楊 欣,曾興建,付 娟

蛇床子素對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用及機制研究

楊 欣,曾興建,付 娟*

目的 探討蛇床子素(Osthole，Ost)對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的急性肺損傷的作用及其機制。方法 45只雄性C57小鼠隨機分為3組：正常對照組(對照組)，LPS組，Ost+LPS組(Ost組)，每組15只。各組小鼠于腹腔注射LPS或生理鹽水(50 mg/kg)6 h后，測定PaO2、PaCO2、pH，IL-6、IL-1β、TNF-α表達，JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達量，觀察肺組織病理變化和濕干比(W/D)。結果 與LPS組比較，Ost組PaCO2、W/D，IL-6、IL-1β和TNF-α表達，p-JAK2和p-STAT3蛋白表達量和肺組織病理改變均明顯降低，但PaO2和pH增高，而JAK2和STAT3表達無明顯變化。結論 Ost預處理可通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活而減輕LPS誘導的急性肺損傷。

蛇床子素；脂多糖；急性肺損傷；炎癥；JAK2/STAT3

0 引言

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)及其發(fā)展到嚴重階段的急性呼吸窘迫綜合征是由嚴重創(chuàng)傷、燒傷、感染等肺內外疾病誘發(fā)的以肺細胞彌漫性損傷為主要表現(xiàn)的全身性炎癥反應，是臨床上常見的急性危重癥，嚴重威脅人類健康[1-2]。蛇床子素(Ost)是一類從傘行植物中分離出來的天然豆香化合物，研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的藥理生物學治療作用，如抗炎、抗腫瘤、抗過敏等[3-5]。而炎癥是急性肺損傷重要發(fā)病機制之一[1,6]。本實驗利用脂多糖構建小鼠急性肺損傷模型，探討Ost對急性肺損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 蛇床子素(純度98%，西安易樂)，LPS(Sigma：美國)，3%戊巴比妥鈉(谷歌生物，武漢)，JAK2(CST，美國)，p-JAK2(CST，美國)，p-STAT3(CST，美國)，STAT3(CST，美國)，β-actin(abcom，美國)。TRIzol reagent(Invitrogen,美國)，逆轉錄試劑盒(GeneCopoeia，美國),SYBR green(Takara，日本)，IL-6、IL-1β和TNF-α RT-PCR引物(擎科生物技術有限公司,序列見表1)，IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒購自于eBscience，HE試劑由三峽大學醫(yī)學院病理實驗室配制。紫外分光光度計(Thermo fisher)、逆轉錄儀(Eppendorf),RT-PCR儀(BIO-RAD IQ5)、顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)由三峽大學醫(yī)學院病理科實驗室臨床病理組提供。

1.2 實驗動物及分組 45只雄性健康C57小鼠，體重20～25 g，SPF級，購自北京華富康實驗動物中心，質量合格證號：410703012，飼養(yǎng)于三峽大學醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號：HYXK(鄂)20130257，設施使用證明號：013451。適應性喂養(yǎng)1周后，狀態(tài)良好，小鼠隨機分為正常對照組(對照組)、脂多糖組(LPS組)和Ost+脂多糖組(Ost組)，每組15只。Ost組于LPS注射前連續(xù)給予Ost(40 mg/kg)4 d灌胃，LPS組給予LPS(50 mg/kg)腹腔注射，對照組腹腔注射生理鹽水，劑量參考文獻[7]。

1.3 標本收集和血氣與濕干比檢測 各組小鼠在LPS或生理鹽水注射后6 h，在3%戊巴比妥鈉局麻下行腹主動脈取血，取1 mL做血氣分析，其余室溫下3 000 r/min離心10 min后取上清液。開胸取左肺，用PBS沖洗2次，濾紙吸干表面血水后稱定濕重，然后將其置80 ℃烘烤約48 h至恒重后稱定干重，計算肺濕重/干重比(W/D)。W/D代表肺含水量，評定肺水腫。右肺1/3放入中性甲醛溶液，其余2/3肺組織凍于-80 ℃冰箱。

