饒　丹，嘎利兵嘎，郭小權(quán)，張建峰，張春紅，沈海燕，

朱余軍2，劉志成2 ，孫俊穎2，郭鵬舉2*

(1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045；2.廣東農(nóng)科院動物衛(wèi)生研究所，廣東廣州510640)

HRM分析方法中不同擴增片段、染料和儀器的比較

饒丹1,2，嘎利兵嘎2，郭小權(quán)1*，張建峰2，張春紅2，沈海燕2，

朱余軍2，劉志成2，孫俊穎2，郭鵬舉2*

(1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045；2.廣東農(nóng)科院動物衛(wèi)生研究所，廣東廣州510640)

摘要:高分辨率熔解曲線技術(shù)(High resolution melting,HRM)是近年發(fā)展起來的基于實時熒光定量技術(shù)分析核苷酸突變而進(jìn)行基因分型的一種新型技術(shù)。比較了幾種動物疫病病原(豬瘟病毒、禽白血病病毒、雞艾美耳球蟲株)的不同擴增片段(C202、ALV450、En573和C965)、不同熒光染料(LC Green、SYTO9 和SYBR GreenⅠ)和不同儀器[LightScanner96(Idaho), LightCycler480(Roche)和Rotor-Gene Q(Qiagen)]在HRM基因分型上的異同，揭示了HRM技術(shù)對病原體進(jìn)行分型時，不同擴增片段和不同性質(zhì)熒光染料對其分型結(jié)果影響較大：擁有多個熔解區(qū)間的核酸序列比單獨1個SNP位點特異性高，更適合于分型；核酸相鄰熔解區(qū)間Tm差值影響實際HRM分型結(jié)果；飽和熒光染料(LC Green和SYTO9)比非飽和染料(SYBR GreenⅠ)分辨率更高，更適合用于HRM分析，并且不同濃度熒光染料對Tm值有一定的影響；不同HRM儀器之間HRM結(jié)果無明顯差異。

關(guān)鍵詞:高分辨率熔解曲線；單核苷酸多態(tài)性；熒光染料；熔解Tm；熔解曲線模擬

The Comparison of Amplified Fragments,Different Dyes

高分辨率熔解曲線技術(shù)(HRM)是美國Utah大學(xué)Wittwer等人在2003年首次提出的基于新型飽和熒光染料LC Green的發(fā)明而進(jìn)行基因突變檢測的新技術(shù)[1]。HRM技術(shù)最初應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測分析，HRM-SNP檢測原理是根據(jù)熔解溫度的微弱變化來區(qū)分野生型和純合子突變單堿基差異，根據(jù)熔解曲線的形態(tài)變化來區(qū)分純合子和雜合子之間的單堿基差[2]。由于大多數(shù)病原體尤其病毒核苷酸不存在純合子和雜合子之分，單獨1個SNP位點又往往無法提供足夠多的分型信息。因此，在利用HRM技術(shù)對病原體進(jìn)行分型時,選取合適大小的擴增片段使其含有足夠多的分型所需序列非常關(guān)鍵；如所選取的擴增片段太小，只出現(xiàn)一個熔解峰不利于基因的分型和診斷；而擴增片段太大時，因GC分布不均勻出現(xiàn)多個熔解峰使基因分型復(fù)雜化。目前已有HRM在線模擬軟件可為不同的用戶提供HRM分析服務(wù),利用HRM模擬軟件對所要擴增的目的片段進(jìn)行熔解曲線預(yù)測可極大地提高基因分型的成功率。

在利用HRM技術(shù)對病原體進(jìn)行分型時除了要選取合適大小的目的片段外也要考慮不同儀器設(shè)備和不同熒光染料對分型結(jié)果的影響。目前，用于HRM檢測的儀器主要 LightScanner96/384(Idaho),LightCycler480(Roche)和Rotor-Gene Q(Qiagen)；常用的商品化飽和染料有Eva Green、LC Green和SYTO9等。近年來雖然有文獻(xiàn)報道不同操作平臺間、不同飽和染料間，HRM檢測性能存在一定差異[3-4]，但這些都是關(guān)于不同儀器設(shè)備和不同飽和染料對SNP檢測方面的影響。國內(nèi)尚無有關(guān)HRM在病原體分型方面的比較報告。本文擬利用HRM在線模擬軟件對所擴增目的片段進(jìn)行HRM分型評估，比較不同擴增片段、儀器和熒光染料在HRM病原體分型方面的差異，為HRM技術(shù)在病原基因分型和獸醫(yī)分子診斷方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑樣品與儀器

