李 昕，董有靜，張曉寧

布比卡因注射致大鼠脊髓損傷模型的制作

李 昕1，董有靜2a*，張曉寧2b

目的 建立動物模型觀察脊髓損傷后的病理生理改變，尋找可直接判斷脊髓損傷程度的方法，優(yōu)選出治療脊髓損傷的最佳方案。方法 暴露大鼠L2-3脊髓后，于脊髓內(nèi)注射0.5%布比卡因，評價大鼠行為學(xué)改變及脊髓形態(tài)學(xué)改變。觀察并記錄大鼠后肢行為學(xué)改變及脊髓神經(jīng)元和周圍組織的病理改變，評估脊髓損傷程度。結(jié)果 與生理鹽水注射組(對照組)相比，布比卡因注射組(觀察組)大鼠脊髓損傷，表現(xiàn)為術(shù)后大鼠BBB評分降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，病理HE染色可見脊髓神經(jīng)元出現(xiàn)空泡變性及液化壞死。結(jié)論 應(yīng)用腰麻針進(jìn)行大鼠脊髓穿刺并注射布比卡因的大鼠動物模型，具有穩(wěn)定可控的脊髓損傷效果。

局麻藥；脊髓損傷；腰硬聯(lián)合麻醉；動物模型

0 引言

腰麻聯(lián)合硬膜外麻醉(Combined spinal and epidural anesthesia，CSEA)起效迅速,鎮(zhèn)痛完善,效果確切,肌肉松弛良好,近年來已廣泛應(yīng)用于婦科、產(chǎn)科、普外科、骨科、泌尿科、腎移植等下腹部及下肢手術(shù)。但麻醉效果得到改善的同時,并發(fā)癥也相對增多，腰硬聯(lián)合麻醉及腰麻的脊髓損傷是至今尚未充分研究的一種潛在的嚴(yán)重并發(fā)癥。神經(jīng)內(nèi)穿刺注射藥物可引起神經(jīng)損傷[1-2]。損傷主要是由于穿刺針、導(dǎo)管或藥物對脊髓的直接物理損傷或化學(xué)刺激。目前，局麻藥注射致動物脊髓損傷模型的制備鮮有報道。Allen等[3]于1911年開始使用的脊髓撞擊傷模型及Sheng等[4]、Uchida等[5]制備的壓迫性頸髓損傷模型無法用來研究該種損傷。只有在相同的動物實驗條件下，才能研究局麻藥對損傷脊髓毒性可能機制。此種脊髓損傷模型的制備，對于臨床研究穿刺過程中出現(xiàn)的損傷的診斷以及后續(xù)治療、預(yù)后的研究有重要意義。因此，本研究通過建立動物模型觀察損傷后病理生理改變，找出可靠、靈敏、可直接判斷脊髓損傷程度的方法，優(yōu)選治療脊髓損傷的最佳方案，為相關(guān)診斷及治療工作的開展提供保障。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體重為180～220 g的SD大鼠24只(中國醫(yī)科大學(xué))隨機分為2組。對照組：手術(shù)不給藥組；觀察組：脊髓布比卡因注射組。每組12只。分別在手術(shù)前及手術(shù)后1、4、8、15 d進(jìn)行行為學(xué)測試，后肢行為學(xué)評分采用改良的BBB分級評分后處死大鼠并取材。

1.2 實驗試劑及材料 0.9%氯化鈉注射液、0.5%布比卡因、100 g/L水合氯醛、4%多聚甲醛、青霉素、大鼠手術(shù)器械、微量注射器等。

1.3 手術(shù) 大鼠腹腔注射100 g/L的水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉大鼠，腹腔麻醉后取俯臥位，腰部墊高，四肢及頭部固定，將其背部剃毛消毒后鋪洞巾，約在腰2～3棘突處作一長約2 cm縱行切口，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離棘突兩側(cè)肌肉及腰2～3棘突間韌帶，打開黃韌帶暴露脊髓，垂直插入22 G腰麻針，向脊髓注藥，藥物為0.5%布比卡因4 μL。注射器使用微量注射器。脊髓給藥時，以大鼠出現(xiàn)尾動為有效穿刺損傷，5 s內(nèi)完成給藥并拔出針頭。劑量選擇：參考臨床CSEA布比卡因注射劑量，200 g大鼠CSEA用0.5%布比卡因4 μL。注意事項：術(shù)后護(hù)理，每天給大鼠人工排尿3～4次。術(shù)后大鼠出現(xiàn)自食行為，可能增加感染及死亡率。

