楊慶麗，董 艷，姬妍茹，田 媛，張正海

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

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耐鹽堿石油降解菌2JQ的分離鑒定及降解能力研究

楊慶麗，董 艷，姬妍茹，田 媛，張正海

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

從大慶地區(qū)石油污染土壤分離出一株石油降解菌命名為2JQ，經(jīng)16SrDNA及理化檢測(cè)鑒定為糞產(chǎn)堿菌，采用氣相色譜法(GC)對(duì)該菌石油及石油烴正十二烷、正十四烷、正十六烷、正二十烷、正三十二烷降解效率進(jìn)行研究，測(cè)定該菌在高鹽及高pH條件下生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，2JQ菌株對(duì)石油降解率達(dá)到67.1%，5種石油烴降解率分別為68.21%、64.70%、58.04%、49.73%、19.87%。該菌在高鹽、高pH條件下生長(zhǎng)良好，適合在大慶地區(qū)鹽堿土壤中進(jìn)行石油污染降解。

石油降解菌；石油；石油烴；降解率

石油是世界上最重要的能源之一，對(duì)全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到了重要的推動(dòng)作用。隨著需求量的逐年增大，石油在開采、運(yùn)輸和加工過程中對(duì)于土壤和水體的污染也日益嚴(yán)重。石油污染不僅給國(guó)家經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失，也對(duì)人體健康造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[1]。目前對(duì)于石油污染的各種治理方法中，微生物降解因其費(fèi)用低、原位降解污染物、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能夠降解石油的微生物有70個(gè)屬、200多種，其中細(xì)菌有假單胞菌屬、棒桿菌屬、微球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等[3]。

大慶是我國(guó)主要石油產(chǎn)地，年產(chǎn)量近4 000萬(wàn)t。近年來隨著城市建設(shè)的發(fā)展，石油污染降解問題也得到了越來越多的重視。大慶地區(qū)土壤多為鹽堿土，外來石油降解菌很難存活。該研究從大慶油田井架旁邊石油污染土壤中分離一株石油降解糞產(chǎn)堿菌，研究其對(duì)于石油及石油烴降解性能，以期為大慶石油污染的生物修復(fù)做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1采樣及石油來源。試驗(yàn)中所用原油及石油污染土樣均來自大慶油田采油一廠。

1.1.2培養(yǎng)基。無機(jī)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2·2H2O 0.02 g/L、KH2PO41 g/L、NH4NO31 g/L、KNO31 g/L、FeCl30.05 g/L，pH 7.0[4]。石油培養(yǎng)基：在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入0.5 %的滅菌石油。石油烴培養(yǎng)基：在100 ml無機(jī)培養(yǎng)基中加入正十二烷(C12H26)、正十四烷(C14H30)、正十六烷(C16H34)各1 ml，正二十烷(C20H42)、正三十二烷(C32H66)各0.5 g。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。固體培養(yǎng)基為加入瓊脂12 g/L。

1.1.3試驗(yàn)試劑。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒：上海生工；DNA Marker 2 000 bp：北京原平皓；正十二烷、正十四烷、正十六烷、正二十烷、正三十二烷：天津市津科精細(xì)化工研究所；其他試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4試驗(yàn)儀器。7900氣相色譜儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海天美；凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀：北京君意東方；基因擴(kuò)增儀：杭州博日；UV-759紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1石油降解菌分離。在100 ml石油培養(yǎng)基中加入2 g石油污染土樣，30 ℃搖床培養(yǎng)7 d。避開原油取1 ml上層培養(yǎng)液接到100 ml石油培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d。再重復(fù)一次。取培養(yǎng)液梯度稀釋106、107、108倍，涂布牛肉膏蛋白胨平板上，獲得生長(zhǎng)較好優(yōu)勢(shì)菌株，純化后命名斜面保存。其中一株優(yōu)勢(shì)菌命名為2JQ，純化培養(yǎng)后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.2石油降解率測(cè)定。取0.1 ml 2JQ培養(yǎng)液接種到100 ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16 h。1 ml上述培養(yǎng)液接種到100 ml石油培養(yǎng)基中，以不接菌石油培養(yǎng)基為空白對(duì)照，取3個(gè)重復(fù)，30 ℃搖床培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)液每次加入20 ml色譜純正已烷超聲離心萃取3次，每次15 min，合并萃取液，揮干后加入10 ml色譜純正已烷，空白對(duì)照萃取方法同上。氣相色譜法測(cè)定石油降解率。7900氣相色譜儀配備FID檢測(cè)器和SE30色譜柱(100 m×0.32 mm×0.5 μm)，載氣為氮?dú)?，柱流? ml/min，總流量50 ml/min。進(jìn)樣口溫度280 ℃，進(jìn)樣1 μl，檢測(cè)器溫度320 ℃，升溫程序：60 ℃保持3 min，以6 ℃/min升溫至220 ℃保持2 min，再以2 ℃/min升至320 ℃，保持45 min。面積歸一法測(cè)定石油降解。

