郭 睿 曹院章齊海霞 王艷紅 張雪梅 王丹怡

（北京市朝陽區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,北京 100018）

動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法的改良

郭 睿 曹院章＊齊海霞 王艷紅 張雪梅 王丹怡

（北京市朝陽區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,北京 100018）

本文概述了β-受體激動劑殘留檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的改進措施，比對了檢測樣品前處理的內(nèi)標法和外標法檢測結(jié)果的準確度和精密度，為實驗室檢測方法的實施提供參考。

β-受體激動劑 危害 內(nèi)標法 外標法 準確度 精密度

β受體激動劑包括非選擇性的β受體激動劑及選擇性心臟β1受體激動劑，選擇性β2受體激動劑等。本文主要參考農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008，該標準規(guī)定了動物源性食品中特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥洛特羅和噴布特羅殘留檢測制樣和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本文中主要以測定鹽酸萊克多巴胺、硫酸沙丁胺醇和鹽酸克倫特羅為例，進一步闡述β-受體激動劑殘留液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法在實踐中采用內(nèi)標法而放棄外標法的原因。

1 名詞釋義

內(nèi)標物：將一個已知質(zhì)量，樣品中不含有雜質(zhì)的純物質(zhì)，加入至待測樣品溶液中，以此純物質(zhì)的量為標準，對比測定待測組分的含量，該純物質(zhì)稱為內(nèi)標物。

內(nèi)標法：（internal standard method）是色譜分析中一種比較準確的定量方法，是指將一定重量的內(nèi)標物，加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對含有內(nèi)標物的樣品進行色譜分析，分別測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積（或峰高）及相對校正因子，按公式和方法即可求出被測組分在樣品中的百分含量。

外標法：是以待測成分的對照品作為對照物質(zhì)，相對比較以求得供試品含量。

準確度：指在一定實驗條件下多次測定的平均值與真值相符合的程度，以誤差來表示。它用來表示系統(tǒng)誤差的大小。在實際工作中，通常用標準物質(zhì)或標準方法進行對照試驗，在無標準物質(zhì)或標準方法時，常用加入被測定組分的純物質(zhì)進行回收試驗來估計和確定準確度。

精密度：是在規(guī)定的條件下，獨立測量結(jié)果間的一致程度。分析時，常用RSD表示精密度。

2 β-受體激動劑檢測方法

2.1 外標法

2.1.1 原理:試料中的殘留藥物經(jīng)酶解，用高氯酸調(diào)pH值后高速離心沉淀蛋白，上清液調(diào)pH值后分別用乙酸乙酯和叔丁基甲醚（TBME）提取，再用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

2.1.2 檢測步驟

（1）樣品的制備

取適量新鮮或冷凍的豬肉或豬肝組織，絞碎并勻質(zhì)；

取適量新鮮或冷凍的牛奶，混合均勻；

取適量新鮮或冷凍的雞蛋，去殼后混合均勻。

制備的豬肝、豬肉、牛奶和雞蛋樣品儲存于-20℃以下備用。

（2）制備試料

取勻質(zhì)的供試料品作為供試試料；

取勻質(zhì)的空白樣品作為空白試料；

取勻質(zhì)的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液作為空白添加試料。

（3）酶解

準確稱取勻漿樣品2g（精確到0.01g）于50mL離心管內(nèi)，加入0.2mol/L乙酸銨溶液（pH=5.2）8.0mL，再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶40μL，渦旋混勻，于37℃下避光恒溫振蕩16h。

（4）提取

酶解后放置至室溫，渦旋混勻，10000r/min高速離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50ml離心管中，加入高氯酸溶液5ml，渦旋混勻，用高氯酸調(diào)pH至1.0±0.2，10000r/min高速離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50ml離心管中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15ml，渦旋混勻，振蕩10min，5000r/min高速離心5min，取上層有機相至另一離心管中，再在下層水相中加入叔丁基甲醚10mL，渦旋混勻振蕩10min，5000r/min高速離心5min，合并有機相，50℃平行蒸發(fā)至干，用甲酸水溶液5ml溶解，備用。

