張 鼎，陳 帥，高淑云

(徐州工程學院，江蘇徐州 221008)

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響應面法優(yōu)選熒光測定維生素C的工藝條件研究

張 鼎，陳 帥，高淑云*

(徐州工程學院，江蘇徐州 221008)

[目的]利用苯甲酸與維生素C反應生成熒光物質(zhì)的特性，建立一種測量維生素C含量的方法。[方法]試驗采用氫氧化鈉-鄰苯二甲酸氫鉀作為緩沖溶液調(diào)節(jié)緩沖液pH，并通過對測定前處理樣品的時間、溫度、緩沖液pH以及苯甲酸用量等單因素試驗來確定最佳單因素水平，并用響應面法優(yōu)化試驗條件，確定以苯甲酸為促熒光物質(zhì)測定飲品中維生素C的最佳測定條件。[結果]苯甲酸對維生素C促熒光明顯，可在激發(fā)波長310 nm，發(fā)射波長410 nm處測其產(chǎn)物的熒光強度。維生素C濃度在1.00×10-4～5.05×10-4g/ml范圍內(nèi)其熒光強度呈良好的線性關系，檢測限較低，相關系數(shù)為0.989。[結論]研究表明，熒光法測定飲品中維生素C結果比較準確，方法可行。

維生素C；熒光分析法；苯甲酸；響應面法

維生素C的測定方法主要有光度法、電化學法、滴定法、酶法、色譜法等[1]。Deutsch和Weeks曾經(jīng)報道過一種檢測維生素C的熒光分析法(OPDA)，并被指定為維生素C的經(jīng)典熒光分析法。在該方法中，維生素C先被活性炭(Norit)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，DHAA再與熒光底物鄰苯二胺(OPDA)結合生成熒光產(chǎn)物，通過對該熒光產(chǎn)物的檢測實現(xiàn)對維生素C的定量分析[2]。鄰苯二胺本身有很強的熒光，而且過量的活性炭會吸附一定量的維生素C，所以有人提出了一種新的測定維生素C的熒光分析方法[3]。基于維生素C被Cu2+氧化為DHAA，DHAA進一步與苯甲酸及十六烷基三甲基溴化銨產(chǎn)生熒光協(xié)同增敏作用，通過對體系熒光強度的測定進行維生素C的定量分析。該方法所涉及的體系穩(wěn)定性好，但需要進行加熱，且反應時間較長[4]。

該研究的基本思路是，在試驗的基礎上，嘗試探索和尋找一種效果更好的氧化劑氧化維生素C(抗壞血酸)。在不外加氧化劑的條件下，苯甲酸與維生素C在特定的酸度條件下可反應生成一種較強的熒光物質(zhì)，其熒光強度與維生素C的濃度成正比，據(jù)此建立了新的熒光測定維生素C的方法。與經(jīng)典的Deutsch熒光方法相比，反應底物熒光較弱，降低了背景干擾，與文獻報道的熒光方法相比，該反應不需外加氧化劑，且反應時間較短，反應條件控制較容易。

1 材料與方法

1.1 材料原料與試劑：鄰苯二甲酸氫鉀(GR)、苯甲酸(GR)、氫氧化納(GR)，天津市化學試劑研究所；抗壞血酸(99%)，上海研生實業(yè)有限公司；檸檬味脈動飲料，購于超市。主要儀器：日立F-2700熒光分光光度計，日立高新技術公司。

1.2 方法

1.2.1標準曲線的繪制。準確稱取維生素C標準物0.050 5 g，用超純水溶解后倒入100 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得到5.05×10-4g/ml的維生素C標準液。取5個50 ml的容量瓶，編號1、2、3、4、5，分別加入0、1.0、1.5、2.0、2.5 ml維生素C標準液，各加入10 ml緩沖液和體積分別為0、1.50、2.25、3.00、3.75 ml的苯甲酸溶液，定容至刻度，搖勻后放入35 ℃水中加熱15 min。在選定的激發(fā)波長和發(fā)射波長下用熒光計分別測定熒光強度，以熒光強度值(y) 對維生素C濃度(x)作圖得出回歸方程。

1.2.2測定條件的選定。

1.2.2.1pH對熒光強度的影響。配制7份pH依次為3.85、6.00、6.55、7.00、7.60、8.05、9.11的氫氧化鈉-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液備用。分別移取樣品5.0 ml置7個50 ml容量瓶中，各加入pH 3.85、6.00、6.55、7.00、7.60、8.05、9.11的緩沖液10.0 ml，再分別加入7.5 ml苯甲酸溶液，定容至刻度。在35 ℃水中反應15 min后，用熒光計測定熒光強度。

1.2.2.2溫度對熒光強度的影響。取5個50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml樣品、10.0 ml緩沖液(pH=7)和7.5 ml苯甲酸溶液(1.095×10-4g/ml)定容至刻度。分別置于溫度為20、35、40、45、55、65 ℃的水中加熱15 min后測定其熒光強度。

1.2.2.3時間對熒光強度的影響。取5個50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml樣品、10.0 ml緩沖液(pH=7)和7.5 ml苯甲酸溶液，定容至刻度。分別在常溫下靜置5、10、15、20、25 min測定熒光強度。