1.2.3石油降解菌16SrDNA鑒定。取2JQ菌株培養(yǎng)液1 ml，10 000 r/min 離心1 min獲得菌體，上海生工細(xì)菌總DNA提取試劑盒提總DNA，通用引物Eubac27F，1492R進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增[5]。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工完成，MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4石油烴降解測(cè)定。2JQ活化后，取1 ml加入100 ml石油烴培養(yǎng)基中，取3個(gè)重復(fù)，以不接菌石油烴培養(yǎng)基為空白對(duì)照，搖床培養(yǎng)7 d。用氣相色譜法測(cè)定石油烴降解率。萃取及氣相色譜條件同“1.2.2”。

1.2.5菌種耐鹽堿性研究。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中另外加入1%及2%的NaCl，100 ml/瓶分裝各16瓶，調(diào)pH為7、8、9、10、11，各設(shè)3個(gè)重復(fù)。以不接菌pH 11的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，OD600測(cè)定24 h細(xì)菌生長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油降解率測(cè)定無菌的空白對(duì)照與接菌的無機(jī)培養(yǎng)基在完全相同的條件下培養(yǎng)，7 d時(shí)空白對(duì)照水油仍然分離，上層原油粘度較高呈黑色；接種了2JQ菌株的三角瓶中水油已經(jīng)融合，粘度降低，顏色由黑色變?yōu)楹稚?。圖1為石油降解氣相色譜圖。結(jié)果顯示，7 d菌株2JQ石油降解率為67.1%。

2.2 石油降解菌鑒定2JQ為革蘭氏陰性菌桿狀菌，菌落圓形，表面光滑，白色略透明。PCR電泳結(jié)果見圖2；該菌16SrDNA經(jīng)上海生工測(cè)序全長(zhǎng)1 529 bp，經(jīng)GENEBANK中BLAST比對(duì)與糞產(chǎn)堿菌相似性最高達(dá)98.5%，結(jié)合理化檢測(cè)結(jié)果判定為糞產(chǎn)堿菌。2JQ菌株系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

2.3 石油烴降解率測(cè)定石油烴降解過程中可見，2JQ在以石油烴為唯一碳源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，培養(yǎng)液由澄清變?yōu)榛鞚?，說明2JQ可以利用上述5種石油烴的一種或幾種作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。氣相色譜面積歸一法測(cè)定石油烴降解率，結(jié)果見圖4?？梢?，2JQ對(duì)5種烴的降解率分別為68.21%、64.70%、58.04%、49.73%、19.87%。隨石油烴碳含量增加，2JQ降解率逐漸降低。

2.4 耐鹽堿性研究結(jié)果由圖5可見，2JG 在pH 7～10的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好；在含NaCl為1%和2%的培養(yǎng)基中其最適pH均為9，平均OD值最高為0.287 6；pH為8和9時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)速度明顯高于pH 7、10、11(P≤0.01)，在pH 11時(shí)幾乎不生長(zhǎng)。細(xì)菌在NaCl含量為1%的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度略高于2%，差異不顯著(P≥0.05)。

3 結(jié)論與討論

獲得一株最適pH為9的耐鹽堿石油降解菌，7 d石油降解率為67.1%，石油烴正十二烷、正十四烷、正十六烷、正二十烷、正三十二烷降解率分別為68.21%、64.70%、58.04%、49.73%、19.87%。該菌可以在高鹽高堿情況下生長(zhǎng)，對(duì)大慶地區(qū)鹽堿土壤石油降解具有非常重要的意義。

