株副豬嗜血桿菌，分離成功率達(dá)85.71 %。同時(shí)本研究采用賀云霞等[4]和王雪敏等[5]的試驗(yàn)方法，利用小鼠作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行6株分離菌株的致病性研究，結(jié)果表明6株分離菌株均為致病性菌株，由此可以認(rèn)為，致病性副豬嗜血桿菌是引起該豬場斷奶仔豬死亡的主要病因。同時(shí)，本研究利用藥敏試驗(yàn)篩選出了該豬場致病性副豬嗜血桿菌的紅霉素、阿米卡星2種敏感藥物，為及時(shí)進(jìn)行藥物防治進(jìn)行了科學(xué)指導(dǎo)，以減少該病造成的經(jīng)濟(jì)損失。

[1] 苗立中，李書光，胡琳琳. 副豬嗜血桿菌病發(fā)病概況及診斷方法[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（6）：144-148.

[2] 王建，邵衛(wèi)星，呂占軍，等. 2012年我國部分省市規(guī)?；i場副豬嗜血桿菌分離鑒定及菌株血清分型[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，201435（3）：52-56.

[3] 林雙喜，李云. 成功控制保育豬副豬嗜血桿菌病的案例分析[J].養(yǎng)豬，2013，（6）：123-125.

[4] 賀云霞，徐慧，葉飛，等. 副豬嗜血桿菌15個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)分離株對(duì)小鼠毒力的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，（9）：90-91.

[5] 王雪敏，路明華，陳小玲，等. 副豬嗜血桿菌的分離鑒定及相關(guān)特性研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（5）：211-215.