田 甜 朱 煌

·論著：實(shí)驗(yàn)研究·

葛根素對(duì)極低頻電磁輻射下RPE細(xì)胞增殖活性及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2的影響

田 甜 朱 煌

目的研究葛根素對(duì)極低頻電磁場(chǎng)（ELF-EMF）作用下人視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞病理改變的影響，探討其在近視防治中的可能作用。方法實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組、輻射組、葛根素組（終濃度100μmol/L）。CCK8檢測(cè)RPE細(xì)胞的增殖活性，Real-time PCR法檢測(cè)RPE細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2（TGF-β2）mRNA的表達(dá)情況。ELISA檢測(cè)RPE細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β2的蛋白含量。結(jié)果與對(duì)照組相比，輻射組RPE細(xì)胞增殖活性降低；TGF-β2 mRNA表達(dá)增高，RPE細(xì)胞上清中TGF-β2含量上調(diào)。與輻射組相比，葛根素組RPE細(xì)胞增殖活性增高，TGF-β2 mRNA表達(dá)降低，RPE細(xì)胞上清中TGF-β2含量下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論ELF-EMF在一定范圍內(nèi)影響體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞的增殖活性及TGF-β2的表達(dá)與分泌，葛根素在一定程度上逆轉(zhuǎn)了這一作用。

葛根素；視網(wǎng)膜色素上皮；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2；極低頻電磁場(chǎng)；近視

近視眼發(fā)病機(jī)制和防治的研究一直是眼科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前已公認(rèn)近視眼的發(fā)生是在視網(wǎng)膜調(diào)控下鞏膜主動(dòng)重塑的結(jié)果。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）有多種影響視網(wǎng)膜-鞏膜信號(hào)系統(tǒng)的因子，并參與調(diào)控鞏膜組織的重塑過(guò)程，被認(rèn)為是視網(wǎng)膜信號(hào)傳遞至效應(yīng)器鞏膜必不可少的中間環(huán)節(jié)〔1〕。本課題組長(zhǎng)期從事極低頻電磁輻射（extremely low frequency electromagnetic fields，ELF-EMFs）與近視關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)輻射導(dǎo)致豚鼠眼軸延長(zhǎng)，近視屈光度增加，RPE細(xì)胞增殖活性下降，形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變，細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）明顯增高，RPE細(xì)胞上清作用于鞏膜細(xì)胞，后者的基質(zhì)金屬蛋白酶增高，Ⅰ型膠原下降，而Ⅰ型膠原的變性和減少所導(dǎo)致的后極部鞏膜薄弱是軸性近視的特征之一，因此我們提出ELF-EMFs可能通過(guò)造成RPE細(xì)胞病理改變，影響TGF-β2的合成與分泌，從而促成鞏膜病理性重塑〔2-5〕。葛根素作為傳統(tǒng)中藥活性單體，對(duì)多種致病因素引起的機(jī)體病理變化具有保護(hù)作用，葛根素對(duì)RPE細(xì)胞凋亡，視網(wǎng)膜變性，糖尿病視網(wǎng)膜病變及視網(wǎng)膜缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用已有報(bào)道〔6-9〕。對(duì)電磁輻射引起的RPE病理變化是否有保護(hù)作用鮮有報(bào)道。此次實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察葛根素對(duì)受極低頻電磁輻射的RPE細(xì)胞的保護(hù)作用探討葛根素對(duì)近視的可能防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素（美國(guó)Gibco公司）；葛根素（110752-201313，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）；Real-Time PCR試劑盒（美國(guó)BIO-RAD公司）；TGF-β2引物（上海生工生物技術(shù)公司）；ELISA試劑盒（上海碧云天公司）；電磁輻射分析儀TES-1393（臺(tái)灣泰仕公司）。