石油又稱原油，認(rèn)為是古代海洋或湖泊中的生物經(jīng)過漫長(zhǎng)的年代演化形成，成分復(fù)雜、顏色深、粘度大、極難降解。該研究從大慶地區(qū)石油污染土壤分離的糞產(chǎn)堿菌2JQ石油降解率為67.10%，5種石油烴中正十二烷的降解率最高，為68.21%，正三十二烷僅為19.87%?？梢?，該菌對(duì)高碳烷烴降解能力較低。現(xiàn)在已有很多石油及石油烴生物降解的相關(guān)研究，如張潔從油田油泥中分離出4株降解菌，4株菌最高石油降解率為66.3%，最低為39.0%，4株菌對(duì)正十六烷降解率為90%左右，對(duì)其他烴降解率則較低[6]；劉明等分離出一株降解率46.9%的紅球紅平菌[7]。可見，單菌株對(duì)石油的降解率并不十分理想，這是由于石油成分非常復(fù)雜，包括鏈烷烴、環(huán)烷烴、多環(huán)芳香烴、非烴類化合物等[8]。而單個(gè)菌往往僅能對(duì)石油中的某些成分進(jìn)行降解，其他成分則無能為力。因此，僅僅依靠一種菌完成所有化合物的分解幾乎是不可能的，需進(jìn)一步進(jìn)行菌群構(gòu)建等方面的研究。該研究中分離的糞產(chǎn)堿菌是一株耐鹽堿石油降解菌，對(duì)于惡劣環(huán)境有較強(qiáng)適應(yīng)能力。該菌的獲得對(duì)于大慶地區(qū)石油降解及菌群構(gòu)建的相關(guān)研究意義重大，有較高的實(shí)用價(jià)值。

[1] 王世杰，王翔，盧桂業(yè)，等.柴油降解茵的篩選鑒定及降解特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011(30):49-54.

[2] 王金成，井明博，段春艷，等.黃土高原長(zhǎng)慶油田高效石油降解菌篩選及其降解率的測(cè)定[J].隴東學(xué)院學(xué)報(bào)，2013(5):66-69.

[3] 雒曉芳，霍偉鵬，孫琦，等.石油降解菌株降油效果的比較研究[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013(3):47-50.

[4] 田苗.石油降解菌的篩選及對(duì)石油污染土壤的修復(fù)實(shí)驗(yàn)[D].西安：西北大學(xué)，2010.

[5] 李寶明，阮志勇，姜瑞波.石油降解菌的篩選、鑒定及菌群構(gòu)建[J].中國(guó)土壤與肥料，2007(3):68-72.

[6] 張潔.高效降解長(zhǎng)慶石油污染物細(xì)菌系的篩選及其特性研究[D].西安：西北大學(xué)，2012.

[7] 劉明，孫鵬，張祥勝，等.原油降解菌YSL28的分離鑒定及降解特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013(5):47-50.

[8] 劉陽(yáng).印度洋表層海水石油降解菌及其烷烴羥化酶AlKB的多樣性分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

Screening and Degradation Characteristics of Saline Alkali Tolerance Crude Oil Degrading Bacteria 2JQ

YANG Qing-li, DONG Yan, JI Yan-ru et al

(Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences, Daqing, Heilongjiang 163319)

A degrading bacteria named 2JQ was obtained in Daqing distinct crude oil pollution soil. It was confirmed to beAlcaligenesfaecalisthrough the method of 16SrDNA and physicochemical property. GC was used to test the degrading rate of crude oil and petroleum hydrocarbon C12H26, C14H30, C16H34, C20H40, C32H66. Results showed that degrading rate of crude oil was 67.1% and five hydrocarbons were 68.21%, 64.70%, 58.04%, 49.73% and 19.87%. 2JQ can grow fast in the condition of high concentration salt and alkali. It means that 2JQ can be used in Daqing saline alkali soil to reduce the crude oil pollution.

Crude oil degrading bacteria; Crude oil; Petroleum hydrocarbon; Degradation rate

黑龍江省科學(xué)院青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX13G01)。

楊慶麗(1977-)，女，黑龍江大慶人，助理研究員，碩士，從事生物環(huán)保方面研究。

2014-11-20

S 181.3;X 172

A

0517-6611(2015)01-234-02