馬 航，胡然，鄒宗堯，王德珍，葉小利，李學剛，3，4

（西南大學1．藥學院、2．生命科學學院、3．重慶市藥效評價工程技術研究中心、4．重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶 400716）

黃連生物堿降糖作用研究及構效關系初探

馬 航1，胡然1，鄒宗堯1，王德珍1，葉小利2，李學剛1，3，4

（西南大學1．藥學院、2．生命科學學院、3．重慶市藥效評價工程技術研究中心、4．重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶 400716）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R587．105．31；R977．15

摘要：目的 研究黃連治療糖尿病的物質基礎。方法 考察了黃連生物堿（小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿和藥根堿）對自發(fā)性糖尿病小鼠KK-Ay的降糖活性。結果 連續(xù)給予生物堿（225 mg·kg－1·d－1，灌胃）40 d后，小檗堿和黃連堿能明顯降低小鼠空腹血糖值并改善糖耐量；表小檗堿控制體重增長作用最強；小檗堿減緩了胰島素（INS）抵抗；藥根堿明顯提高肝臟超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低丙二醛（MDA）水平。結論 黃連生物堿中起降糖作用的主要是小檗堿和黃連堿，巴馬汀、表小檗堿和藥根堿在治療糖尿病方面發(fā)揮不同的協(xié)同作用。推測生物堿母核中A環(huán)C2、C3位的亞甲二氧基和D環(huán)C9、C10位的甲氧基同時存在時，降糖作用最強。

關鍵詞：黃連生物堿；糖尿?。籏K-Ay小鼠；氧化應激；糖耐量；胰島素

網絡出版時間：2015－10－16 9：52 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．038．html

黃連（Coptidis Rhizoma，RC）用于治療消渴癥已有上千年的歷史（數千年來糖尿病在中國被稱為消渴病），主要活性成分為小檗堿，此外尚含豐富的黃連堿、巴馬汀、表小檗堿和藥根堿［1］，并作為2010年版《中國藥典》黃連含量測定的標準［2］（藥根堿除外）。其中小檗堿降糖活性明顯，被認為是黃連降糖活性成分［3］。近幾年研究報道，黃連煎劑降糖效果優(yōu)于小檗堿［4］，說明黃連除小檗堿外，還有其它成分在發(fā)揮降糖作用，因此，需進一步研究尋找黃連治療糖尿病的更多有效成分。

黃連生物堿具有相同的二苯并［a，g］喹嗪環(huán)母核，差異表現在A環(huán)C2、C3位，D環(huán)C9、C10的取代基［5］，同屬于異喹啉類生物堿（結構式見Fig 1）。研究表明，黃連生物堿具有相似的調節(jié)血脂、抗氧化、抑制醛糖還原酶等藥理活性［6－9］，預示5種生物堿具有相近的藥理作用。此外，文獻還報道黃連堿胃黏膜保護作用強于小檗堿［10］，而小檗堿清除自由基能力不如藥根堿［11］，說明5種生物堿的藥理作用存在差異。有關5種生物堿治療糖尿病的報道很少，因此，有必要評價5種生物堿的降糖作用，研究其治療糖尿病的特點。

結合小檗堿降糖作用機制［12－13］，以及黃連堿、巴馬汀、表小檗堿和藥根堿藥理作用研究現狀，我們以空腹血糖值、糖耐量、血清胰島素水平及抗氧化指標評價5種生物堿對2型糖尿病的降糖作用，并初

步探討生物堿降糖作用與結構的關系。

Fig 1 Chemical structure of berberine，coptisine，palmatine，epiberberine and jatrorrhizine

1　材料與方法

1．1動物 KK-Ay小鼠（KK／UPJ-Ay／J），♂，8周齡，體質量（40±5）g，購自北京華阜康生物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2009－0004。KK-Ay小鼠高脂飼料購自北京華阜康生物技術有限公司。

1．2儀器 Elx808型臺式酶標儀（Bio-Tek有限公司），UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司），Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），Auanti J-301高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司），血糖儀（長沙三諾生物傳感技術有限公司）。

1．3藥品與試劑 小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿（純度＞0.95）由西南大學藥學院黃連研究課題組提供；鹽酸二甲雙胍片購自北京中慧藥業(yè)有限公司（批號：20120510）；SOD試劑盒（批號：20121217）、MDA測試盒（批號：20121217）購自南京建成生物工程有限公司；BCA蛋白定量測定試劑盒（批號：27F00750）購自北京鼎國生物技術有限公司；胰島素（INS）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號：130100801）購自北京博奧森生物技術有限公司。