RNA/DNA提取試劑盒、Premix ExTaq酶、pMD-18T載體、DNA Marker DL 1 000、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV等,購自大連TaKaRa公司；SYBR GreenⅠ、LC Green、SYTO9分別來自Sigama公司、美國Idaho公司、美國Invitrogen公司。主要儀器：Light Scanner96(Idaho)、LightCycler480(Roche)和Rotor-Gene Q(Qiagen)。

豬瘟野毒株和禽白血病毒株(本研究室保存)、艾美耳球蟲株(本單位寄生生物研究室)。

1.2RNA病毒(CSFV和ALV)反轉(zhuǎn)錄

擴增的四個片段中，擴增豬瘟病毒兩個片段(202 bp、965 bp)和禽白血病病毒片段(450 bp)前需用相應(yīng)引物先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。艾美耳球蟲株片段(573 bp)PCR反應(yīng)直接獲得。合成cDNA的反轉(zhuǎn)錄程序是：加有5 μL RNA、1.5 μL下游引物(10 μmol/L)的體系在70 ℃保溫10 min后迅速在冰上急冷2 min以上；在體系中加入5×M-MLV Buffer 2 μL、dNTP(2.5 mmol/L)1 μL、0.25 μL RNase Inhibitor(40 U/μL)和M-MLV(200 U/μL),42 ℃保溫1 h、95 ℃ 5 min。

1.3質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建插入片段大小為202 bp(C202)和965 bp(C965)的豬瘟野毒株片段質(zhì)粒、573 bp(En573)的艾美耳球蟲片段質(zhì)粒和450 bp(ALV450)的禽白血病病毒(ALV450)片段質(zhì)粒，將鑒定為陽性的每份質(zhì)粒樣品送測序(北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序部)。

1.4溶解曲線在線模擬

分別上傳C202、C965、En573和ALV450目的片段序列至HRM在線模擬窗口，預(yù)測每個目的片段熔解曲線形狀和相應(yīng)Tm值(https://www.dna.utah.edu/umelt/um.php)。

1.5不同染料、擴增片段和不同儀器間的HRM比較

本研究選取不同熒光染料(SYBR Green Ⅰ、LC Green和SYTO9)，不同擴增片段(C202、C905、En573和ALV450)和不同儀器(LightScanner 96,LightCycler480和Rotor-Gene Q)來進(jìn)行HRM比較。具體步驟如下：PCR反應(yīng)體系(20 μL)：dH2O 5.4 μL，Premix ExTaq10 μL，分別加相應(yīng)的上游引物F(10 μmol/L)0.8 μL和下游引物R(10 μmol/L)0.8 μL,熒光染料1 μL，cDNA或DNA模板2 μL(濃度已優(yōu)化)。C202 PCR程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃終延伸8 min。En573/ALV450 PCR程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s、54 ℃退火35 s、72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次；72 ℃終延伸8 min。C965 PCR程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s、54 ℃退火35 s、72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃終延伸8 min。SYBR GreenⅠ(Sigma USA)是由Sigma公司生產(chǎn)的10 000×的溶液(DMSO)，LC Green(Idaho USA)提供的是10×的溶液，而SYTO9(Invitrogen USA)為5 mmol/L的溶液(DMSO)。為了使實驗數(shù)據(jù)具有可比性，分別優(yōu)化三種熒光染料濃度使其熒光信號大小一致，即三種熒光染料原液稀釋后在PCR反應(yīng)液的終濃度分別為SYBR GreenⅠ1×、LC Green 0.2×、SYTO9 1.25 μmol/L(濃度表示方式參照說明書)。PCR擴增后將PCR產(chǎn)物移至LightScanner 96(Idaho)儀器進(jìn)行HRM分析。質(zhì)粒樣品ALV450在PCR擴增后依次用LightScanner 96(Idaho),LightCycler480(Roche)和Rotor-Gene Q(Qiagen)儀器進(jìn)行HRM分析，比較不同設(shè)備對實驗結(jié)果的影響。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

M：DL 1 000；1-3：C202(SYBR Green Ⅰ、LC Green、SYTO9)；4-6：En573(SYBR Green Ⅰ、LC Green、SYTO9)；7-9：C965(SYBR Green Ⅰ、LC Green、SYTO9)；10：陰性對照。圖1　加有核酸染料的3種DNA模板的 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis of three different DNA amplicons with the addition of nucleonic acid dye