1.2.2.4苯甲酸對熒光強度的影響。取4個50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml樣品和10.0 ml pH為7.0的緩沖溶液，再分別加入2.5、5.0、7.5、10.0 ml的苯甲酸溶液(1.095×10-4g/ml)，定容至刻度，得到苯甲酸與樣品體積比分別為0.5、1.0、1.5、2.0。置于35 ℃水中加熱15 min后測試熒光強度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制以熒光強度值(y) 對維生素C濃度(x)作圖得出回歸方程為：y= 1 704x+8.219，R2= 0.989。結果表明，維生素C-苯甲酸體系在1.00×10-4～5.05×10-4g/ml的范圍內(nèi)與其熒光強度表現(xiàn)出良好的線性關系。

2.2 測定條件的選定

2.2.1pH對熒光強度的影響。在pH 3.85、6.00、6.55、7.00、7.60、8.05、9.11條件下，用熒光計測定溶液熒光強度分別為：3.742 5、21.440 4、40.361 0、44.169 0、38.740 0、20.632 0、3.704 2。由此可見，在相同條件下，熒光強度會隨緩沖液pH的增大而增大，到一定程度后，熒光強度會隨緩沖液pH的增大而減小，即pH=7.00時，體系熒光強度最大，所以將緩沖液pH=7.00確定為最佳測定酸堿度。

2.2.2溫度對熒光強度的影響。將“1.2.2.2”中配制的反應體系分別置于溫度為20、35、40、45、55、65 ℃的水中加熱15 min后測定其熒光強度分別為：17.390、28.664、18.611、18.515、17.048。

由此可見，在相同條件下，熒光強度會隨溫度的增大而增大，到一定程度后，熒光強度會隨溫度的增大而減小，即溫度為35 ℃時，體系熒光強度最大，所以將反應溫度為35 ℃確定為最佳測定溫度。

2.2.3時間對熒光強度的影響。將“1.2.2.3”中配制的反應體系分別在常溫下靜置5、10、15、20、25 min測定熒光強度分別為：19.371、21.033、23.015、20.401、17.857。

由此可見，在相同條件下，熒光強度隨反應時間的增大而增大，到一定程度后，熒光強度隨反應時間的增大而減小，即時間為15 min時，體系熒光強度最大，所以將反應時間為15 min確定為最佳反應時間。

2.2.4苯甲酸對熒光強度的影響。將“1.2.2.4”中得到的苯甲酸與樣品體積比分別為0.5、1.0、1.5、2.0置于35 ℃水中加熱15 min后測試熒光強度分別為：18.794、18.572、23.126、21.383。

由此可見，在相同條件下，熒光強度隨苯甲酸與樣品體積之比的增大而增大，到一定程度后，熒光強度隨苯甲酸與樣品體積之比的增大而減小，即體積比為1.5時，體系熒光強度最大，所以將苯甲酸與樣品體積之比1.5確定為最佳測定條件。

2.3 響應面試驗設計方案及試驗結果由已進行的4個單因素試驗，根據(jù)響應面中心組合設計原理[5-8]，選擇pH(X1)、溫度(X2)、時間(X3)和苯甲酸(X4)作為響應面優(yōu)化的考察因素，以待測液維生素C的熒光強度為響應值，設計4因素3水平試驗，因素水平設計見表1，試驗結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平

表2 響應面試驗設計方案及結果

2.4 建立模型以及顯著性檢驗利用響應面軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進行二次線性回歸擬合，得到數(shù)學模型為：Y=-786.183 70+203.275 83X1+1.688 25X2+2.494 15X3+41.791 67X4+4.000 000E-003X1X2-5.500 00E-003X1X3+0.182 50X1X4-1.112 50E-003X2X3-2.500 00E-004X2X4+5.250 00E-003X3X4-14.565 83X12-0.024 190X22-0.081 321X32-7.162 08X42。對模型進行回歸分析得：F模型=1 153.77，F(xiàn)X1=0.17，F(xiàn)X2=1.27，F(xiàn)X3=0.53，F(xiàn)X4=2.87，F(xiàn)X1X2=0.22，F(xiàn)X1X3=0.10，F(xiàn)X1X4=1.15，F(xiàn)X2X3=1.70，F(xiàn)X2X4=8.604E-004，F(xiàn)X3X4=0.095，F(xiàn)X12=11 840.24，F(xiàn)X22=5 224.76，F(xiàn)X32=3 690.57，F(xiàn)X42=2 862.65，F(xiàn)失擬=1.44;P模型<0.000 1,PX1=0.684 5,PX2=0.279 0,PX3=0.478 5,PX4=0.112 5,PX1X2=0.646 1,PX1X3=0.751 7,PX1X4=0.302 5,PX2X3=0.212 8,PX2X4=0.977 0,PX3X4=0.762 6,PX12<0.000 1,PX22<0.000 1,PX32<0.000 1,PX42<0.000 1,P失擬=0.387 7。