1．4實驗動物分組 KK-Ay小鼠自由飲食、飲水2周后，空腹12 h，尾靜脈取血，測定血糖值。根據血糖值和體重，將KK-Ay小鼠隨機分為7組：高糖空白對照組（CON）、陽性藥物二甲雙胍組（MET）、小檗堿組（BBR）、黃連堿組（COP）、巴馬汀組（PAL）、表小檗堿組（EPI）和藥根堿組（JAT），每組6只，單籠喂養(yǎng)。每天分別灌胃給藥225 mg·kg－1，試驗周期為40 d。每10天記錄1次空腹血糖值和體重變化，實驗的d 18、36分別進行糖耐量實驗。

1．5糖耐量實驗（OGTT） 小鼠連續(xù)灌胃給藥18 d后，空腹12 h，稱重，按每天的灌胃劑量給小鼠灌胃藥物，30 min后，給小鼠口服2 g·kg－1的葡萄糖溶液，尾靜脈取血，分別測定0、30、60、90、120 min時的血糖值。小鼠連續(xù)灌胃給藥36 d后，重復1次糖耐量實驗。

1．6血清胰島素，肝臟SOD、MDA含量測定 連續(xù)灌胃40 d后，小鼠空腹12 h，稱重，從小鼠眼眶后靜脈取血，室溫下放置20 min，離心（4℃，1800×g，15 min），取血清，按照試劑盒說明測定胰島素含量（FINS）。胰島素敏感指數計算公式：胰島素敏感指數（ISI）＝Ln［1／（空腹血糖×空腹胰島素）］，其中血糖單位為mmol·L－1，胰島素單位為IU·L－1。

小鼠脫頸處死后，剖取肝臟，用生理鹽水沖洗表面血跡，濾紙吸干。稱取肝臟200.0 mg，加入生理鹽水2.0 mL，冰浴條件下，機械勻漿2 min，離心（4℃，3 600×g，15min），取上清液，按BCA蛋白法測定肝臟中蛋白質含量，然后測定組織中SOD酶活力和MDA含量，酶活力以組織中每毫克蛋白當量計算。

2　結果

2．1KK-Ay小鼠體重變化 Fig 2為各實驗組KK-Ay小鼠體重增量的變化圖。結果顯示，給藥期間，除表小檗堿組外，各組小鼠的體重均保持比較平穩(wěn)的增長趨勢，增長趨勢藥物組小于對照組。表小檗堿組體重增量與對照組相比，d 20時差異有顯著性，d 30時差異有顯著性；黃連堿組在d 40時達到差異顯著性。實驗結束后，與d 0相比，對照組、二甲雙胍組、小檗堿組、黃連堿組、巴馬汀組、藥根堿組的體重分別增加11.8%、6.2%、2.9%、5.7%、8.6%和6.7%。

Fig 2 Effects of five RC alkaloids on body weight gain（±s，n＝6）

2．2KK-Ay小鼠的空腹血糖值變化 各實驗組對KK-Ay小鼠空腹血糖值（FBG）的影響見Fig 3。5種生物堿中小檗堿降糖作用最強，與二甲雙胍相當，黃連堿作用次之。從d 30開始，小檗堿組和黃連堿組小鼠空腹血糖值與對照組相比，差異有顯著性。實驗結束時，二甲雙胍組、小檗堿組、黃連堿組、巴馬汀組、表小檗堿組和藥根堿組的空腹血糖值與d 0相比，分別降低了46.5%、42.3%、36.5%、26.3%、

31.4%、23.2%，對照組升高了6.8%。5種生物堿的降血糖作用：小檗堿＞黃連堿＞表小檗堿＞巴馬?。舅幐鶋A。

Fig 3 Effects of days′oral administration of five RC alkaloids on FBG level（±s，n＝6）

2．3KK-Ay小鼠的糖耐量變化 Fig 4中，A圖為d 18進行的糖耐量實驗結果，從圖中可以看出，各組小鼠餐后血糖在30 min時達到最高，30 min之后，血糖開始下降，120 min后，餐后血糖值仍未恢復到正常水平。從30 min時的餐后血糖值可以看出，經過18 d的連續(xù)給藥，小檗堿組KK-Ay小鼠對葡萄糖的耐受程度與空白組相比，差異有顯著性，黃連堿對KK-Ay小鼠的耐受程度有一定的改善。

B圖為d 36進行的糖耐量實驗結果，0 min時陽性對照組、小檗堿組和黃連堿組的餐后血糖與對照組相比，差異有顯著性，說明經過36 d的連續(xù)給藥后，小檗堿和黃連堿對KK-Ay小鼠糖耐量的改善作用增加。30 min時的餐后血糖值表明，表小檗堿對KK-Ay小鼠糖耐量的改善作用也趨于明顯，巴馬汀和藥根堿的改善作用不明顯。