1.2 ELF-EMFs輻射系統(tǒng)的建立

自制磁場(chǎng)輻照系統(tǒng)，由周長(zhǎng)60 cm、高度8 cm、168匝的Helmholtz線圈和變壓器構(gòu)成，其中3個(gè)線圈相互串聯(lián)后疊放并與細(xì)胞培養(yǎng)箱外的變壓器相連。用變壓器調(diào)節(jié)線圈內(nèi)電壓大小，使3個(gè)線圈的空間區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)恒定、均勻的50 Hz正弦磁場(chǎng)輻照區(qū)，該輻射系統(tǒng)所產(chǎn)生的磁場(chǎng)用電磁輻射分析儀測(cè)定。在細(xì)胞受磁場(chǎng)輻照時(shí)，培養(yǎng)皿中心位于輻照系統(tǒng)的中心軸上。見(jiàn)圖1。

圖1 電磁輻射系統(tǒng)示意圖。3個(gè)線圈相互串聯(lián)

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系（ARPE19）購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection， ATCC），用DMEM-F12培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合長(zhǎng)滿瓶底80%左右，按1∶3比例消化傳代。每次實(shí)驗(yàn)均取自同一批傳代細(xì)胞，待細(xì)胞全部貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基分組培養(yǎng)，葛根素組加入終濃度為100 μmol/L的葛根素。輻射組與葛根素組的細(xì)胞置于0.2 mT，50 Hz的電磁輻射系統(tǒng)中，正常對(duì)照組置于同等條件未通電的相同線圈系統(tǒng)中培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)RPE細(xì)胞增殖活性

RPE細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后以6×103/孔接種至96孔板，并將細(xì)胞懸液分為對(duì)照組，輻射組，葛根素組，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，輻射組與葛根素組放置于0.2 mT的ELF-EMFs中輻射，對(duì)照組放置于未通電的輻射箱內(nèi)。在培養(yǎng)6、12、24、48 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm測(cè)定光密度D（450 nm），計(jì)算每組D（450 nm）的平均值。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)RPE中TGF-β2 mRNA表達(dá)水平

每組細(xì)胞各自培養(yǎng)24 h后，用Trizol試劑抽提RPE細(xì)胞中RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，TGF-β2及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物TGF-β2 F：5’GGG TGG AAA TGG ATA CAC GAA C 3’；TGF-β2 R：5’GGG TGT TTT GCC AAT GTA GTA GAG 3’；GAPDH F：5’GGA GTC CAC TGG CGT CTT C 3’；GAPDH R：5’GCT GAT GAT CTT GAG GCT GTT G 3’。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，所有PCR反應(yīng)由PCR儀完成，GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組相對(duì)定量值（RQ值）。

1.6 ELISA檢測(cè)RPE細(xì)胞上清中TGF-β2的含量

將5×105的RPE細(xì)胞種植在25 mm2培養(yǎng)瓶中，用不含胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基進(jìn)行分組培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞上清轉(zhuǎn)移到濃縮管中，放置到低溫離心機(jī)中，4 000 r/min離心25 min，收集濃縮好的上清根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)TGF-β2的含量（pg/ml）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。各組不同時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞增殖活性[D（450 nm）]比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，RPE細(xì)胞中TGF-β2 mRNA相對(duì)表達(dá)及細(xì)胞上清中TGF-β2的含量比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPE細(xì)胞增殖活性的變化

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，各組RPE細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的增值活性差異不同（重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，F(xiàn)分組=398.493，P<0.01；F時(shí)間=2266.539，P<0.01；F交互作用= 25.485，P<0.01）。6 h時(shí)各組光密度值接近（P＞0.05）；12h、24h、48h時(shí)葛根素組光密度值低于對(duì)照組（12h：P＞0.05；24 h、48 h：P<0.01），高于輻射組（12 h：P<0.05；24 h、48 h：P<0.01），該組間差異有隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加大的趨勢(shì)（表1，圖2）。提示ELF-EMFs能抑制RPE細(xì)胞增殖活性，而葛根素可以減弱這種抑制作用。

表1 CCK-8法檢測(cè)各組RPE細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的增殖活性比較±s，D（450 nm）]

表1 CCK-8法檢測(cè)各組RPE細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的增殖活性比較±s，D（450 nm）]