為了消除非特異性擴增對HRM分析的影響，對每個PCR擴增片段進(jìn)行凝膠電泳分析，如圖1。電泳分析結(jié)果表明，3組片段均擴增出預(yù)期目的片段，無非特異性擴增，良好的PCR擴增為后續(xù)HRM分析提供了保證。

2.2核酸序列熔解曲線模擬結(jié)果

C202、C905、En573和ALV450擴增序列HRM模擬結(jié)果如圖2。HRM模擬圖中，不同序列之間熔解曲線差異明顯；C202具有熔解溫度差值較大的兩個熔解峰，En573、C965和ALV450均有3個熔解峰，其中En573在高溫區(qū)有更高的熔解峰，而ALV450高溫區(qū)熔解峰相對較低。

圖2　4組DNA片段測序序列在線模擬軟件熔解曲線峰型圖Fig.2　Conventional melting curves by online simulation software for sequence of four DNA fragments

2.3不同染料和擴增片段對HRM結(jié)果的影響

研究結(jié)果(圖3)表明加有飽和染料的C202和En573 HRM實驗結(jié)果與理論模擬相似，而加有非飽和染料SYBR GreenⅠ的反應(yīng)體系HRM結(jié)果與理論模擬具有明顯差異，這種差異主要是由SYBR GreenⅠ染料在低溫區(qū)熔解曲線分辨率不高的因素導(dǎo)致。而擴增片段大小為965 bp的片段,無論是在飽和熒光染料還是非飽和熒光染料條件下，其HRM實驗結(jié)果與理論模擬均有差異，即理論模擬時C965序列有3個熔解峰，而實際HRM結(jié)果只有2個熔解峰且第1個峰不明顯。不同熒光染料除了對熔解曲線形狀有影響外,對熔解溫度(Tm值)也有一定的影響。標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線圖(圖3.a1、a2和a3)中，同一樣品分別在3種不同熒光染料下的熔解溫度有微弱變化；使用SYBR GreenⅠ時熔解溫度為最高，其次為LC Green，最低為SYTO9。此外，隨著熒光染料濃度的升高，擴增片段的熔解溫度也有相應(yīng)升高的趨勢。

圖3　C202 、En573和C965 PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線和峰型熔解曲線Fig.3　Normalized and conventional melting curves of PCR amplifications of C202/ En573/ C965

本試驗中用LC Green和SYTO9進(jìn)行比較，兩者都是飽和染料因而更具可比性，擴增模板為En573。如在LC Green不同濃度實驗中染料濃度最高(1×)時其熔解溫度變化最大。在SYTO9不同濃度實驗中，染料濃度最高(5 μmol/L)時其溶解曲線信號與第2濃度(2.5 μmol/L)熒光信號相當(dāng)?shù)玊m值依舊最大，推測是由于染料濃度過高降低了PCR擴增效率使其熒光信號受到影響(圖4)。

圖4　不同熒光染料濃度下熔解曲線的比較Fig.4　The comparison of melting curves under fluorescent dyes with different concentrations

2.4不同儀器對HRM結(jié)果的影響

不同儀器HRM結(jié)果如圖5， LightScanner96(Idaho),LightCycler480(Roche) 和 Rotor-Gene Q(Qiagen)3種不同儀器之間HRM結(jié)果無明顯差別。樣品ALV450在3種不同儀器上均出現(xiàn)兩個熔解峰，其中高溫區(qū)熔解峰明顯變寬。而HRM模擬結(jié)果顯示，ALV450序列在高溫區(qū)有兩個熔解峰(圖2)，表明ALV450序列高溫區(qū)熔解峰的變化可能導(dǎo)致了其HRM理論模擬與實際結(jié)果的不同。

圖5　3種儀器下峰型熔解曲線的比較Fig.5　A comparison of conventional melting curves generated with three HRM analyzers