2．4血清胰島素和胰島素敏感指數 黃連生物堿對KK-Ay小鼠空腹血清胰島素水平的影響見Tab 1。給藥40 d后，各組KK-Ay小鼠血清胰島素含量都比空白組低，胰島素敏感指數提高。與對照組相比，小檗堿組的胰島素含量降低最明顯，達到了48.1%，且敏感指數升高了18.6%。

Tab 1 FBG，FINS and ISI levels in each group（±s）

Tab 1 FBG，FINS and ISI levels in each group（±s）

*P＜0．05 vs diabetic control group

Group　FBG level／mmol·L－1　FINS／IU·L－1ISI CON　15．60±0．65　56．61±3．27　－6．78±－0．75 MET　7．81±0．47　38．75±3．13?。?．71±－0．39 BBR　8．47±0．35　29．37±2．69　?。?．52±－0．06*COP　9．28±0．46　36．37±2．14?。?．83±－0．02 PAL　10．83±0．62　33．35±3．08　－5．98±－0．65 EPI　10．01±0．48　41．70±2．64?。?．03±－0．24 JAT　11．23±0．52　45．70±3．64?。?．24±－0．64

Fig 4 Oral glucose tolerance tests in diabetic KK-Ay mice（±s，n＝6）

Tab 2 Levels of SOD and MDA in liver（±s）

Tab 2 Levels of SOD and MDA in liver（±s）

*P＜0．05 vs diabetic control group

Group　SOD／kU·g－1Pro　MDA／kU·g－1Pro CON　5．13±0．7　4．80±0．6 MET　5．76±1．1　4．02±0．5 BBR　6．81±0．6　3．53±0．8 COP　5．57±0．5　3．05±0．3*PAL　5．48±0．9　3．86±0．8 BPI　6．23±10．7　3．60±0．7 JAT　7．61±0．8　3．47±0．4*

2．5肝臟SOD、MDA含量 BCA法測定的蛋白質在0～1.4 g·L－1范圍內線性良好，線性方程為：Y＝0.487X＋0.255（R2＝0.993），各組肝臟中蛋白質含量未列出。肝臟中SOD酶活性是反映機體抗氧化能力的指標之一，MDA的含量反映機體臟器的受損程度，臟器的受損程度又與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生有關。從Tab 2中看出，5種生物堿都能提高KK-Ay

小鼠SOD酶活性，降低MDA含量，藥根堿、小檗堿組與空白組相比，差異有顯著性，抗氧化能力：藥根堿＞小檗堿＞黃連堿。

3　討論

胰島素抵抗是2型糖尿病的一個重要發(fā)病機制，與糖尿病脂代謝紊亂、胰島β細胞損傷、胰島功能衰竭存在密切關系［14］。據文獻報道，PI3K途徑是胰島素信號轉導的主要通路之一，胰島素刺激包括脂肪和骨骼肌在內的靶組織攝取利用葡萄糖是通過胰島素受體（InsR）→胰島素受體底物-1（IRS-1）→磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）→葡萄糖糖轉運蛋白（GLUT4）等一系列信號轉導過程完成的［15］。在此信號轉導過程中，任意一環(huán)節(jié)出現障礙，均可引起胰島素抵抗，從而導致2型糖尿病?？崭寡侵凳窃u價降血糖藥物療效的重要指標，而糖耐量實驗則是臨床上診斷糖尿病的一種輔助手段［16］。氧化應激與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生密切相關，其作用十分復雜，除直接損傷胰島β細胞外，還可作為信號分子激活一些應激敏感通路，調節(jié)相關因子的表達，引起β細胞凋亡或壞死，抑制胰島素分泌，誘發(fā)胰島素抵抗，最終引發(fā)或加重糖尿?。?7］。氧化應激是引發(fā)糖尿病慢性并發(fā)癥的主要原因之一。MDA是反映體內氧化應激狀態(tài)較可靠、穩(wěn)定的指標，MDA含量可反映機體脂質過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度。SOD為抗氧化系統(tǒng)的主要成分，在氧化－抗氧化平衡中起重要作用［18］。

