孟 強(qiáng)，王薪淇，宋軼群，趙仁貴

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

糯玉米自交系中游離氨基酸的組成及含量分析

孟 強(qiáng)，王薪淇，宋軼群，趙仁貴

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

【目的】 研究糯玉米自交系中游離氨基酸的組成及含量，對(duì)糯玉米種質(zhì)資源的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)?！痉椒ā?采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定了60份糯玉米自交系籽粒的游離氨基酸組成及含量，并采用主成分分析法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)?！窘Y(jié)果】 從60份糯玉米自交系中共檢測(cè)出16種氨基酸，最少的檢測(cè)出14種氨基酸，其中JN57的氨基酸總量最高(25.165 mg/g)，JN21的氨基酸總量最低(6.403 mg/g)，平均為12.236 mg/g，含量高于平均值的有25份。人體必需氨基酸(EAA)含量在2.47～13.97 mg/g，占游離氨基酸總量的 29.43%～75.52%。對(duì)60份糯玉米自交系所含的16種氨基酸進(jìn)行主成分分析及綜合評(píng)價(jià)，得分值在前3位的依次為JN57、JN59和JN55。【結(jié)論】 60份糯玉米自交系的游離氨基酸含量具有明顯的遺傳多樣性，其中JN57、JN59及JN55的品質(zhì)較優(yōu)，JN21的品質(zhì)最差。

糯玉米；自交系；游離氨基酸；HPLC；種質(zhì)資源

由于糯玉米鮮食口感好而且營(yíng)養(yǎng)豐富，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，鮮食糯玉米的需求量迅速增長(zhǎng)，在我國(guó)已發(fā)展成為一項(xiàng)新興產(chǎn)業(yè)[1]。中國(guó)是糯玉米的起源地，地方種質(zhì)資源豐富[2]，大量研究表明，鮮食糯玉米具有良好的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，使其作為主食谷物的可行性增強(qiáng)[3]，進(jìn)而掀起了糯玉米育種的熱潮。糯玉米種質(zhì)資源是糯玉米新品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)，在育種工作中占有舉足輕重的地位。

游離氨基酸(FAA) 中包含多種人類不能合成的必需氨基酸和呈味氨基酸，是評(píng)價(jià)食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[4]。玉米籽粒中氨基酸的含量和組成，也是決定其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)[5]。王敏等[6]測(cè)定了玉米漿中游離氨基酸的含量，證明能夠用HPLC法來(lái)測(cè)定玉米中游離氨基酸含量；郝小琴等[7]測(cè)定了鮮食甜糯玉米籽粒的氨基酸含量，為糯玉米的品質(zhì)育種提供了參考。但關(guān)于糯玉米自交系中游離氨基酸含量的研究報(bào)道目前尚不多見(jiàn)。

我國(guó)雖然已育成了一批鮮食糯玉米新品種，但是審定的糯玉米品種大多數(shù)只是達(dá)到了審定要求，而品質(zhì)優(yōu)良者不多，通過(guò)對(duì)國(guó)家區(qū)域試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告的分析可以看出，提高糯玉米食用品質(zhì)是我國(guó)當(dāng)前鮮食糯玉米育種的主要任務(wù)[8]。因此，不斷挖掘糯玉米種質(zhì)資源，正確評(píng)價(jià)與利用糯玉米自交系，培育優(yōu)良糯玉米新品種，是當(dāng)前玉米育種亟待解決的問(wèn)題。本試驗(yàn)采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，檢測(cè)了60份糯玉米自交系中游離氨基酸的組成及含量，通過(guò)分析評(píng)價(jià)糯玉米自交系的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)，篩選出具有優(yōu)良品質(zhì)的糯玉米自交系，以為培育品質(zhì)優(yōu)良的糯玉米新品種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材 料 試驗(yàn)材料為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)特用玉米育種課題組選育的60份糯玉米自交系。選取自然風(fēng)干、灌漿良好且無(wú)病蟲害的玉米自交系果穗中部籽粒20粒，置40 ℃烘箱中烘干24 h，將其用谷物籽粒粉碎機(jī)粉碎成粉末，混勻過(guò)孔徑0.28 mm標(biāo)準(zhǔn)篩后裝入密封袋備用[9]。