試驗確定出測定維生素C最佳工藝條件為pH為7.0，溫度為37.13 ℃，時間為14.95 min，苯甲酸為7.51 ml。

2.5 響應面分析及優(yōu)化圖1、2是Y=(X1,X2)和Y=(X1,X3)等高線和響應面圖，Y=(X1,X4)、Y=(X2,X3)、Y=(X2,X4)、Y=(X3,X4)的等高線和響應面圖略。由此確定出測定維生素C最佳工藝條件為pH=7，溫度=37.13 ℃，時間為14.95 min，苯甲酸為7.51 ml。

2.6 樣品中維生素C的含量測定取3個50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml檸檬味脈動飲品、10.0 ml緩沖液及7.5 ml苯甲酸溶液，定容至刻度并搖勻。將其放入35 ℃的水中加熱15 min后測定熒光強度并計算維生素C含量。在選定波長下，測得其熒光強度分別為40.341、39.882、40.454，體系中維生素C含量為0.018 86、0.018 58、0.018 92 mg/ml，平均值為0.018 78 mg/ml，即樣品中維生素C的含量為0.187 8 mg/ml。

2.7 方法評價

2.7.1回收率試驗。準確稱取維生素C標準品0.021 0 g,溶解后移入100 ml容量瓶中，得到2.10×10-4g/ml的維生素C儲備液備用。取6個50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml維生素C儲備液。然后向1、2瓶中移入0.5 ml、3、4瓶中移入1.0 ml、5、6瓶中移入1.5 ml維生素C樣品液。再各加入10.0 ml緩沖液及加入8.25、8.25、9.00、9.00、9.75、9.75 ml苯甲酸溶液，在最佳條件下測定。計算回收率如表3所示。

由表3可以看出，該試驗回收率在97.75%～98.97%，說明該試驗的準確性較好，測定結果可信性強。

表3 熒光法回收率試驗

2.7.2精密度試驗。從維生素C標準液中分別精密吸取5.0 ml于50 ml容量瓶中，各加入10.0 ml緩沖液及7.5 ml苯甲酸定容，置于35 ℃水中加熱，在相同條件下連續(xù)測定6次，計算得RSD為3.4%。表明測定結果的精密度良好。

2.7.3重現(xiàn)性試驗。在確定的最佳試驗條件下，配制相同濃度的樣品溶液6份，利用熒光計測定并計算RSD為2.4%。由此說明該試驗的重現(xiàn)性較好，測定結果的可信度較高。

2.7.4穩(wěn)定性試驗。在確定的最佳試驗條件下，對同一個樣品在一定時間范圍內(nèi)用熒光計每隔15 min測定一次，連續(xù)測定6次得RSD為2.8%。由此說明測定儀器穩(wěn)定性較好。

3 討論

3.1 單因素的探討由于苯甲酸為熒光底物，因此苯甲酸的用量要列為單因素條件。維生素C不穩(wěn)定性，溫度和pH應列為單因素。對于反應時間的問題，是將溶液在常溫下反應過后，再進行水浴調(diào)溫，還是直接在水浴下反應，進行了探討性試驗，選擇在水浴時進行反應。

3.2 測定方法的討論從試驗結果看，在相同的條件下連續(xù)熒光測定6次，得出RSD為3.4%，結果表明精密度良好。配制相同濃度的樣品溶液，在相同條件下每隔15 min測定一次，得到的RSD為2.8%，說明樣品溶液體系較穩(wěn)定。從而確定熒光分析法適用于低含量維生素C的測定。

3.3 數(shù)據(jù)處理方法的評價該試驗使用響應面優(yōu)選法優(yōu)化試驗條件更具科學性、嚴謹性。優(yōu)選得到的測定工藝條件科學合理，可信度高。

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Study on Technique Conditions of Determination of Vitamin C by Fluorescent Response Surface Method

ZHANG Ding, CHEN Shuai, GAO Shu-yun*

(Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou, Jiangsu 221008)

[Objective] Accoding to characteristics of fluorescent substance produced by reaction of Benzoic acid and vitamin C, a method for measuring vitamin C content was established. [Method] Using sodium hydroxide-potassium hydrogen phthalate as buffer solution to adjust pH, through the measurement of sample pre-treatment time, temperature, amount of acid buffer solution and pH test to determine the best univariate single factor levels and response surface optimization of the experimental method to determine the optimum conditions to promote benzoic acid as a fluorescent substance in vitamin C drinks. [Result] Benzoic acid to vitamin C to promote fluorescence evident in the fluorescence intensity of the excitation wavelength of 310 nm, 410 nm emission wavelength measured its products. Vitamin C concentration in the 1.00×10-4～ 5.05×10-4g/ml scope of its fluorescence intensity was good linear relationship, the lower limit of detection, the correlation coefficient was 0.989. [Conclusion] The result of determining vitamin C content in drink is accurate by fluorescence, the method is feasible.

Vitamin C; Fluorescence analysis; Benzoic acid; Response surface method

張 鼎(1991-)男，江蘇揚州人，從事生物檢測工藝研究。*通訊作者，教授，碩士，從事食品及天然植物有效成分分離及檢測研究。

2014-10-08

S 609.9

A

0517-6611(2015)01-254-03