本研究中采用的KK-Ay小鼠是經典的2型糖尿病動物模型，其模擬了人類2型糖尿病的發(fā)病進程，8周齡時出現肥胖、高血糖、高胰島素、葡萄糖耐受不良等癥狀。實驗結果顯示，連續(xù)給藥40 d后，表小檗堿和黃連堿能有效控制糖尿病小鼠的體重增加，減輕KK-Ay小鼠肥胖癥狀；小檗堿和黃連堿明顯降低空腹血糖值并改善糖耐量；小檗堿降低小鼠空腹血清胰島素水平，小鼠胰島素抵抗指數明顯升高，胰島素敏感指數明顯降低；5種生物堿均能提高肝臟SOD酶活力，降低MDA含量。實驗結果顯示，黃連生物堿中起降糖作用的主要是小檗堿和黃連堿，巴馬汀、表小檗堿和藥根堿在治療糖尿病方面發(fā)揮不同的作用，對黃連的降糖具有輔助作用，其中藥根堿的抗氧化作用可能與預防糖尿病并發(fā)癥有關，這些因素的綜合結果可能是黃連煎劑對糖尿病的治療效果優(yōu)于小檗堿的原因。

5種生物堿的結構差異表現在A環(huán)C2、C3位，D環(huán)C9、C10的取代基（亞甲二氧基、甲氧基或酚羥基）。Diculescu等［19］報道，小檗堿的氧化電位實驗中，在施加外電壓時，小檗堿C2、C3位上的亞甲二氧基團性質活潑，易發(fā)生氧化反應，生產兩個亞甲基。Bian等［20］研究表明，小檗堿結構中C2、C3位的亞甲二氧基是小檗堿與β細胞膜結合的必不可少的部位，當亞甲二氧基環(huán)被氧化打開后，小檗堿與β細胞膜的結合作用消失。更多文獻顯示［21－22］，生物堿分子結構中A和D環(huán)中的取代基是生物堿表現抑制醛糖還原酶、ONOO的損傷作用及清除自由基的關鍵基團。本研究結果證明小檗堿和黃連堿是主要降糖生物堿，小檗堿作用強于黃連堿，從結構式中可以看出，只有小檗堿和黃連堿C2、C3位上有亞甲二氧基，黃連堿C9、C10位上為亞甲二氧基，小檗堿則氧化為兩個甲氧基，推測生物堿母核中A環(huán)C2、C3位的亞甲二氧基和D環(huán)C9、C10位的甲氧基同時存在時，降糖作用最強，可能與亞甲二氧基的氧化性有關，其潛在的機制還有待進一步研究驗證。

（致謝：本實驗完成于西南大學藥學院黃連研究課題組，作者在實驗過程中得到了導師李學剛教授和葉小利教授的技術指導，以及所有同門的大力支持，在此表示感謝。）

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Preliminary evaluation of antihyperglycemic effect of Rhizoma Coptidis alkaloids and their structure-activity relationships

MA Hang1，HU Yin-ran1，ZOU Zong-yao1，WANG De-zhen1，YE Xiao-li2，LI Xue-gang1，3，4
（1．School of Pharmacy，2．School of Life Science，3．Chongqing Engineering Research Center for Pharmacodynamics Evaluation，4．Chongqing Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control，Southwest University，Chongqing 400716，China）

Abstract：Aim To find the material foundation of treatment for diabetes in Coptidis Rhizoma（RC）．Methods The antihyperglycemic effect of RC alka-loids（berberine，coptisine，palmatine，epiberberine，and jatrorrhizine）was evaluated in spontaneity diabe-tes KK-Ay mice．Results After 40 days′oral admin-istration（225 mg·kg－1·d－1，ig），berberine and coptisine significantly suppressed the elevated fasting blood glucose level and ameliorated the glucose toler-ance．Body weight gain of KK-Ay mice was significant-ly decreased in the epiberberine-treated group．Berber-ine improved insulin resistance and jatrorrhizine in- creased the SOD activity，decreased the MDA level．Conclusions These results indicate that the main an-tihypoglycemic effect constituents are berberine and coptisine，while they show different mechanisms．Pal-matine，epiberberine and jatrorrhizine display different potential roles in the treatment of diabetes．The meth-ylene-dioxy groups at the C-2，C-3，C-9 and C-10 po-sitions are indispensable for antihyperglycemic effect of RC alkaloids．

Key words：Rhizoma Coptidis alkaloid；diabetes；KK-Ay mice；oxidative stress；glucose tolerance；insulin

作者簡介：馬 航（1993－），男，碩士生，研究方向：中藥藥理學，E-mail：20116806＠cqu．edu．cn；李學剛（1964－），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：天然產物的開發(fā)利用及其藥理作用，通訊作者，Tel／Fax：023-68250728，E-mail：xuegangli＠swu．edu．cn

基金項目：科技部十二五科技支撐計劃項目（No 2011BAI13B02-1）；2013年重慶市“百名工程技術高端人才培養(yǎng)計劃”；教育部博士點基金（No 20130182110023）；西南大學校地合作基金（No Sz201312、Sz201401）

收稿日期：2015－08－07，修回日期：2015－09－07

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1575－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．019