（5）凈化

MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水各3ml活化，取備用液全部過柱，再依次用2%甲酸水、甲醇各3ml淋洗，抽干，用3%氨水甲醇溶液2.5ml洗脫，洗脫液在50℃下用氮氣吹干，殘留物用甲醇-0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）0.2ml溶解，渦旋混勻，樣液經(jīng)0.2μm針孔過濾器過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

（6）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：BEH C18柱，50 mm×2.1mm（i.d.），粒度1.7μm。

流動相：A相：0.1%甲酸乙腈溶液；B相：0.1%甲酸水溶液。

梯度洗脫：0～2min，維持4%A；2～12min，4%A線性變化至60%A；12～12.1min，60%A線性變化至4%A；12.1～16min，維持4%A。

流速：0.3ml/min。

進樣量：10μl。

柱溫：30℃。

離子源：電噴霧ESI正離子。

掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM。然后以30℃/min升至260℃，保持1min，再以20℃/min升至280℃，保持2min，直至樣品的組分全部流出。

監(jiān)測離子對：

沙丁胺醇m/z 240.1-147.7（定量離子）、240.1-221.9；

克倫特羅m/z 277.1-202.8（定量離子）、277.1-258.9；

萊克多巴胺m/z 302.3-106.7（定量離子）、302.3-163.8；

（7）質(zhì)譜分析

在上述工作條件下，通過儀器工作軟件繪制標準曲線，以色譜峰面積定量。

（8）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證

按上述工作條件測定樣品和標準工作液，分別計算樣品和標準工作液中非定量離子與定量離子對色譜峰面積的比值，僅當兩者數(shù)值的相對標準偏差小于25%時方可確定兩者為同一物質(zhì)。

（9）準確度

本方法在0.25～2μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，用空白添加校準校正，其回收率范圍為70%～120%。

（10）精密度

本方法批內(nèi)相對標準偏差≤20%，批間相對標準偏差≤20%。

（11）結(jié)果判定

β-受體激動劑液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法的方法檢出限為0.25μg/kg，定量限為0.5μg/kg，判定檢測結(jié)果大于0.5μg/kg時為陽性。

2.2 內(nèi)標法

2.2.1 原理:試料中的殘留藥物經(jīng)酶解，用高氯酸調(diào)pH值后高速離心沉淀蛋白，上清液調(diào)pH值后分別用乙酸乙酯和叔丁基甲醚（TBME）提取，再用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

2.2.2 檢測步驟

（1）樣品的制備

取適量新鮮或冷凍的豬肉或豬肝組織，絞碎并勻質(zhì)；取適量新鮮或冷凍的牛奶，混合均勻；

取適量新鮮或冷凍的雞蛋，去殼后混合均勻。

制備的豬肝、豬肉、牛奶和雞蛋樣品儲存于-20℃以下備用。（2）制備試料

取勻質(zhì)的供試料品作為供試試料；取勻質(zhì)的空白樣品作為空白試料；取勻質(zhì)的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液作為空白添加試料。

在所有的供試試料、空白試料和空白添加試料中都加入等量的適宜濃度的內(nèi)標標準工作液。

（3）酶解

準確稱取勻漿樣品2g（精確到0.01g）于50ml離心管內(nèi)，加入0.2mol/L乙酸銨溶液（pH=5.2）8.0ml，再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶40μl，渦旋混勻，于37℃下避光恒溫振蕩16h。

（4）提取

酶解后放置至室溫，渦旋混勻，10000r/min高速離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50ml離心管中，加入高氯酸溶液5ml渦旋混勻，用高氯酸調(diào)pH至1.0±0.2，10000r/min高速離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50ml離心管中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15ml，渦旋混勻，振蕩10min，5000r/min高速離心5min，取上層有機相至另一離心管中，再在下層水相中加入叔丁基甲醚10ml，渦旋混勻振蕩10min，5000r/min高速離心5min，合并有機相，50℃平行蒸發(fā)至干，用甲酸水溶液5mL溶解，備用。