1.4 行為學(xué)測試 行為學(xué)測試分別在手術(shù)前及手術(shù)后1、4、8、15 d進(jìn)行，使用方法為BBB評分法，該法分級較細(xì)致，幾乎包括了SCI后大鼠后肢恢復(fù)過程中所有行為學(xué)變化，且與脊髓損傷的程度高度相符。該法主要是將動物置于環(huán)形封閉金屬殼內(nèi)，兩個觀察者對側(cè)站立觀察大鼠后肢運動功能變化，觀察期為5 min，觀察者依照評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。依據(jù)布比卡因注射時的尾動判斷注射的有效性及完整性。

1.5 取材 大鼠在行為學(xué)測試后水合氯醛麻醉下處死大鼠，在術(shù)后4、15 d以L2-3(給藥點)為中心取長約0.8 cm脊髓。4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，橫向切成5 μm厚的切片，HE染色。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 各組大鼠術(shù)畢行生理鹽水1 mL腹腔內(nèi)注射，以補充失血量。穿刺及藥物損傷可引起大鼠脊髓出現(xiàn)不同程度的充血。實驗期間觀察組大鼠中有1只因全脊髓麻醉呼吸抑制缺氧死亡，死亡率為8.3%，對照組無死亡。

2.2 大鼠行為學(xué)改變 術(shù)后8 h，所有大鼠均完全清醒，觀察組1、4、7、15 d時，BBB評分與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著時間的推移，對照組運動恢復(fù)快，對照組術(shù)后1 d與15 d BBB評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明手術(shù)并沒有給大鼠帶來脊髓神經(jīng)損傷。觀察組運動恢復(fù)慢，1、4、7、15 d時，BBB評分與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 術(shù)后各個時間點兩組大鼠行為學(xué)評分(BBB評分)

注：與對照組比較，*P<0.05；與15 d時比較，#P<0.05

2.3 脊髓形態(tài)學(xué)改變 HE染色切片可見，局麻藥注射致大鼠脊髓損傷時，物理損傷及化學(xué)損傷同時存在。見圖1、圖2。

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔阻滯及腰硬聯(lián)合阻滯能保持患者清醒，麻醉恢復(fù)平穩(wěn)，且易于術(shù)后鎮(zhèn)痛，因此，椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯是臨床上常采用的麻醉方法之一。Dusanka等[6]研究發(fā)現(xiàn)，早期臨床椎管內(nèi)應(yīng)用局麻藥(鹽酸氯普魯卡因、阿替卡因、丙胺卡因)引起的一過性神經(jīng)綜合征的發(fā)生率比利多卡因低。研究發(fā)現(xiàn)，椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯后，出現(xiàn)神經(jīng)并發(fā)癥的發(fā)生率為1/1 000～1/1 000 000,由此一線工作者對椎管內(nèi)應(yīng)用局部麻醉藥的安全性產(chǎn)生質(zhì)疑。臨床研究的結(jié)果提示：椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯并發(fā)癥高于硬膜外阻滯，其中一過性神經(jīng)綜合征的發(fā)生率明顯升高。引起這些并發(fā)癥的原因有局麻藥化學(xué)損傷、直接穿刺或留置導(dǎo)管對神經(jīng)的損傷、脊髓缺血、感染等，其中最重要的原因包括脊髓直接穿刺損傷和局麻藥物毒性作用。

圖1 對照組脊髓HE染色

局麻藥有不可逆的神經(jīng)毒性作用。Kitagawa等[7]研究發(fā)現(xiàn)，局麻藥表面活性分子在高濃度時聚集比例提高，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不可逆性破壞。Puljak等[8]發(fā)現(xiàn)，將2.0%利多卡因注射到大鼠L4-5脊髓處后出現(xiàn)了痛覺過敏，由于衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的活化與聚集，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了炎癥反應(yīng)。然而，化學(xué)結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致局麻藥有不同程度的神經(jīng)毒性。Radwan等[9]體外培養(yǎng)雞胚脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Dorsal root ganglion neurons，DRG)，發(fā)現(xiàn)利多卡因、布比卡因、甲哌卡因，羅哌卡因均可使生長中的圓錐萎縮、生長中的神經(jīng)突起退化，并且這種損傷不可被高濃度神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)逆轉(zhuǎn)，提示甲哌卡因的安全性優(yōu)于利多卡因和布比卡因。局麻藥的神經(jīng)毒性與其濃度呈正相關(guān)，Wang等[10]通過分析患者視覺模擬評分，比較不同濃度布比卡因、羅哌卡因及左旋布比卡因在分娩時的麻醉效果，提示相較于局麻藥的種類，其濃度對于麻醉效果的影響更大。本研究參考臨床CSEA布比卡因注射劑量，用0.5%布比卡因作為實驗藥物，旨在指導(dǎo)臨床常規(guī)用藥損傷后的診斷及治療。