1.1.2 試 劑 乙醇、冰乙酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、鄰苯二甲醛(OPA)、巰基乙醇等，均為國(guó)產(chǎn)分析純；乙腈和甲醇(美國(guó)Sigma)為色譜純；超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備(美國(guó)Millipore)。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex U3000 HPLC高效液相色譜系統(tǒng)(配DGP-3600泵、WPS-3000 自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3100自動(dòng)控溫柱箱、DAD-3000檢測(cè)器和變色龍色譜工作站)、AUW220電子天平(日本島津)、HWS-26 電熱恒溫水浴鍋(上海)、KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山)、Sigma3-30k 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma)。

1.3 方 法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm，i.d.)；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm；流速：1 mL/min。流動(dòng)相A：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=45∶45∶10；流動(dòng)相B：10 mmol/L、pH7.5的磷酸二氫鈉。洗脫程序：0 min，100%B；10 min，82%B；15 min，76%B；21 min，59%B；23 min，57.8%B；25 min，42%B；27 min，41%B；31 min，100%B。

1.3.2 在線衍生化 用自動(dòng)進(jìn)樣針吸取5.0 μL pH 9.5的硼酸緩沖液，再吸取1.0 μL的OPA，洗針1次，再吸取2.0 μL樣品，洗針1次，原位混合8次，等待90 s進(jìn)樣。

1.3.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱取0.3 g樣品，用一定體積比的溶劑(純水)研磨后裝入試管中，分別于室溫超聲振蕩30 min，離心(12 000 r/min，10 min)后濾渣重新超聲提取1次。合并2次上清液，0.22 μm尼龍微孔濾膜過(guò)濾后保存于-20 ℃冰箱中，用于HPLC分析。

1.3.4 定性與定量分析 根據(jù)16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，對(duì)樣品中的氨基酸種類進(jìn)行定性；根據(jù)各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)樣品中的氨基酸進(jìn)行定量分析，以氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，求得 16 種氨基酸的線性方程，采用面積歸一化法計(jì)算測(cè)試樣品的游離氨基酸含量。

1.3.5 分析軟件和指標(biāo)計(jì)算公式 利用SPSS 20分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

I=a1y1+a2y2+…+amym。

式中：I為樣品的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)，am為主成分Ym的方差貢獻(xiàn)率，ym為各樣品的各主成分分值。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖及其回歸分析

在選定的色譜條件下，以一系列不同質(zhì)量濃度的16 種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣，得到游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(圖1)，以峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x(μg/mL)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到16種氨基酸的線性方程(表1)，并以此作為定量依據(jù)。表1結(jié)果表明，各方程在所檢測(cè)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.998 9。

2.2 糯玉米自交系游離氨基酸的組成及變異度

不同糯玉米自交系中游離氨基酸經(jīng)OPA在線衍生化，HPLC分離檢測(cè)，得出色譜峰圖(圖2)。定性分析結(jié)果顯示：不同糯玉米自交系中共檢測(cè)出16種游離氨基酸，包括7種必需氨基酸，9種非必需氨基酸。游離氨基酸含量檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示：60份糯玉米自交系中最少的檢測(cè)出14種氨基酸；JN57的氨基酸總量最高，為25.165 mg/g；JN21的氨基酸總量最低，為6.403 mg/g；平均為12.236 mg/g，含量高于平均值的有25份。在供試樣品的游離氨基酸組成中，Asp、Glu、Ser和Tyr含量較高，這4種氨基酸總量在3.193～19.591 mg/g ，占游離氨基酸總量的30.98%～79.72%。Thr的含量極低，在大部分樣品中未檢測(cè)出。

各游離氨基酸在不同糯玉米自交系中含量變幅大，為0.000～8.727 mg/g(表3)，其中Thr、Ala變異度較大，變異系數(shù)大于100%；Arg、Cys、Val、Asp、Tyr、Ser、Met、Lys居中，變異系數(shù)在50%～100%；Glu、Gly、His、Leu、Phe、Ile的變異度較小，變異系數(shù)小于50%。不同來(lái)源的糯玉米自交系中，游離氨基酸的種類和含量存在顯著差異。