注：重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，F(xiàn)分組=398.493，P<0.01；F時(shí)間=2 266.539，P<0.01；F交互作用=25.485，P<0.01。12 h與對(duì)照組比較，①P<0.01，與輻射組比較，②P<0.05；24 h與對(duì)照組比較，③P<0.01，與輻射組比較，④P<0.01；48 h與對(duì)照組比較，⑤P<0.01，與輻射組比較，⑥P<0.01

各時(shí)間點(diǎn)的光密度值6 h12 h24 h48 h對(duì)照組40.6150±0.03081.0015±0.03961.7350±0.02282.2940±0.0635輻射組40.6130±0.01450.9258±0.0252①1.4498±0.0547③1.7780±0.0599⑤葛根素組40.6175±0.03590.9748±0.0138②1.6200±0.0294③④2.0125±0.0608⑤⑥組別樣本量

圖2 CCK-8法檢測(cè)各組RPE細(xì)胞的光密度值-時(shí)間折線圖RPE：視網(wǎng)膜色素上皮

2.2 RPE細(xì)胞中TGF-β2 mRNA表達(dá)水平

對(duì)照組、輻射組及葛根素組RPE細(xì)胞中TGF-β2 mRNA/GAPDH mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（45.83±5.74）×10-3，（97.33±7.34）×10-3，（68.33±6.06）× 10-3，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=97.154，P<0.01）。輻射組TGF-β2 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)了112.36%（P<0.01），葛根素組TGF-β2 mRNA表達(dá)水平較輻射組下調(diào)了29.80%（P<0.01）。葛根素組與對(duì)照組相比，TGF-β2 mRNA表達(dá)水平上調(diào)了49.09%（P<0.01）。見(jiàn)圖3。

2.3 RPE細(xì)胞上清中TGF-β2的含量

對(duì)照組、輻射組及葛根素組RPE細(xì)胞上清中TGF-β2的蛋白含量分別為（461.83±35.80）pg/ml，（1329.28±55.03）pg/ml，（798.06±22.52）pg/ml，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=714.74，P<0.01）。輻射組較對(duì)照組RPE細(xì)胞上清中TGF-β2含量增高187.83%（P<0.01），葛根素組較輻射組RPE細(xì)胞上清中TGF-β2含量降低39.96%（P<0.01）。葛根素組與對(duì)照組相比，RPE細(xì)胞上清中TGF-β2含量增高72.81%（P< 0.01）。見(jiàn)圖4。

圖3 Real-time PCR檢測(cè)各組RPE細(xì)胞TGF-β2 mRNA相對(duì)表達(dá)（TGF-β2 mRNA/GAPDH mRNA）。3組比較，F(xiàn)=97.154，P<0.01；各組兩兩比較，均為P＜0.01（單因素方差分析，LSD法）RPE：視網(wǎng)膜色素上皮TGF-β2：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

3 討論

近視眼發(fā)病機(jī)制和防治的研究一直是眼科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前已公認(rèn)近視眼的發(fā)生是在視網(wǎng)膜調(diào)控下鞏膜主動(dòng)重塑的結(jié)果。在近視眼形成過(guò)程中，RPE細(xì)胞不僅結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，還可以傳遞視網(wǎng)膜的近視信號(hào)，影響鞏膜重塑，從而調(diào)節(jié)近視的發(fā)生與發(fā)展〔1〕。TGF-β是眼球生長(zhǎng)和鞏膜重塑的重要刺激信號(hào)〔10〕。TGF-β共有5種亞型，眼部生物學(xué)活性以TGF-β2為主。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2可儲(chǔ)積于培養(yǎng)的RPE細(xì)胞上清液中〔11〕，免疫組化染色及ELISA證實(shí)RPE表達(dá)和分泌TGF-β2〔12〕。近視眼RPE脈絡(luò)膜復(fù)合體中TGF-β2濃度升高，形覺(jué)剝奪誘導(dǎo)的近視豚鼠視網(wǎng)膜中TGF-β2顯著增加，提示TGF-β2可能參與了近視的發(fā)生發(fā)展〔13-16〕。