（5）凈化

MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水各3ml活化，取備用液全部過柱，再依次用2%甲酸水、甲醇各3ml淋洗，抽干，用3%氨水甲醇溶液2.5ml洗脫，洗脫液在50℃下用氮氣吹干，殘留物用甲醇-0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）0.2ml溶解，渦旋混勻，樣液經(jīng)0.2μm針孔過濾器過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

（6）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：BEH C18柱，50 mm×2.1mm（i.d.），粒度1.7μm。

流動相：A相：0.1%甲酸乙腈溶液；B相：0.1%甲酸水溶液。

梯度洗脫：0～2min，維持4%A；2～12min，4%A線性變化至60%A；12～12.1min，60%A線性變化至4%A；12.1～16min，維持4%A。

流速：0.3ml/min。

進樣量：10μl。

柱溫：30℃。

離子源：電噴霧ESI正離子。

掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM。然后以30℃/min升至260℃，保持1min，再以20℃/min升至280℃，保持2min，直至樣品的組分全部流出。

監(jiān)測離子對：

沙丁胺醇m/z 240.1-147.7（定量離子）、240.1-221.9；

克倫特羅m/z 277.1-202.8（定量離子）、277.1-258.9；

萊克多巴胺m/z 302.3-106.7（定量離子）、302.3-163.8；

氘代沙丁胺醇m/z 240.1-147.7（定量離子）；

氘代克倫特羅m/z 277.1-202.8（定量離子）；

氘代萊克多巴胺m/z 302.3-106.7（定量離子）。

（7）質(zhì)譜分析

在上述工作條件下，通過儀器工作軟件繪制標準曲線，以色譜峰面積按內(nèi)標法定量，沙丁胺醇以氘代沙丁胺醇為內(nèi)標物計算，克倫特羅以氘代克倫特羅為內(nèi)標物計算，萊克多巴胺以氘代萊克多巴胺為內(nèi)標物計算。

（8）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證

按上述工作條件測定樣品和標準工作液，分別計算樣品和標準工作液中非定量離子與定量離子對色譜峰面積的比值，僅當兩者數(shù)值的相對標準偏差小于25%時方可確定兩者為同一物質(zhì)。

（9）準確度

本方法在0.25μg/kg～2μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，用空白添加校準校正，其回收率范圍為80%～110%。

（10）精密度

本方法批內(nèi)相對標準偏差≤15%，批間相對標準偏差≤15%。

（11）結(jié)果判定

β-受體激動劑液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法的方法檢出限為0.25μg/kg，定量限為0.5μg/kg，判定檢測結(jié)果大于0.5μg/kg時為陽性。

3 比對

實驗次目外標法內(nèi)標法準確度（添加回收率%）精密度（RSD%）曲線相關(guān)系數(shù)準確度（添加回收率%）精密度（RSD%）曲線相關(guān)系數(shù)20150128115～12028.90～31.330.9944～0.9962105～108.50～2.660.9995～0.9998 20150212125～1608.58～12.400.9082～0.9243100～1104.76～8.250.9988～0.9998 201504170～1021.42～56.780.3244～0.378080～93.34.22～4.680.9976～0.9989 2015041890～1609.12～14.320.9748～0.999780～1105.59～7.530.9891～0.9990

4 結(jié)語

通過多次實驗結(jié)果準確度和精密度的比對，可以清楚地判斷β-受體激動劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測的內(nèi)標法優(yōu)于外標法。內(nèi)標法靈敏度高，定性準確，可以更有效地保證準確性的穩(wěn)定性，精密度的一致性，同時保證校正曲線的相關(guān)系數(shù)達到實驗的要求，在一定程度上保證實驗有效，出具結(jié)果準確，因此，我們在臨床實驗中將β-受體激動劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測外標法改進為內(nèi)標法。

郭睿（1981-），職稱:中級獸醫(yī)師，研究方向:實驗室管理及檢測。

曹院章（1966-），職稱:中級獸醫(yī)師，研究方向:檢疫及獸藥殘留檢測。