2.3 糯玉米自交系游離氨基酸的含量分析

人體(或其他脊椎動(dòng)物)不能合成或合成速度遠(yuǎn)不適應(yīng)機(jī)體的需要，必須由食物蛋白供給的氨基酸稱為必需氨基酸(EAA)，包括Ile、Leu、Lys、Thr、Val、Phe、Met。糯玉米自交系中人體必需氨基酸含量在2.47～13.97 mg/g，占游離氨基酸總量的 29.43%～75.52%，平均含量5.85 mg/g(表2)。不同糯玉米自交系中各必需氨基酸的含量不同，Ile和Met含量最高的是JN59，Leu含量最高的是JN55，Lys、Thr、Val和Phe含量最高的均是JN58。人體雖然能夠合成His和Arg，但通常不能滿足正常的需要，因此，又被稱為半必需氨基酸或條件必需氨基酸，在幼兒生長(zhǎng)期這2種是必需氨基酸。糯玉米自交系中兒童必需氨基酸含量為0～2.09 mg/g，占游離氨基酸總量的0～13.91%，平均含量0.98 mg/g。His含量最高的是JN36，Arg含量最高的是JN16。人(或其他脊椎動(dòng)物)自己能由簡(jiǎn)單的前體合成，不需要從食物中獲得的氨基酸稱為非必需氨基酸。糯玉米自交系中非必需氨基酸含量在2.83～14.27 mg/g。

注：(1)▲必需氨基酸，△非必需氨基酸，★兒童必需氨基酸，■鮮味氨基酸，◆甜味氨基酸，●芳香族氨基酸；(2)-.未檢測(cè)到；(3)TAA.氨基酸總量；(4)呈味氨基酸(DAA)=■+◆+●；(5)E/T.必需氨基酸總量占氨基酸總量的百分比，CE/T.兒童氨基酸總量占氨基酸總量的百分比，DAA/T.呈味氨基酸總量占氨基酸總量的百分比。

Note:(1)▲Essential amino acids (E)，△Non-essential amino acids(N)，★Children essential amino acids(CE)，■Flavor amino acids，◆Sweet amino acids，●Aromatic amino acids；(2)-.Not detected；(3)TAA.Total amino acids；(4)Delicious amino acids ( DAA )=■+◆+●；(5)E/T.Ratio of total essential amino acids，CE/T.Ratio of total children essential amino acids，DAA/T.Ratio of total delicious amino acids.

食物中因富含一些呈味氨基酸，食用時(shí)極易擴(kuò)散，可與口腔內(nèi)多種味覺(jué)受體作用，故能讓人感到食物的美味。鮮味氨基酸包括Glu和Asp，甜味氨基酸包括Ala、Gly、Ser，芳香族氨基酸包括Tyr和Phe。鮮食糯玉米的口感非常重要，其含有的呈味氨基酸起到重要作用。由表2可以看出：糯玉米自交系中鮮味氨基酸含量為0.875～9.607 mg/g，占游離氨基酸總量的5.97%～47.36%，平均含量 3.25 mg/g；甜味氨基酸含量為0.724～4.228 mg/g，占游離氨基酸總量的4.85%～30.72%，平均含量1.85 mg/g；芳香族氨基酸含量為0.772～9.377 mg/g，占游離氨基酸總量的8.49%～48.16%，平均含量3.23 mg/g。

2.4 主成分分析及綜合評(píng)價(jià)

