趙有婷，孫海龍，劉敏瑞，于 洋，倪永清

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000)

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天山一號冰川產(chǎn)蛋白酶酵母菌的篩選及其系統(tǒng)發(fā)育分析

趙有婷，孫海龍，劉敏瑞，于 洋，倪永清*

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000)

[目的]篩選天山一號冰川底部沉積層耐低溫的產(chǎn)蛋白酶菌株，研究其生理生化特性并做系統(tǒng)發(fā)育分析。[方法]以天山一號冰川底部沉積層中耐低溫產(chǎn)蛋白的酵母菌株為材料，用Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(YPD)培養(yǎng)基活化60株酵母菌；再用選擇性培養(yǎng)基篩選產(chǎn)蛋白酶的菌株，觀察菌落形態(tài)；測定產(chǎn)酶菌株最適溫度；最后基于26S r DNA基因D1/D2區(qū)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。[結(jié)果]從60株酵母菌中共篩選出10株產(chǎn)蛋白酶菌株，其中產(chǎn)酶優(yōu)勢菌為BCY-8、BCY-20，產(chǎn)酶酵母細(xì)胞平均大小為2.60～5.00 μm，最適生長溫度為24 ℃。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析可知，10株產(chǎn)酶酵母菌屬于隱球菌(Cryptococcus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、南極酵母(Antarcticyeast)、Unculturedfungus、Mazocraeoidesgonialosae。[結(jié)論]研究可為低溫蛋白酶生物技術(shù)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

天山一號冰川；酵母菌；蛋白酶；系統(tǒng)發(fā)育

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)的一大類酶的通稱，廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、植物果實(shí)和微生物中，自20世紀(jì)以來在食品、洗滌添加劑、飼料、造紙、制藥等行業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值極高，占世界用酶市場60% 以上的份額[1-2]。目前，從低溫微生物中篩選新的生物活性物質(zhì)已成為新的研究熱點(diǎn)[3-4]。低溫酶是指在低溫環(huán)境中也能擁有高催化活性且對高溫敏感的一類酶，主要是由嗜冷菌(psychrophile)和耐冷菌(psychrotolerant)產(chǎn)生[4]。由于低溫酶在低溫環(huán)境下具有較高的酶活性，有助于在保證催化效率的前提下降低反應(yīng)溫度和縮短反應(yīng)時(shí)間，從而大幅度節(jié)約能源[5]。天山凍土屬于我國高海拔高山常年凍土，凍土環(huán)境中微生物會產(chǎn)生一系列適應(yīng)低溫、寡營養(yǎng)、強(qiáng)輻射、凍融等極端因子的分子機(jī)制，為低溫微生物生理多樣性提供了可能。而目前國內(nèi)對有關(guān)高海拔低溫蛋白酶菌株的研究報(bào)道較少[5-8]，主要研究大多來自南極及南海深部沉積層。筆者對天山一號底部沉積層中產(chǎn)蛋白酶的酵母菌株進(jìn)行了分離、篩選，并研究了其系統(tǒng)發(fā)育多樣性，以期為低溫蛋白酶生物技術(shù)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和儀器。用于PCR擴(kuò)增的全套試劑及擴(kuò)增引物均購自TaKaRa公司，相關(guān)生理生化試驗(yàn)所用試劑均購自于天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠及天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑廠。高速冷凍離心機(jī)為Thermo 公司 Fresco21 型；PCR 儀為德國 Biometra 公司Tprofessional；凝膠成像系統(tǒng)為BioRad公司GelDOC XR；水平電泳儀為美國BioRad公司PowerPacUniversal、電泳槽 SUBCELL GT(20 cm×25 cm)。

1.1.2培養(yǎng)基。YPD液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L;葡萄糖過濾除菌，其他試劑高壓滅菌。YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L和酪蛋白20 g/L。YEPG培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基加蛋白胨20 g/L。pH均為7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3供試菌種。 石河子大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室從天山凍土帶凍土樣品中篩選鑒定所得的酵母菌。

1.2 菌株的活化與產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及菌落特征用YPD液體培養(yǎng)基活化-80 ℃保藏的酵母菌，再用YEPG培養(yǎng)基16 ℃培養(yǎng)24 h篩選產(chǎn)蛋白酶的菌株，以有無菌落透明圈作為初篩依據(jù)[5]。最后在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，16 ℃培養(yǎng)1～7 d記錄菌落特性。

1.3 酵母菌生長較適溫度的測定按5%的接種量將60株菌接種于10 ml YPD液體培養(yǎng)基中，分別在16、20、24、28、37 ℃培養(yǎng)。用紫外分光光度計(jì)在波長420、600 nm下每隔10 h測定一次吸光值，共測5次。

