劉　姚，傅凌韻，李　楠，王文君

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江西南昌330045)

青錢柳低聚糖對3T3-L1前脂肪細胞增殖分化及相關(guān)基因表達的影響

劉姚，傅凌韻，李楠，王文君*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江西南昌330045)

摘要:探討青錢柳低聚糖(Cyclocarya paliurus oligosaccharide,CPO)對3T3-L1脂肪細胞增殖分化及相關(guān)基因表達的影響。采用水提醇的方法得到青錢柳初多糖，經(jīng)D301-R大孔吸附樹脂和DEAE纖維素陰離子交換樹脂分離純化，收集CPO作用于3T3-L1前脂肪細胞，并采用Q-PCR測定相關(guān)基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomes proliferator-activated receptor γ,PPARγ)和CAAT/增強子結(jié)合蛋白α(CAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα )mRNA表達。結(jié)果表明:CPO含有2個組分，其重均分子量分別為3 842 Da和1 481 Da；CPO在低濃度時能促進脂肪細胞的增殖，高濃度時能抑制脂肪細胞的增殖；對脂肪細胞分化的影響較小。CPO可抑制PPARγ和C/EBPα mRNA表達，與對照組比較差異有極顯著性意義(P<0.01)。表明高濃度的CPO抑制脂肪細胞增殖分化水平，其機制可能與抑制PPARγ和C/EBPα mRNA表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：青錢柳低聚糖；重均分子量；3T3-L1脂肪細胞；PPARγ；C/EBPα

3T3-L1 細胞屬小鼠源的成纖維細胞系，是前脂肪細胞，經(jīng)特殊的誘導(dǎo)分化劑作用后，可以分化為成熟的脂肪細胞，包括在形態(tài)學(xué)改變、細胞生長、多種脂肪代謝酶的表達，以及脂質(zhì)積累等方面都能充分展示體內(nèi)脂肪細胞的特點，是目前國內(nèi)外進行脂肪細胞功能及糖脂代謝研究中使用最廣泛的細胞株之一[1-2]?？芍炯毎鲋撤只С＃瑢?dǎo)致脂肪組織堆積、脂肪細胞內(nèi)分泌功能紊亂，繼而引起肥胖高脂血癥糖尿病和冠心病等與胰島素抵抗相關(guān)的疾病[3]。

青錢柳 [Cyclocarya paliurus (Batal.)Iljinsk] 系胡桃科青錢柳屬落葉喬木，又稱為青錢李或金錢柳，該屬現(xiàn)僅存一種。前期的研究表明，多糖是青錢柳中一類重要的活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、增強機體免疫力、抗腫瘤、抑菌、抑制非酶糖基化等活性[4-10]。本研究通過觀察CPO對3T3-L1前脂肪細胞增殖及脂肪細胞分化的影響，進一步觀察CPO對脂肪細胞分化過程中2個主要基因PPARγ和C/EBPαmRNA的影響，探討CPO對脂肪代謝的影響機制。

1材料與方法

1.1材料

青錢柳葉子：購于修水縣；小鼠3T3-L1前脂肪細胞購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1青錢柳低聚糖制備稱取干燥的青錢柳葉子，按料液比為1∶10加入水，沸水浸提4 h，提取2次，合并2次提取液，減壓濃縮，按1∶3加入無水乙醇醇沉，醇沉3次，Sevage法除蛋白(3次)，醇沉，透析，減壓濃縮，冷凍干燥，過D301-R大孔吸附樹脂進行初步的純化，透析，冷凍干燥，得青錢柳多糖粉末。取青錢柳多糖粉末用雙蒸水配置溶液，3 000 r/min離心10 min，上清液樣液過DEAE柱，用質(zhì)量分數(shù)為0.3% NaCl進行梯度洗脫，洗脫速度為0.35 mL/min，收集洗脫液，透析，冷凍干燥，備用。

1.2.2青錢柳低聚糖重均分子量的測定采用的是凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)法和多角度極光散射(Multi-angle Laser Light Scattering，MALLS)法測定高聚物的分子量。流動相為0.01 mol/L NaNO2和質(zhì)量分數(shù)為0.02%疊氮化鈉，柱溫為35 ℃，流速為0.6 mL/min，進樣量為20 μL。