選取檢測(cè)到的糯玉米自交系16種游離氨基酸的含量數(shù)據(jù)，利用SPSS 20分析軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，16個(gè)主成分代表了全部原始信息的100%，其中第1主成分(PC1 51.649%)、第2主成分(PC2 20.177%)、第3主成分(PC3 12.386%)包含了全部原始信息的84.212%，通常認(rèn)為可以代表大部分原始信息[10]，因此提取前3個(gè)主成分。第1主成分主要包括8個(gè)指標(biāo)：PC1=0.465 Gly+0.608 Ala+0.994 Tyr+0.765 Met+0.492 Phe+0.596 Ile+0.470 Leu+0.609 Lys；第2主成分主要包括2個(gè)指標(biāo)：PC2=0.759 Asp+0.866 Glu；第3主成分主要包括1個(gè)指標(biāo)：PC3=0.876 Ser。采用主成分分析進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)時(shí)，可以選取m個(gè)主成分，即Y1，Y2，…，Ym，以每個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，構(gòu)造綜合評(píng)價(jià)指數(shù)，計(jì)算出每個(gè)樣品品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)后，按照指數(shù)的大小排序，可以得出每個(gè)樣品的綜合品質(zhì)名次，通常綜合指數(shù)越大，綜合品質(zhì)就越好[11]。孫立軍等[12]通過(guò)這種方法對(duì)蘋果的品質(zhì)做了綜合評(píng)判。本研究根據(jù)抽取的3個(gè)主成分，計(jì)算了不同糯玉米自交系的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)大于1的自交系有3個(gè)，分別是JN57、JN59和JN55，表明這3個(gè)糯玉米自交系游離氨基酸的綜合評(píng)價(jià)最好。JN21的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)最小，說(shuō)明其游離氨基酸的主成分含量偏低。

3 討 論

隨著人們生活水平的不斷提高，鮮食糯玉米的選育越來(lái)越關(guān)注營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)，而品種選育的基礎(chǔ)是種質(zhì)資源?？掠琅嗟萚13]研究發(fā)現(xiàn)，玉米氨基酸性狀的遺傳呈現(xiàn)以下規(guī)律：異亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)和甘氨酸(Gly)含量主要受加性基因效應(yīng)影響，賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)和天冬氨酸(Asp)含量受加性效應(yīng)和非加性效應(yīng)同等影響，其余10種氨基酸含量主要受非加性效應(yīng)影響；廣義遺傳力較高的有苯丙氨酸(Phe)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)，而狹義遺傳力相對(duì)較高的為纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)和甘氨酸(Gly)，絲氨酸(Ser)的狹義遺傳力最低。本研究檢測(cè)了60份糯玉米自交系游離氨基酸的組成及其含量，結(jié)果表明Asp、Glu、Ser和Tyr含量顯著，各游離氨基酸在不同糯玉米自交系中含量變幅大，其中Thr、Ala變異度較大，變異系數(shù)大于100%；Glu、Gly、His、Leu、Phe、Ile的變異度較小，變異系數(shù)小于50%。不同來(lái)源的糯玉米自交系中，游離氨基酸的種類和含量存在顯著差異，必需氨基酸含量在2.47～13.97 mg/g，占游離氨基酸總量的29.43%～75.52%；鮮味氨基酸含量為 0.875～9.607 mg/g，占游離氨基酸總量的 5.97%～47.36%；甜味氨基酸含量為0.724～4.228 mg/g，占游離氨基酸總量的4.85%～30.72%；芳香族氨基酸含量為0.772～9.377 mg/g，占游離氨基酸總量的8.49%～48.16%。根據(jù)前人研究的游離氨基酸遺傳規(guī)律，育種者可以有目的地選擇某種游離氨基酸含量高的自交系作為親本，培育出某種氨基酸含量高的新品種。祁新等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，如果要提高玉米籽粒的賴氨酸含量，雙親的賴氨酸含量都要高；要提高蛋氨酸含量，親本自交系的蛋氨酸含量差異不宜過(guò)大，最好都是高含量的；只要親本選配得當(dāng)，就能提高玉米籽粒中的某種或幾種氨基酸的含量。