1.4 肺臟病理檢測 置于中性甲醛溶液的右肺固定24 h后，70%乙醇脫水、修塊、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察并評分[7]。0分(沒有損傷)；1分(輕度損傷)：間質水腫和局限性壞死；2分(中度損傷)：廣泛的肺臟細胞腫脹和壞死；3分(嚴重損傷)：有血管濃縮和肺臟萎縮和壞死；4分(極嚴重損傷)：彌漫性血管濃縮，出血和肺臟壞死。

1.5 Western blot分析 提取肺組織蛋白，采用BCA法進行定量，取60 μg樣品進行SDS-PAGE分析，電泳結束后立即電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入目標一抗JAK2(1∶2 000)、p-JAK2(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶500)、β-actin(1∶3 000)單抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應HRP標記的二抗室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光，暗室顯影，掃描膠片，進行灰度分析。

1.6 Western印跡檢測 取肺組織于精微天平稱重，按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液(以1∶50加入50×cocktail)，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質的上樣量，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(5%濃縮膠，10%分離膠，恒壓80～100 V)后轉膜(PVDF膜，恒流300 mA)，然后洗膜，以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h、JAK2(1∶2 000)、p-JAK2(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶500)、β-actin(1∶3 000)單抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，Kodak化學發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白，并拍照。以Quantity one對條帶進行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結果。

1.7 實時定量PCR(RT-PCR)檢測IL-6、TNF-α和IL-1β 稱取100 μg肺組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計測量濃度，逆轉錄以及擴增反應按試劑盒說明書進行。以管家基因β-actin作為內參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計算相對表達量。結果見表1。

表1 實時定量PCR檢測的引物序列

1.8 ELISA檢測血清IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測收集的血清上清液中IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平。

2 結果

2.1 Ost預處理對肺組織結構的影響 LPS刺激6 h后，與對照組比較，LPS組小鼠肺部有大量炎性細胞浸潤(中性粒細胞和巨噬細胞)，肺組織間隙可見大量紅細胞滲出及肺泡壁增厚，彌漫性毛細血管擴張、充血伴灶性肺泡內出血，血管周圍出現(xiàn)富含蛋白的水腫液形成水腫套。Ost組與LPS組比較，炎癥細胞浸潤、紅細胞滲出及肺泡壁增厚、毛細血管充血擴張、充血及水腫明顯減少。顯示Ost預處理可以明顯減少LPS對肺臟組織結構的損傷。見圖1。

圖1 對內毒素誘發(fā)的急性肺損傷病理結構影響(HE染色，200×)

2.2 Ost對急性肺損傷小鼠肺濕重/干重比(W/D)的影響 LPS刺激6 h后，LPS組與對照組比較，肺W/D值明顯增加(P<0.01)，提示急性肺水腫明顯加重；與LPS組比較，Ost組W/D明顯降低(P<0.05)，提示Ost預處理能有效地減輕LPS引起的小鼠急性肺水腫。見圖2。

圖2 Ost對LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺W/D的影響

2.3 Ost對LPS誘導的ALI小鼠血氣的影響 與對照組比較，LPS組PaCO2明顯增加，PaO2和pH值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Ost組PaCO2明顯低于LPS組，而PaO2、pH值明顯高于LPS組。結果顯示Ost預處理可以明顯降低LPS誘發(fā)的血氣改變。見圖3。

圖3 Ost對LPS誘發(fā)的ALI小鼠的血氣改變的影響

2.4 Ost預處理對JAK2/STAT3信號通路的影響 WB檢測顯示，LPS組與對照組比較，p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，但JAK2和STAT3表達水平差異無統(tǒng)計學意義。Ost組與LPS組比較，p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，但JAK2和STAT3表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，顯示Ost預處理可以抑制LPS誘發(fā)的JAK2/STAT3信號通路激活，見圖4、圖5。

圖4 WB檢測Ost預處理對JAK2蛋白表達的影響

圖5 WB檢測Ost預處理對STAT3蛋白表達的影響

2.5 Ost預處理對促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達的影響 RT-PCR檢測顯示，LPS組與對照組比較，TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平明顯提高，但Ost預處理后，Ost組與對照組比較，TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平明顯降低。顯示Ost預處理可以減少LPS誘發(fā)的促炎癥細胞因子的表達。見圖6。