1.4 26S rDNA基因的擴(kuò)增和系統(tǒng)進(jìn)化分析采用CTAB法提取酵母菌DNA，用NL1和NL4對酵母菌DNA進(jìn)行26S rRNA基因擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50 μl)，dNTP 1.0 μl、TaqDNA 0.2 μl、引物各2.0 μl、TaqDNA聚合酶10×緩沖液5.0 μl、2×TaqMasterMix 25.0 μl、MgCl2(2 mmol/l)4.0 μl，最后用去離子水補(bǔ)足。PCR循環(huán)：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)36次，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物科技有限公司直接測序。所得序列用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列搜索， CLUSTAL X 1.83[9]軟件對齊序列，采用鄰接法neighbor-joining[10]和MEGA4.1[11]軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)化樹分支的置信度采用bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選產(chǎn)蛋白酶酵母菌結(jié)果及菌落特性圖1為10株產(chǎn)蛋白酶菌里的部分菌株菌落形態(tài)及水解圈。用十字交叉法測定水解圈直徑及菌落直徑，產(chǎn)酶能力強(qiáng)：BCY-8、BCY-20；產(chǎn)酶能力較強(qiáng)：BYL-15、BYL-16、BCY-6；產(chǎn)酶能力較弱：BYL-1、BYL-24、BCY-16、BCY-21、BCY-29。

2.2 生長溫度測定結(jié)果圖2表明，10株產(chǎn)蛋白酶菌株中BYL-1、BCY-20、BCY-21、BLY-15、BYL-24的最適生長溫度范圍均在24 ℃左右；BCY-6、BCY-8、BYL-16最適生長溫度為16 ℃左右；BCY-16、BCY-29的最適生長溫度為28 ℃左右。

2.3 基于26S r RNA基因序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析由圖3可知，BYL-15與Unculturedbasidiomycota相似性為97%，BCY-16與Rhodotorulalaryngis相似性為98%。根據(jù)Kurtzman酵母種類的劃分依據(jù)，相似性低于99%的，不能劃為同一個(gè)種。BYL-16與Mazocraeoidesgonialosae相似性為99%。BYL-1屬于Cryptococcus，BYL-24屬于Unculturedfungus，BCY-8屬于Cryptococcus；BCY-6、BCY-16、BCY-20、BCY-21、BCY-29與Rhodotorula、Rhodotorulalaryngis、Antarcticyeast在同一分支中。

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，低溫環(huán)境中分離的細(xì)菌大多數(shù)屬于耐冷細(xì)菌，最適生長溫度在20～25 ℃，只有部分菌株為專性嗜冷菌，最適生長溫度在10～15 ℃。綜上，BCY-6、BCY-8和BCY-20分別屬于產(chǎn)酶能力強(qiáng)的專性嗜冷菌和耐冷菌；BYL-15和BYL-16分別是產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的專性嗜冷菌和耐冷菌。除BCY-16和BCY-29，其他均屬于產(chǎn)酶能力較弱的耐冷菌株。從系統(tǒng)發(fā)育來看，天山一號冰川底部沉積層中產(chǎn)蛋白酶的酵母菌主要隸屬于Acidobacteria門中Rhodotorula屬；而有文獻(xiàn)報(bào)道，目前所有冷凍低溫環(huán)境中隸屬于 Acidobacteria門的可培養(yǎng)細(xì)菌幾乎為零[1]。BCY-6和BCY-8菌落形態(tài)表型特征相同，均屬產(chǎn)酶能力強(qiáng)的專性嗜冷菌，但明顯BCY-6和BCY-8分別隸屬于Rhodotorula和Cryptococcus屬。說明依據(jù)菌落的差異標(biāo)準(zhǔn)不能準(zhǔn)確反映冰川等冰凍圈環(huán)境中群落多樣性，需要采用更精確的分子手段確定。

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Screening and Phylogenetic Analysis of Yeast Producing Protease from Permafrost of the Glacier No.1 in the Tianshan Mountains

ZHAO You-ting, SUN Hai-long, LIU Min-rui, NI Yong-qing*et al

(College of Food Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000)

[Objective] This research was to isolate cold-adapted protease-producing strains of yeasts from permafrost of the Glacier No.1 in the Tianshan Mountains, study their physiological and biochemical characteristics, conduct phylogeny analysis. [Method] YPD was used to select yeast producing protease, which were identified through the hydrolysis circle. Then, the optimum temperature of the strains and phylogenetic position determined by the 26S rDNA D1/D2 sequences was studied. [Result] 10 isolates were cold-adapted protease-producing strains. The average size of cells were 2.60 to 5.00 μm and the optimum growth temperature was 24 ℃. Phylogenetic analysis showed that the 10 strains of yeast belonged toCryptococcu,Rhodotorula,Antarcticyeast,UnculturedfungusandMazocraeoidesgonialosae. [Conclusion] The study can lay a foundation for research and development of low-temperature protease.

Tianshan glacier No.1; Yeast; Protease; Phylogeny

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40961002，41140009，41271268)。

趙有婷(1990-)，女，甘肅白銀人，碩士研究生，研究方向：微生物技術(shù)與酶工程。*通訊作者，教授，博士，從事微生物技術(shù)研究。

2014-11-19

S 188+.4

A

0517-6611(2015)01-248-03