對(duì)60份糯玉米自交系中的16種游離氨基酸含量進(jìn)行主成分分析和綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明JN57、JN59、JN55的得分較高，而這3個(gè)自交系中各種游離氨基酸含量及總量均較高，與綜合評(píng)分結(jié)果相符，表明這3個(gè)自交系的綜合營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)較優(yōu)。JN21樣品的綜合評(píng)分最低，也與其游離氨基酸含量最低相符合，說(shuō)明該自交系的氨基酸品質(zhì)不佳。目前在鮮食糯玉米育種過(guò)程中，通常是將組配出的雜交組合種植后進(jìn)行果穗品嘗鑒定，在自交系階段的鑒定較少，同時(shí)人工品嘗鑒定除了食品本身品質(zhì)的因素外，還與品嘗人的喜好有關(guān)，人為誤差較大[15]，這導(dǎo)致糯玉米品種的遺傳改良方向性不強(qiáng)。通過(guò)對(duì)自交系呈味氨基酸的測(cè)定和分析，在一定程度上對(duì)自交系的食味品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，再與人工品嘗鑒定結(jié)果相結(jié)合，能夠顯著提高糯玉米品質(zhì)育種的工作效率。

4 結(jié) 論

1)在糯玉米自交系中共檢測(cè)出16種游離氨基酸，其中7種為必需氨基酸，9種為非必需氨基酸，最少的檢測(cè)出14種氨基酸，有10種氨基酸的變異系數(shù)大于50%。各自交系游離氨基酸總含量的變異幅度為6.403～25.165 mg/g，具有明顯的遺傳多樣性。

2)糯玉米自交系中呈味氨基酸含量豐富，其中，鮮味氨基酸含量占游離氨基酸總量的5.97%～47.36%，甜味氨基酸含量占游離氨基酸總量的4.85%～30.72%，芳香族氨基酸含量占游離氨基酸總量的8.49%～48.16%。說(shuō)明各自交系的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)存在較大差異。

3)利用主成分分析法對(duì)60份自交系進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，構(gòu)造出綜合評(píng)價(jià)指數(shù)，高于平均得分的共有23份自交系，其余自交系與平均值相接近，其中JN57、JN59、JN55自交系得分突出。

4)綜合糯玉米自交系中的游離氨基酸總含量、必需氨基酸含量、呈味氨基酸含量以及主成分綜合評(píng)價(jià)指數(shù)得分進(jìn)行評(píng)價(jià)，JN57、JN59和JN55的品質(zhì)較優(yōu)，JN21的品質(zhì)最差。

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Composition and content analysis of free amino acids in waxy maize inbred lines

MENG Qiang,WANG Xin-qi,SONG Yi-qun,ZHAO Ren-gui

(CollegeofAgriculture,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study aimed to analyze the components and contents of free amino acids in waxy maize inbred lines and evaluate the nutritional quality of germplasm resources.【Method】 An effective reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) after pre-column derivatization with o-phthaladehyde (OPA) was used to determine the components and contents of free amino acids in 60 waxy maize inbred lines and principal component analysis was conducted for comprehensive evaluation.【Result】 A total of 16 (with the minimum of 14) free amino acids were detected from the 60 inbred lines.JN57 had the highest total content of 25.165 mg/g while JN21 had the lowest of 6.403 mg/g.The average content was 12.236 mg/g and 25 samples exceeded the average.The contents of essential amino acids (EAA) varied from 2.47 to 13.97 mg/g,accounting for 29.43%-75.52% of total free amino acids.Principal component analysis showed that first three inbred lines with the highest scores were JN57,JN59,and JN55.【Conclusion】 The contents of free amino acids in 60 waxy maize inbred lines showed clear genetic diversity.JN57,JN59 and JN55 had the best quality while JN21 had the worst.

waxy maize;inbred line;free amino acids;HPLC;germplasm resources

2013-11-12

吉林省財(cái)政廳項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)多抗特用玉米雜交種的選育”(2012002)；長(zhǎng)春市科技局項(xiàng)目“特用玉米新品種選育及高產(chǎn)栽培技術(shù)研究”(2011215)

孟 強(qiáng)(1988-)，男，山東鄒城人，在讀碩士，主要從事作物重要性狀遺傳規(guī)律研究。E-mail：zcmengq@163.com

趙仁貴(1966-)，男，吉林前郭人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事特用玉米遺傳規(guī)律和新品種選育研究。 E-mail：zhaorengui@sina.com

時(shí)間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.004

S513.3

A

1671-9387(2015)03-0091-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.004.html