2.6 Ost預處理對促炎癥細胞因子分泌的影響 ELISA檢測顯示，LPS組與對照組比較，TNF-α、IL-6和IL-1β分泌水平明顯增加，Ost組與急性肺損傷組比較，TNF-α、IL-6和IL-1β分泌水平明顯降低。顯示Ost預處理可以抑制LPS誘發(fā)的促炎癥細胞因子的分泌。見圖7。

圖6 RT-PCR檢測Ost預處理對促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達的影響

圖7 ELISA檢測Ost預處理對促炎癥細胞因子分泌的影響

3 討論

急性肺損傷及其繼發(fā)的急性呼吸窘迫綜合征是一種失控的級聯(lián)式炎癥反應，肺血管內皮細胞和上皮細胞彌漫性廣泛損傷，進而引起肺功能嚴重受損，甚至多器官功能損害，誘發(fā)多器官功能衰竭，嚴重影響健康[1-2]。其治療方法有限且不良反應較多[1-2]，因此迫切需要尋找相關的治療藥物。

Ost又名歐芹酚甲醚，為傘形科一年生草本植物蛇床的果實。最近研究發(fā)現(xiàn)，Ost具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗凋亡、抗腫瘤的功效[3-6]。而炎癥是急性肺損傷重要的發(fā)病機制[3-5]。

本實驗利用LPS誘導小鼠急性肺損傷，急性肺損傷的小鼠組可見大量炎性細胞浸潤(中性粒細胞和巨噬細胞)，肺組織間隙可見大量紅細胞滲出及肺泡壁增厚，彌漫性毛細血管擴張、充血伴灶性肺泡內出血，血管周圍出現(xiàn)富含蛋白的水腫液形成水腫套，PaCO2、W/D明顯升高，PaO2、pH明顯降低，促炎癥細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達明顯增加。而Ost組炎癥細胞浸潤，紅細胞滲出及肺泡壁增厚，毛細血管充血擴張，PaCO2明顯降低，而PaO2、pH明顯升高，W/D明顯升高，促炎癥細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達明顯減少，顯示Ost預處理可通過抑制促炎癥因子信號通路的激活而減輕急性肺損傷。

JAK2/STAT3信號通路是經典的信號通路，在炎癥調節(jié)過程中起重要作用[8-9]。實驗證實，急性肺損傷能夠激活JAK2/STAT3信號通路，Ost預處理可以抑制JAK2/STAT3激活，因此推測Ost可通過抑制JAK2/STAT3信號通路而減輕促炎癥反應，進而減輕急性肺損傷。但在急性肺損傷中，除抑制JAK2/STAT3信號通路外，Ost是否還可作用于其他信號通路有待進一步研究。

本研究表明，Ost預處理可以減輕LPS引起的急性肺損傷，為臨床預防治療急性肺損傷提供了新的新思路。

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Protective effect of osthole on LPS-induced acute lung injury in mice and its mechanism

YANG Xin,ZENG Xing-jian,FU Juan*

(Yichang Second People′s Hospital,Hubei 443000)

Objective To investigate the protective effect of osthole (Ost) on LPS-induced acute lung injury in mice and its mechanism.Methods 45 male C57 mice were randomly divided into three groups:control group (control),LPS group(LPS),andosthole+LPS group (Ost).PaO2,PaCO2and pH,the expression of pro-inflammatory cytokines IL-6,IL-1β and TNF-α in lung tissue and serum,the protein level of JAK2,STAT3,p-JAK2 and p-STAT3 in lung tissue,the pathological change and Wet/Dry after 6 h of LPS or saline injection of the mice were examined.Results Compared with LPS group,PaCO2and Wet/Dry,the expression of pro-inflammatory cytokines IL-6,IL-1β and TNF-α in lung tissue and serum,the protein level of JAK2,STAT3,p-JAK2 and p-STAT3 in lung tissue and the pathological changes in lung tissues significantly decreased,and PaCO2,pH and Wet/Dry increased.Moreover,the protein expression level of JAK2 and STAT3 had no significant difference.Conclusion Ost pretreatment can protect mice against LPS-induced acute liver injury by suppressing JAK2/STAT3 signal pathway.

Osthole;LPS;Acute lung injury;Inflammation;JAK2/STAT3

2015-01-21

宜昌市第二人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443000

宜昌市科學基金(A11301-38)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508004

*通信作者