3討論

近年來隨著附帶HRM檢測功能的 real-time PCR儀的普及，HRM基因分型技術(shù)在分子診斷領(lǐng)域受到普遍的關(guān)注。研究者利用HRM技術(shù)建立了雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性囊病病毒、禽腺病毒和雞毒支原體的 PCR-HRM 檢測方法[5-9]，檢測牛奶樣品中葡萄球菌的PCR-HRM方法[10]，通過對細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行HRM分析建立了快速鑒定奶牛乳房炎病原菌PCR-HRM技術(shù)[11]。與HRM技術(shù)應(yīng)用于單個SNP位點檢測相比，利用HRM技術(shù)對病原體進(jìn)行分型時選取合適大小的擴增片段最為關(guān)鍵。擴增片段過小時，由于只出現(xiàn)單個熔解峰不利于分型，擴增片段過大時由于GC分布不均勻出現(xiàn)多個熔解峰使基因分型復(fù)雜化。為了提高HRM技術(shù)在病原體分型上的成功率，使這一技術(shù)更好應(yīng)用于動物疫病分型及檢測，本文利用HRM在線模擬軟件對所要擴增的目的片段進(jìn)行了熔解曲線預(yù)測。實際擴增片段HRM結(jié)果(如圖3)表明，在線模擬軟件對不同大小擴增片段具有較好的預(yù)測能力。其中片段大小為202 bp和573 bp的兩個片段的HRM結(jié)果與預(yù)測的一致，而片段大小為965 bp時HRM實驗結(jié)果與模擬結(jié)果有一定的差異。從C965 HRM圖上可看出，溶解曲線只出現(xiàn)兩個熔解峰，而不是理論模擬時的3個熔解峰。這種現(xiàn)象可能是由于965 bp序列高溫區(qū)2個熔解峰之間的Tm差值過小所導(dǎo)致。如573 bp序列高溫區(qū)2個熔解峰之間的Tm差值為2.1 ℃，而965 bp序列熔解峰Tm差值只有1.35 ℃(圖2)。為了驗證熔解峰之間Tm值差異會影響實際樣品HRM結(jié)果，本研究設(shè)計了熔解峰Tm差值為1.75 ℃的DNA片段ALV450。實驗結(jié)果顯示，由于ALV450熔解峰Tm差值在1.35～2.1 ℃之間，高溫區(qū)出現(xiàn)了較寬的溶解峰(如圖5)。為了進(jìn)一步排除不同儀器設(shè)備對這一實驗結(jié)果的影響，比較了LightScanner 96(Idaho),LightCycler480(Roche)和Rotor-Gene Q(Qiagen)三種常用的HRM分析儀器對實驗結(jié)果的影響。不同儀器結(jié)果顯示ALV450 HRM結(jié)果在3種儀器之間無明顯差異，如圖5。因此，理論熔解峰之間的Tm差值是影響實際HRM結(jié)果的主要因素。

除了比較擴增片段大小對HRM分型結(jié)果的影響外，本研究分析了3種不同熒光染料(LC Green、SYTO9 和SYBR GreenⅠ)在HRM基因分型結(jié)果上的異同。實驗結(jié)果表明，在熔解曲線形態(tài)變化上飽和熒光染料(LC green和SYTO9)HRM圖形更接近理論模擬圖，而非飽和熒光染料(SYBR GreenⅠ)HRM結(jié)果與理論模擬圖之間有明顯差異(如圖3)；不同熒光染料之間的這種差異是和染料本身特有的性質(zhì)有關(guān)。非飽和染料SYBR GreenⅠ對PCR反應(yīng)存在抑制作用[12-14]，故在實驗中的使用濃度很低，遠(yuǎn)低于將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和的濃度，由于使用濃度未達(dá)到飽和，在DNA雙鏈解鏈的過程中，SYBR GreenⅠ分子會發(fā)生重排，那些從已經(jīng)解鏈的DNA片段上脫離下來的染料分子又與尚未解鏈的雙鏈DNA結(jié)合，造成結(jié)果失真。此外，SYBR GreenⅠ易于GC含量高的雙鏈區(qū)域結(jié)合，從而它對高溫區(qū)具有較高的特異性[15]，而對低溫區(qū)熔解曲線分辨率較差(如圖3)。由于飽和染料如LC green和SYTO9對PCR反應(yīng)抑制作用極低[1,16-17]，在DNA解鏈過程中不會發(fā)生重排，這使得用這些染料的熔解曲線有了更高的分辨率。不同染料對熔解曲線形狀有影響外，對熔解溫度也有一定的影響。如在本研究中，不同染料擴增片段Tm值之間存在差異，使用SYBR GreenⅠ時Tm值最高，其次為LC green，使用SYTO9時Tm值最低，表明不同染料結(jié)合DNA雙鏈能力存在差異。除了染料性質(zhì)對Tm有影響外，染料不同濃度對Tm值的影響也應(yīng)當(dāng)考慮。如在本研究中，隨著染料濃度的升高，Tm值也有相應(yīng)升高的趨勢(如圖4)；這與Paul T、Monis等[18]比較SYTO9和SYBR GreenⅠ染料結(jié)果一致。