我們發(fā)現(xiàn)極低頻電磁輻射（ELF-EMFs）后RPE細(xì)胞增殖活性下降，形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變；TGF-β2表達(dá)和分泌明顯增高，其細(xì)胞上清作用于鞏膜成纖維細(xì)胞（HFSF），后者出現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）增高，Ⅰ型膠原下降，而Ⅰ型膠原的變性和減少所導(dǎo)致的后極部鞏膜薄弱是軸性近視的特征之一，提出ELF-EMFs可能通過(guò)造成RPE細(xì)胞病理改變，影響TGF-β2的合成與分泌，從而促成鞏膜的病理性重塑〔2-5〕。

關(guān)于近視的防治近年來(lái)一直徘徊不前，作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)的寶貴資源，中醫(yī)藥在公共衛(wèi)生領(lǐng)域中的研究愈加重要。尤其關(guān)于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中活性成分的單體研究已成為替代和補(bǔ)充醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要焦點(diǎn)。葛根素是從葛根中分離提取的一種異黃酮類化合物，是葛根主要有效成分，化學(xué)名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7-二羥基異黃酮。葛根素純品注射液已廣泛用于高血壓、冠心病等的治療。對(duì)于在整個(gè)近視發(fā)展起局部中樞性調(diào)控作用的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，葛根素又有何作用值得探討。葛根素對(duì)RPE細(xì)胞凋亡，視網(wǎng)膜變性，糖尿病視網(wǎng)膜病變及視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用已有報(bào)道〔6-9〕。對(duì)電磁輻射引起的RPE病理變化是否有保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

此次實(shí)驗(yàn)的3組細(xì)胞中，輻射組RPE細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組降低，TGF-β2 mRNA表達(dá)增高，RPE細(xì)胞上清中TGF-β2含量上調(diào)。葛根素組較輻射組相比RPE細(xì)胞增殖活性增高，TGF-β2 mRNA表達(dá)降低，RPE細(xì)胞上清中TGF-β2含量下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明葛根素可能部分逆轉(zhuǎn)了ELF-EMFs造成的RPE細(xì)胞的病理改變。這將為葛根素用于防治電磁輻射對(duì)RPE的損傷以及對(duì)近視的可能防治作用提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步探討其具體作用機(jī)制打下良好基礎(chǔ)。

圖4 ELISA檢測(cè)各組RPE細(xì)胞上清中TGF-β2的含量。3組比較，F(xiàn)=714.74，P<0.01；各組兩兩比較，均為P＜0.01（單因素方差分析，LSD法）RPE：視網(wǎng)膜色素上皮TGF-β2：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2

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Effect of puerarin on proliferative activity of human retinal pigment epithelial and transforming growth factor-β2 exposed to extremely low frequency electromagnetic fields

TIAN Tian,ZHU Huang.Ophthalmology Department,Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine,Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092,China

OBJECTIVE To study the effect of puerarin on viability and transforming growth factor-beta 2（TGF-β2）in human retinal pigment epithelium（RPE）exposed to extremely low frequency electromagnetic fields（ELF-EMFs）.METHODS Experimental cells were divided into control group,radiation group and puerarin group. Proliferation rate of RPE cells were quantitated by the cell-counting kit-8 assay.TGF-β2 mRNA and secretion were measured by Real-Time PCR and ELISA analysis,respectively.RESULTS In radiation group,viability of RPE was inhibited and TGF-β2 mRNA expression was increased in contrast with control group.TGF-β2 expression in RPE supernatant was up-regulated significantly.Meanwhile,puerarin at the concentration of 100 μmol/L enhanced the viability of RPE and reduced TGF-β2 mRNA expression when compared with radiation group.TGF-β2 expression in RPE supernatant was down-regulated significantly.CONCLUSIONS ELF-EMFs changed the viability of RPE and also changed the expression and secretion of TGF-β2 in RPE.Puerarin reversed the action to some extent.

puerarin;retinal pigment epithelium;transforming growth factor-beta 2;extremely low frequency electromagnetic fields;myopia

R285

A

1002-4379（2015）06-0388-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.06.002

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金項(xiàng)目（2014JP015A）

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院眼科，上海200092

朱煌，E-mail：drzhuhuang@163.com