1.2.33T3-L1前脂肪細胞的增殖及檢測取對數(shù)生長期3T3-L1前脂肪細胞，用PBS洗2次，胰酶消化后，用含DMEM完全培養(yǎng)液終止消化，離心去上清，再用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為2×104個/mL。以每孔100 μL體積，將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37 ℃ 5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。待細胞完全貼壁良好后(約12～14 h)吸去培養(yǎng)液，換含樣品的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24，48，72 h后[11]，用MTT法進行增殖檢測，每空加入新鮮配制的MTT溶液20 μL，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后吸去孔板中的液體，每空中再加入150 μL DMSO溶劑，輕輕搖晃培養(yǎng)板10 min，使紫色結(jié)晶充分溶解，用酶標儀在540 nm波長處測各孔的OD值(藥物與誘導(dǎo)液和基本培養(yǎng)液同步跟換，以茶堿[12]作為陽性對照)。

1.2.43T3-L1脂肪細胞的分化及檢測取3T3-L1前脂肪細胞以2×104個/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，用含有10 %新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，待細胞融合2 d后，加含有0.5 mmol/L異丁基-甲基-黃嘌呤、0.25 nmol/L地塞米松、1 μg/mL胰島素和10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。換含1 μg/mL胰島素和10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。隨后用高糖DMEM基本培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分化第12天進行油紅O染色，并測定細胞內(nèi)甘油三酯的含量(藥物與誘導(dǎo)液和基本培養(yǎng)液同步跟換，以茶堿作為陽性對照)。

1.2.5相關(guān)基因表達量的檢測誘導(dǎo)分化第4天，收集各實驗組細胞，利用Trizol 提取各實驗組細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，參照http://www.ncbi.nlm.nih.gov提供的小鼠各基因序列，用Primer Expres3.0軟件設(shè)計各基因的引物和探針，并由上海生工合成，引物序列和探針序列如下：GAPDH：FP，5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，RF，5′-CCTGCTTCACCACCTT CTTGA-3′，Probe，F(xiàn)AM-TGCCGCCTGGAGAAACCTGC C-TAMRA，登入序列號為NM_008084.2；PPARγ：FP，5′- ATGATGGGAGAAGATAAAATCAAGTTC -3′，RP，5′-GGATG GCCACCT CTTTGCT-3′，PROBE，F(xiàn)AM-AACATATCACCCCCCTGCAGGAGCA- TAMRA，登入序列號，NM_011146.3；C/EBPα：FP，5′- GCGAGCACGAGACGTCTATAGA-3′，RP，5′- GCCA GGAACTCGTCGTTGAA-3′，Probe，F(xiàn)AM-ATCAGCGCCTACATCGACCCGG-TAMRA，登入序列號，NM_007678.3。10 μL PCR擴增體系：cDNA 1 μL，H2O 3.45 μL，MIX 5 μL，F(xiàn)P/RP 0.2 μL，Probe 0.15 μL，ROXⅡ 0.2 μL。PPARγ 退火溫度為60 ℃，C/EBPα 退火溫度為55 ℃。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用DPS 6.0 統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Means±SD)表示，鄧肯式多重比較。以P<0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

圖1　青錢柳低聚糖示差色譜圖Fig.1　The RI chromatogram of Cyclocarya paliurus oligosaccharide

2.1青錢柳低聚糖重均分子量的測定

經(jīng)凝膠滲透色譜法和多角度極光散射法后，以洗脫體積(mL)為橫坐標，RI (Volts)為縱坐標，CPO的示差色譜圖顯示出現(xiàn)兩個峰，如圖1所示，其分析結(jié)果見表1。青錢柳低聚糖主要含有兩個組分，即青錢柳低聚糖組分 (峰1)和青錢柳多糖組分低聚糖(峰2)，且它們的重均分子量(Mp)分別為3 842 Da和1 481 Da。