本研究利用HRM技術(shù)比較了不同擴增片段、染料和儀器在HRM病原體分型方面的異同。實驗結(jié)果表明，利用HRM技術(shù)對病原體進(jìn)行分型時片段大小和染料性質(zhì)對其影響較高，因此實際應(yīng)用時應(yīng)考慮以下幾點：①擁有多個熔解區(qū)間的核酸序列比單獨1個SNP位點特異性高，更適合于分型(HRM分析推薦片段長度200～600 bp)；②HRM模擬分析可以提高分型成功率，但應(yīng)考慮多個熔解區(qū)間Tm差值對實際結(jié)果的影響，如溶解峰之間的△Tm不宜過小(<1.35 ℃)；③飽和熒光染料之間分型結(jié)果無明顯差異，但不同濃度染料對Tm值影響較大(在適宜范圍內(nèi)隨染料濃度升高，溶解曲線峰Tm值升高；LC Green推薦使用1×濃度以獲得高的信號；SYTO9推薦使用量為2.5 μmol/L)；④不同HRM儀器之間分型結(jié)果無明顯差異，比較的3種儀器[(Light Scanner96(Idaho)、LightCycler480(Roche)和Rotor-Gene Q(Qiagen)]都適合運用于HRM病原體基因分型。

致謝:感謝廣東省農(nóng)科院動物衛(wèi)生研究所生物技術(shù)室提供的研究平臺和技術(shù)指導(dǎo)，嘎利兵博士及老師們提供的實驗幫助。

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and Instruments in the Analysis of HRM

RAO Dan1,2,GALI Bing-ga2,GUO Xiao-quan1*,ZHANG Jian-feng2,

ZHANG Chun-hong2,SHEN Hai-yan2,ZHU Yu-jun2,

LIU Zhi-cheng2,SUN Jun-yin2,GUO Peng-ju2*

(1.College of Animal Science and Technology,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045 China; 2.Laboratory of Veterinary Biotechnology,Institute of Animal Health,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,China)

Abstract:High resolution melting curve(HRM) technology is a new type of technology for genotyping and mutation scanning developing in recent years based on the technology of real-time fluorescence quantitative PCR.This study compared several causative agents of animal diseases,including Classical swine fever virus/Eimeria species/Avain leukemia virus.The effects of different amplified regions of pathogens’ genomes(C202/

ALV450/En573 /C965),different fluorescent dyes(SYBR Green Ⅰ/LC Green /SYTO9)and different instruments(LightScanner96(Idaho)/LightCycler480(Roche)/Rotor-Gene Q(Qiagen)) on the HRM-based genotyping.The experimental data showed that HRM analysis was mainly affected by different amplified fragments and fluorescent dyes with different properties:nucleic acids with multiple melting range had higher specificity than that of single nucleotide polymorphism(SNP)and were more suitable for differentiation analysis; difference inTmon multiple melting range influenced HRM results; saturated fluorescent dyes(LC Green and SYTO9) had higher resolution than unsaturated dye(SYBR GreenⅠ); concentration of fluorescent dye had a greater influence on the value ofTm; there was no significant difference in the HRM results from different PCR-HRM analyzers.

Key words:HRM;SNP;fluorescent dye;melting Tm;imitating melting curve

作者簡介：饒丹(1988—)，女，碩士生，研究方向為獸醫(yī)臨床應(yīng)用分子生物學(xué)，E-mail：raodan2007@126.com；*通信作者：郭小權(quán)，教授，E-mail：xqguo20720@aliyun.com；郭鵬舉，研究員，E-mail：guopengju@hotmail.com。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31260627)、廣東省科技計劃項目(2011B050700007，2012B050500013)、廣東省重大專項(2012A020100001)、廣東省動物防疫專項資金項目(粵農(nóng)計[2013]31號)、江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)對象項目(20122BCB23022)、廣東省科技計劃(星火計劃)項目(2012A020602094)和國家國際科技合作專項(2014DFA31730)

收稿日期：2014-03-19修回日期：2014-11-07

中圖分類號：S854.4+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)01-0169-07