圖2 觀察組術(shù)后4 d脊髓HE染色

本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠術(shù)后1、15 d的BBB評分與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明手術(shù)本身沒有給大鼠脊髓造成確切損傷，術(shù)后護(hù)理妥善，手術(shù)損傷恢復(fù)良好，手術(shù)及術(shù)后沒有加重原有損傷。觀察組運動恢復(fù)較慢，術(shù)后1、4、7、15 d的BBB評分與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明大鼠脊髓損傷確實存在；術(shù)后1d的BBB評分值最低，隨著時間延長，組織機體自行損傷修復(fù)，術(shù)后15 d的BBB評分值高于術(shù)后1 d，但仍未恢復(fù)到術(shù)前水平，說明沒有干預(yù)措施的自行損傷修復(fù)并不能恢復(fù)至術(shù)前水平。

由圖2A可見，觀察組脊髓HE染色切片上可見血管內(nèi)皮受損，紅細(xì)胞進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，出血灶邊緣可見神經(jīng)元細(xì)胞空泡變性；圖2 B顯示出血灶邊緣出現(xiàn)大面積脊髓組織液化壞死；低倍鏡下亦可見脊髓炎性壞死灶及出血壞死帶。以上均證實脊髓損傷確切存在。本研究旨在建立損傷模型，因此未確切分辨損傷原因，推測損傷可能是穿刺針直接損傷、局麻藥本身的神經(jīng)毒性抑或是液體脊髓內(nèi)注射所產(chǎn)生的壓力所致，具體機制還需后續(xù)相關(guān)研究討論說明。

胡慶生在 1923 年 5 月 18 省教育會所作《公共圖書室之需要》的演講中講到: “凡私人捐建之圖書館在歐美甚多，如美國鋼鐵大王康內(nèi)基能以獨立創(chuàng)建大規(guī)模之圖書館，鄙人亦甚愿我國之有康內(nèi)基其人也”。3 胡慶生．公共圖書室之需要[J]．浙江公立圖書館年報,1922(8) : 50.

本文研究局麻藥所致的脊髓損傷模型建立所采用的方法及觀察指標(biāo)均借鑒了傳統(tǒng)的脊髓損傷模型建立過程，觀察組與對照組大鼠術(shù)后的BBB評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，證明了該模型的可信性，但與實驗室技術(shù)成熟的脊髓撞擊傷模型和脊髓橫斷傷模型相比，大鼠的BBB評分及脊髓損傷表現(xiàn)存在顯著差異，可能是由于藥物種類的選擇不妥、劑量不足、手術(shù)方法有待改善以及各種可能出現(xiàn)的選擇性偏倚等。

綜上所述，由于脊髓損傷臨床發(fā)生率較低，故臨床研究受到了極大限制，又因為神經(jīng)損傷的嚴(yán)重性，預(yù)防診斷及治療不容忽視。本研究應(yīng)用腰麻針進(jìn)行大鼠脊髓穿刺并注射布比卡因，引起脊髓損傷，與對照組相比具有明顯的脊髓損傷效果。以大鼠作為脊髓穿刺損傷的動物模型重復(fù)性好、可控性強，與臨床行椎管內(nèi)阻滯時脊髓穿刺損傷過程相近。本研究為了解臨床椎管內(nèi)穿刺損傷脊髓后的病理生理改變及進(jìn)一步研究損傷后藥物治療和臨床預(yù)防神經(jīng)損傷的發(fā)生提供了良好的基礎(chǔ)。

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Establishment of rats model of spinal cord injury by injection of bupivacaine

LI Xin1,DONG You-jing2a*,ZHANG Xiao-ning2b

(1.Department of Anesthesiology,Liaoning Provincial Tumor Hospital,Shenyang 110042,China;2.a.Department of Anesthesiology,b.Department of Sports Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To observe the pathophysiological changes after spinal cord injury by establishing the animal model,and to find the method that can directly determine the extent of spinal cord injury and optimize the best treatment for the injury.Methods After the exposure of the L2-3spinal cord of each rat,0.5% bupivacaine was injected,and the changes in behavior and morphology were evaluated.The behavior changes of each rat′s hind limb and the histopathological changes of spinal cord neurons and the surrounding were observed and recorded to provide a evaluation of the degree of SCI.Results The spinal cord injury in rats of bupivacaine group was more serious compared with that of control group,the BBB score of postoperative rats in bupivacaine group was lower than that of control group,and the pathological HE staining of spinal cord neurons in bupivacaine group appeared empty degeneration and liquefaction necrosis.Conclusion The model of rats that received spinal needle puncture and injected with bupivacaine has a more stable and controllable effects on spinal cord injury.

Local anesthetics;Spinal cord injury;Combined spinal and epidural anesthesia;Animal models

2014-11-30

1.遼寧省腫瘤醫(yī)院麻醉科，沈陽 110042；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院a.麻醉科，b.運動醫(yī)學(xué)科，沈陽 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201508003