表1　青錢柳低聚糖凝膠滲透色譜分析結(jié)果

2.2CPO對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響

CPO不同質(zhì)量濃度作用于3T3-L1前脂肪細胞，24、48、72 h幾個時間段對3T3-L1前脂肪細胞生長的影響表現(xiàn)為增殖趨勢。在低劑量范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，增殖效果明顯，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，實驗結(jié)果見表2。但高劑量的CPO對3T3-L1脂肪細胞的生長具有一定的抑制作用。與對照組相比，CPO濃度為30 μg/mL 多糖顯著促進細胞的增殖，高濃度時均有不同程度的抑制作用。

表2　青錢柳低聚糖對3T3-L1前脂肪細胞增殖作用量效關(guān)系(Means±SD,n=6)

與對照組相比，小寫字母表示顯著差異(P<0.05)，大寫字母表示極顯著差異(P<0.01)。

Small or capital letters in the same column means significant,very significant(P<0.05 orP<0.01) when compared with control group.

2.3CPO對3T3-L1脂肪細胞分化的影響

對誘導(dǎo)分化12 d后的脂肪細胞進行油紅O染色，拍照，如圖 2 所示。前脂肪細胞經(jīng)誘導(dǎo)之后，由纖維狀(圖2A)變成圓形，且在倒置顯微鏡下可清晰地看到脂滴成“指環(huán)狀”排列在細胞膜內(nèi)側(cè)(如圖中箭頭所示)。CPO作用細胞后，細胞裂解液中甘油含量與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)上的差異，如圖3所示。表明CPO對3T3-L1脂肪細胞分化的影響較小。

A：3T3-L1前體脂肪細胞;B：空白對照組;C：茶堿陽性對照組;D：CPO 15 μg/mL;E：CPO 30 μg/mL;F：CPO 60 μg/mL。A:3T3-L1 preadiposyte;B:blank control;C:theophylline positive control;D:CPO 15 μg/mL;E:CPO 30 μg/mL;F:CPO 60 μg/mL.圖2　青錢柳低聚糖對3T3-L1細胞分化后脂肪沉積的影響(油紅O染色)(×400)Fig.2　The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide on the fat deposits of differentiated 3T3-L1 adipocytes (Oil Red O staining) (×400)

圖3　青錢柳低聚糖對3T3-L1脂肪細胞內(nèi)甘油三脂的影響(Means±SD,n=6)Fig.3　The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide on the intracellular triglyceride of 3T3-L1 adipocytes(Means±SD,n=6 )

圖4　青錢柳低聚糖對3T3-L1脂肪細胞內(nèi)PPARγmRNA表達的影響(Means±SD,n=6 )Fig.4　The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide on the expession of PPARγ mRNA of 3T3-L1 adipocytes(Means±SD,n=6 )

2.4CPO對3T3-L1脂肪細胞中PPARγ和C/EBPα表達的影響

圖5　青錢柳低聚糖對3T3-L1脂肪細胞C/EBPα mRNA表達的影響(Means± SD,n=6 )Fig.5　The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide on the expession of C/EBPα mRNA of 3T3-L1 adipocytes(Means±SD,n=6 )

CPO作用于3T3-L1脂肪細胞后，各實驗組細胞中PPARγmRNA的表達量極顯著的降低；與陽性對照組相比，青錢柳低聚糖實驗組中PPARγmRNA的表達量極顯著的降低，如圖4所示。細胞中C/EBPαmRNA的表達量極顯著的降低，與陽性對照組相比，實驗組細胞中C/EBPαmRNA的表達量極顯著下降，如圖5所示。

3討論

在高等真核生物中，白色脂肪組織(WAT)是一個重要的能量貯存器官，調(diào)控著機體內(nèi)的能量平衡：當機體內(nèi)能量過剩時，它就貯存多余的甘油三酯，當機體內(nèi)能量不足時就動員這些甘油三酯。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，過多的WAT會提高肥胖率。在工業(yè)化國家中，肥胖是一個普遍的健康殺手，與一些病理學(xué)疾病密切相關(guān)[13-14]，如：非胰島素依賴型糖尿病、高血壓、癌癥、膽囊疾病、動脈粥樣硬化等。隨著人們健康意識的不斷增強，迫切需要新的有效的方法來控制肥胖。

前體脂肪細胞在生長滯留期和后期分化過程中會伴隨著脂肪細胞基因表達的增加，如：脂肪酸結(jié)合蛋白和脂質(zhì)代謝相關(guān)酶類。脂過氧化物體增殖激活化受體家族(PPARs)、CAAT/增強子結(jié)合蛋白家族(C/EBPs) 是調(diào)控脂肪細胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子的表達與肥胖、高脂血癥等疾病的形成和發(fā)展密切相關(guān)[15]。PPARγ是PPARs家族成員之一，最初被稱為調(diào)節(jié)脂肪特定基因表達和誘導(dǎo)前脂肪細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，其最具脂肪組織特異性，在脂肪細胞分化和脂代謝、胰島素抵抗和糖代謝、炎癥反應(yīng)、酒精肝等中起著重要的作用[16]C/EBP 同源蛋白(C/EBPs)家族有C/EBPα、β、γ等成員，其中C/EBPα在脂肪細胞分化中起著關(guān)鍵性作用，促進PPARα的高表達，保持分化細胞的表型[17]。許多研究表明，C/EBPα與脂肪特異性基因的表達間存在相互作用，如：促進脂肪基因-Glut-4、SCD1、瘦素[18]、422/αP2。

青錢柳多糖是青錢柳的主要有效成分之一，大量研究表明，青錢柳多糖具有降糖降脂的功效。本研究通過對青錢柳多糖進行分離純化，得到CPO，經(jīng)GPC和MALLS法分析之后，其重均分子量(Mp)分別為3 842 Da和1 481 Da，表明得到的青錢柳多糖為低聚糖。通過CPO對3T3-L1脂肪細胞進行干預(yù)實驗，得出CPO在低濃度時能促進脂肪細胞的增殖，高濃度時能抑制脂肪細胞的增殖；細胞裂解液中甘油含量與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)上的差異，表明CPO對脂肪細胞分化的影響較小；與對照組比較，CPO可極顯著抑制PPARγ和C/EBPαmRNA表達。實驗結(jié)果表明，高濃度的CPO抑制脂肪細胞增殖水平，其機制可能與抑制PPARγ和C/EBPαmRNA表達有關(guān)。但體內(nèi)實驗和體外實驗的作用還存在一定的差異，因此進一步研究CPO對脂質(zhì)代謝影響，探討其在體內(nèi)實驗作用機制及其影響因子具有重要的意義。

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Effect ofCyclocaryapaliurusOligosaccharide on Proliferation and

Differentiation of 3T3-L1 Adipocytes and Related Gene Expression

LIU Yao,FU Lin-yun,LI Nan,WANG Wen-jun*

(Key Lab for Agricultural Product Processing and Quality Control of Nanchang City,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide (CPO) on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 adipocytes and the related gene mRNA expression was investigated.CPO was obtained through water solution and alcohol sedimentation,and isolated and purified with D301-R macroporous resins and DEAE cellulose anion exchange resins.The molecular weight was measured with the GPC and MALLS methods.The effect of CPO on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 adipocytes was studied,and the related expression of PPARγ and C/EBPα mRNA were determined by Q-PCR.The results showed that CPO consisted of two different components and their weight-average molecular weights (Mp) were 3 842 Da and 1 481 Da.CPO promoted the proliferation at the low concentration and restrained it at the high concentration.CPO decreased the expression of PPARγ and C/EBPα with significant differences from the control group(P<0.01).The results suggested

that hith-dosaged CPO restrained the proliferation and differentiation of 3T3-L1 adipocytes,which might be related with its inhibiting the expression of PPARγ andC/EBPα.

Key words:Cyclocarya paliurus oligosaccharide；weight-average molecular weight；3T3-L1 adipocyte；PPARγ；C/EBPα

作者簡介：劉姚(1988—)，女，碩士生，主要從事分子營養(yǎng)學(xué)的研究，E-mail：liuyao20063579@126.com；*通信作者：王文君，教授，博士，主要從事分子營養(yǎng)學(xué)的研究，E-mail:wwjun9999@sina.com。

基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(31160319)、江西省高等學(xué)校科技落地計劃項目(KJLD13027)、江西省科技廳科技計劃項目(2009BGA01900)和江西省教育廳科技計劃項目(GJJ13281)

收稿日期：2014-08-19修回日期：2014-10-22

中圖分類號：Q254;Q344+.13

文獻標志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)01-0135-06